專利名稱:一種檢測黃病毒屬病毒的codehop rt-pcr試劑及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及黃病毒的檢測技術，具體涉及ー種檢測黃病毒屬病毒的C0DEH0PRT-PCR試劑及方法。
背景技術：
黃熱病毒屬病毒(Flavivirus)簡稱黃病毒,是黃病毒科的最大家族，已知由70多種病毒構成，其中40多種病毒與人類疾病相關，包括登革病毒(DENV)、こ型腦炎病毒(JEV)、蜱傳腦炎病毒(TBEV)、西尼羅病毒(WNV)、Kujun病毒(KUN)、圣路易斯腦炎病毒和黃熱病毒(YFV)等，其中大多數(shù)為蟲媒病毒。近年來，以登革熱病毒、日本腦炎病毒(こ型腦炎病毒)以及西尼羅病毒等為代表的黃病毒疫源地的不斷擴大，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。現(xiàn)有病原體檢測技術體系和方法大多為単一病原的常規(guī)檢測技術，如公開號為CN101629215A的發(fā)明專利申請，就公開了檢測こ型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒 的多重試劑盒，利用各自的特異性引物對上述3種病毒進行檢測。也有如授權公告號為CN100557027C的發(fā)明專利，公開了檢測日本腦炎病毒血清群成員(JEV、WNV、圣路易斯腦炎病毒、KUN和河谷腦炎病毒)的試劑盒和方法，該試劑盒針對也僅是日本腦炎病毒血清群成員的試劑，不能檢測出黃熱病毒和蜱傳腦炎病毒等其它的黃病毒屬病毒。C0DEH0P RT-PCR技術是ー種可用于未知病原體檢測的新技術，該技術依據(jù)病毒家族共有的保守蛋白氨基酸序列，通過專業(yè)軟件，設計特定引物。當懷疑ー種未知病原體為某病毒或細菌家族的成員，或ー個未知基因是某基因家族成員時，可以用該技術進行驗證。目前尚未有應用該技術對黃病毒屬病毒群進行檢測的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種檢測黃病毒屬病毒的C0DEH0P RT-PCR試劑及方法，該檢測試劑和方法為黃病毒屬病毒通用檢測試劑和檢測方法。
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種檢測黃病毒屬病毒的C0DEH0P RT-PCR試劑，包括10XPCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTP液、Taq酶液、上游引物溶液和下游引物溶液，所述上游引物溶液含有核苷酸序列為AATGTATGCA GATGATACAG Caggntgggayac的引物BI，所述下游引物溶液含有核苷酸序列為TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartcrtcncc的引物B2 ;其中r為嘌呤,可以是g或a, y為喃唳,可以是c或tAi，η是任何堿基，可以是g或a或c或t/u或其它。
利用上述試劑具體檢測黃病毒屬病毒的方法的步驟如下
a、RNA提取用RNA提取試劑盒(購自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說明書進行；
b、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒(購于Promega公司)對上述RNA進行RNA逆轉錄，得到PCR模板,具體逆轉錄方法依說明書進行在0.2mL eppendorf管中加入oligo d (T)15primers (50 μ Μ) I μ L，上述約 RNA 10μ L,72°C 10. min，加入 5XRT buffer 4 μ L、dNTP液(IOmM) I μ L、AMV 反轉錄酶液(IOU/μ L) I μ L、RNA 酶抑制劑(20U/ μ L) O. 5 μ L、無 RNA酶水1.5yL，42°C lh，72°C IOmin ;反應產(chǎn)物即為后續(xù)的PCR模板；
c、PCR反應在 O. 2mL 印pendorf 管中加入 10XPCR buffer 2. 5 μ L、濃度為 25mM 的MgCl2溶液L 5 μ L、濃度為IOmM的dNTP液O. 5 μ L、濃度為5U/ μ L的Taq酶液O. 5 μ L、濃度為25 μ M上游引物溶液I μ L、濃度為25 μ M下游引物溶液I μ L，上述PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L組成的反應體系；反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s, 720C延伸lmin，45個循環(huán)，72°C延伸7min，4°C保存PCR產(chǎn)物，上游引物溶液含有核苷酸序列為AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物BI，下游引物溶液含有核苷酸序列為 TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc 的引物 B2 ;
d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產(chǎn)物用重量百分濃度1-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結果用凝膠成像系統(tǒng)分析，若結果出現(xiàn)42T445bp大小片段的條帶,則為黃熱屬病毒。
以上10XPCR buffer、MgC12、dNTP液、Taq酶液等反應試劑均購自大連寶生生物，
引物由上海生工合成。
上述引物BI、B2是根據(jù)Genbank已公布黃熱病毒屬15種病毒的基因組開放讀碼框(0RF)編碼的多聚蛋白(polyprotein)氨基酸序列設計引物對,包括Kokobera virus,Aroa virus, Ilheus virus, Modoc virus, Spondweni virus, Yellow fever virus 17D/Tiantan,Dengue virus I,Japanese encephalitis virus,Louping ill virus,St. Louisencephalitis virus, Tembusu virus, West Nile virus, Murray Valley encephalitisvirus, Rio Bravo virus, Saumarez Reef virus。將蛋白質氨基酸序列以 FASTA 格式保存，輸入http://blocks, fhcrc. org/codehop. html進行Block比對,得到高度保守的連續(xù)氨基酸區(qū)域。使用CodeHop引物捜索，常規(guī)方法篩選合適上下游引物，要求簡并度低，上下游引物位置間距在500bp左右。利用primer和oligo軟件進行引物分析,得到上述I對雜合寡核苷酸引物(上游引物BI和下游引物B2)，通過序列分析軟件與Genbank中獲得的42種典型黃熱病毒屬病毒株全基因比對，理論上均可獲得42f445bp的擴增產(chǎn)物。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于適用于檢測黃病毒屬所有病毒的C0DEH0PRT-PCR的試劑和方法，通過RNA提取、RNA逆轉錄、PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，PCR反應中上游弓I物溶液含有序列為AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物BI，下游引物溶液含有序列為TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc的引物B2，引物BI和引物B2是由5'端非兼并共有序列夾和根據(jù)保守氨基酸設計的很短的3 '端的核心簡并區(qū)aggntggga yac或cartc rtcncc組成,擴增產(chǎn)物序列長度為421 445bp ;引物中5 '端非兼并共有序列在不增加引物簡并度的情況下能穩(wěn)定3 '兼并核心區(qū)與模板結合作用，允許在較高退火溫度下進行，提高了兼并PCR反應的特異性，可以擴增檢測黃病毒屬內病毒，如こ型腦炎病毒、登革病毒、黃熱病病毒、森林腦炎病毒、墨累山谷腦炎病毒、西尼羅河病毒、圣路易腦炎病毒、鄂木斯克出血熱病毒、波瓦桑腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒和科薩努爾森林病病毒等，是ー種黃病毒屬通用性檢測試劑和方法?？蓱糜趪饬餍兄陚魅雵鴥鹊姆揽乇O(jiān)測，也可應用于與擴展基因同源的未知病毒進行檢測，并可以通過對擴增產(chǎn)物的測序可以確定所測病毒的種類或新種發(fā)現(xiàn)，所獲得的生物信息學數(shù)據(jù)可以用于黃熱屬病毒的分子流行病學調查研究。
具體實施方式
以下結合實施例對本發(fā)明作進ー步詳細描述，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。
實施例I :用C0DEH0P RT-PCR法檢測從蚊蟲中分離的こ型腦炎病毒(Japaneseencephalitis virus)
1、總RNA提取從中國檢驗檢疫科學研究院獲得的云南省洱源縣采集的蚊蟲樣品中分離，并接種于BHK細胞的こ型腦炎病毒株JEV1201，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA作為陽性RNA (具體提取方法依說明書)。用微量分光光度計測量RNA濃度和純度，0D260/280彡I. 9，表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質污染，_20°C保存?zhèn)溆茫?br> 2、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒對上述陽性RNA進行RNA逆轉錄，具體方法為在
O.2mL eppendorf管中加入oligo d(T) 15 primers(50 μ Μ) I μ L,陽性RNA 10 μ L, 72°C 10.min,加入 5 X RT buffer 4 μ L、dNTP (IOmM) I μ L、AMV 反轉錄酶(IOU/ μ L) I μ L、RNA 酶抑制劑(20U/yL)0. 5yL、無RNA酶水1.5yL，42°C lh，72°C IOmin ;反應產(chǎn)物作為后續(xù)的PCR模板；
3、PCR反應在 O. 2mL eppendorf 管中加入 10XPCR buffer 2. 5 μ L、MgCl2 溶液(25mM) I. 5 μ し dNTP 液(IOmM)O. 5 μ L、Taq 酶液(5U/ μ L) O. 5 μ L、上游引物溶液(引物 BI濃度為25μΜ) lyL、下游引物溶液(引物Β2濃度為25μΜ) I μ L，PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L組成的反應體系；反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72 °C延伸Imin，45個循環(huán)，72 °C延伸7min，4°C保存PCR產(chǎn)物；
4、瓊脂糖凝膠電泳將PCR產(chǎn)物用濃度1-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帯，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結果用凝膠成像系統(tǒng)分析。結果こ型腦炎病毒JEV1201株BHK細胞培養(yǎng)物出現(xiàn)442bp大小片段的條帶。
5,C0DEH0P RT-PCR方法靈敏性按照步驟I提取こ型腦炎病毒JEV1201株感染的BHK細胞RNA濃度為347. 6ng/ μ L，將RNA用Rnase-free Water 10倍梯度稀釋，按照步驟2-4的方法用B1/B2引物對擴增進行檢測，用分光光度計檢測。結果顯示本檢測方法可以檢測出的最高稀釋度為10_5，相當于34. 76pg核酸的病毒RNA。
6、RT-PCR方法特異性用流行性こ型腦炎JEV1201病毒株RNA、漢坦病毒RNA、甲型HlNl流感病毒RNA、柯薩奇病毒RNA、正常BHK細胞RNA，作為檢測對象，按照步驟1_4的方法用B1/B2引物對擴增進行檢測，結果只有流行性こ型腦炎JEV1201核酸擴增產(chǎn)物在442bp出現(xiàn)一條特異性條帶外，甲型HlNl流感病毒、柯薩奇病毒、漢坦病毒及正常BHK細胞RNA擴增產(chǎn)物均未見特異性核酸條帶。
實施例2、用C0DEH0P RT-PCR法檢測病人血清中登革熱病毒(Dengue virus):從寧波市疾控中心獲得的登革熱病人血清3份，用RNA提取試劑盒進行血清中總RNA提取(具體提取方法依說明書)，各取10 μ L RNA進行RT-PCR反應；按實施例I的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行RT-PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果表明3份登革熱陽性血清樣品均擴增得到433bp大小片段的條帶，陰性血清樣品對照無相應條帶。
實施例3、用C0DEH0P RT-PCR法檢測黃熱病毒(Yellow fever virus)疫苗獲得商品化的黃熱病毒疫苗(賽諾菲巴斯德公司)ー份，用RNA提取試劑盒提取總RNA (具體提取方法依說明書)，各取10 μ L RNA提取物進行RT-PCR反應；按實施例I的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行RT-PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果表明黃熱疫苗RNA提取物擴增得到442bp大小片段的條帶，空白對照無條帶出現(xiàn)。
實施例4、用C0DEH0P RT-PCR法檢墨累山谷腦炎病毒(Murray valleyencephalitis virus)疫苗獲得商品化的墨累山谷腦炎病毒疫苗(賽諾菲巴斯德公司)一份，用RNA提取試劑盒提取總RNA (具體提取方法依說明書)，各取10 μ L RNA提取物進行RT-PCR反應；按實施例I的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行RT-PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果表明墨累山谷腦炎病毒疫苗RNA提取物擴增得到 442bp大小片段的條帶，空白對照無條帶出現(xiàn)。
實施例5、用C0DEH0P RT-PCR法檢測波瓦桑腦炎病韋(Powassan encephalitisvirus)疫苗獲得商品化的波瓦桑腦炎病毒疫苗(賽諾菲巴斯德公司)ー份，用RNA提取試劑盒提取總RNA (具體提取方法依說明書)，各取IOyL RNA提取物進行RT-PCR反應；按實施例I的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行RT-PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果表明波瓦桑腦炎病毒疫苗RNA提取物擴增得到433bp大小片段的條帶，空白對照無條帶出現(xiàn)。
實施例6、用 C0DEH0P RT-PCR 法檢測牌傳腦炎病韋(Tick-borne encephalitisvirus)疫苗獲得商品化的蜱傳腦炎病毒疫苗(賽諾菲巴斯德公司)ー份，用RNA提取試劑盒提取總RNA (具體提取方法依說明書)，各取10 μ L RNA提取物進行RT-PCR反應；按實施例I的步驟2進行RNA逆轉錄，步驟3進行RT-PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果表明蜱傳腦炎病毒疫苗RNA提取物擴增得到433bp大小片段的條帶，空白對照無條帶出現(xiàn)。
實施例7、用C0DEH0P RT-PCR法檢測莫多克病毒(Modoc virus)陽性質粒將人工合成的莫多克病毒核酸片段(寶生物合成)，連接至PMD18-T載體(購自上海生エ)，轉化至DH5a大腸桿菌(購自上海生エ)，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質粒提取試劑盒(購自上海生エ)提取質粒作為陽性模板和陰性對照模板；再按實施例I步驟3的方法進行PCR反應，步驟4的方法進行瓊脂糖凝膠電泳，結果得到421bp特異性條帶，陰性對照無目的條帶。
實施例8、用C0DEH0P RT-PCR法檢西尼羅河病毒(West Nile virus)陽性質粒人工合成西尼羅河病毒核酸片段(大連寶生生物)，連接至PMD18-T載體，轉化至DH5ci大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質粒提取試劑盒(購自上海生エ)提取質粒作為陽性DNA和陰性DNA。然后按實施例I的步驟3進行PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳,結果陽性質粒DNA出現(xiàn)442bp大小片段的條帶，陰性質粒DNA無相應條帶出現(xiàn)。
實施例9、用C0DEH0P RT-PCR法檢圣路易斯腦炎病毒(St. Louis encephalitisvirus)陽性質粒人工合成圣路易斯腦炎病毒核酸片段(大連寶生生物),連接至pMD18-T載體，轉化至DH5 α大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質粒提取試劑盒提取質粒作為陽性DNA和陰性DNA，然后按實施例I的步驟3進行PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果陽性質粒DNA出現(xiàn)442bp大小片段的條帶，陰性質粒DNA無條帶出現(xiàn)。
實施例10、用C0DEH0P RT-PCR法檢巴蘇跨拉病毒(Bussuquara virus)陽性質粒人工合成巴蘇跨拉病毒核酸片段(大連寶生生物)，連接至PMD18-T載體，轉化至DH5a大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質粒提取試劑盒提取質粒作為陽性DNA和 陰性DNA，然后按實施例I的步驟3進行PCR反應，步驟4進行瓊脂糖凝膠電泳，結果陽性質粒DNA出現(xiàn)445bp大小片段的條帶，陰性質粒DNA無條帶出現(xiàn)。
上述實施例僅是本發(fā)明檢測黃熱病毒屬病毒的列舉，同理也可以對該黃熱病毒屬的其他病毒進行檢測，可以對擴增產(chǎn)物進行回收純化，測序后通過基因庫比對可以確定所測病毒的基因型別，確定具體黃熱病毒屬的病毒種類，是ー種適用于所有黃熱病毒屬病毒種類的檢測方法。
權利要求
1.一種檢測黃病毒屬病毒的CODEHOP RT-PCR試劑，包括上游引物溶液和下游引物溶液，其特征在于所述上游引物溶液含有核苷酸序列為AATGTATGCA GATGATACAG Caggntgggayac的引物BI，所述下游引物溶液含有核苷酸序列為TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartcrtcncc的引物B2 ;其中r為嘌呤,可以是g或a, y為喃唳,可以是c或tAi，η是任何堿基，可以是g或a或c或t/u或其它。
2.利用權利要求
I所述ー種檢測黃病毒屬病毒的C0DEH0PRT-PCR試劑檢測黃病毒屬病毒的方法，其特征在于步驟如下 a、RNA提取用RNA提取試劑盒提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說明書進行； b、RNA逆轉錄用RNA逆轉錄試劑盒對上述RNA進行RNA逆轉錄，得到PCR模板，具體逆轉錄方法依說明書進行，反應產(chǎn)物即為后續(xù)的PCR模板； c、PCR反應在O.2mL印pendorf管中加入10XPCR緩沖液2. 5 μ L、濃度為25mM的MgCl2溶液L 5 μ L、濃度為IOmM的dNTP液O. 5 μ L、濃度為5U/ μ L的Taq酶液O. 5 μ L、濃度為25 μ M上游引物溶液I μ L、濃度為25 μ M下游引物溶液I μ L，上述PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L組成的反應體系；反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s, 720C延伸lmin，45個循環(huán)，72°C延伸7min，4°C保存PCR產(chǎn)物，其中上游引物溶液含有核苷酸序列為AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物BI，下游引物溶液含有核苷酸序列為 TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc 的引物 B2 ; d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產(chǎn)物用重量百分濃度1-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結果用凝膠成像系統(tǒng)分析，若結果出現(xiàn)42T445bp大小片段的條帶,則為黃熱屬病毒。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種檢測黃病毒屬病毒的CODEHOPRT-PCR試劑及方法，通過RNA提取、RNA逆轉錄、PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳，PCR反應中上游引物溶液含有序列為AATGTATGCAGATGATACAGCaggntgggayac的引物B1，下游引物溶液含有序列為TCTATCATCAATTGGTTTAACAACAcartcrtcncc的引物B2，引物B1和引物B2是由5＇端非兼并共有序列夾和根據(jù)保守氨基酸設計的很短的3＇端的核心簡并區(qū)aggntgggayac或cartcrtcncc組成，擴增產(chǎn)物序列長度為421~445bp；可以擴增檢測黃病毒屬內病毒，是一種黃病毒屬通用性檢測試劑和方法。
文檔編號C12Q1/68GKCN102643930SQ201210097111
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月5日
發(fā)明者倪紅霞, 孫肖紅, 胡群, 鄭劍寧, 韓輝, 馬思杰 申請人:中華人民共和國大榭出入境檢驗檢疫局導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan