專利名稱:一種木霉生防菌種質(zhì)評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木霉生防菌種質(zhì)評價方法，屬于農(nóng)業(yè)生物防治技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
生物防治是農(nóng)作物病蟲害綜合防治的重要內(nèi)容之一，生物農(nóng)藥是生物防治中應用最廣泛、應用面積最大的措施，我國生物農(nóng)藥的應用具有良好的基礎(chǔ)，20世紀80年代至90年代曾得到迅速發(fā)展，在水稻、小麥、棉花、玉米、果樹、蔬菜等作物病蟲害的綜合防治中發(fā)揮了重要作用。雖有一段低谷，但目前，人們越來越重視保護環(huán)境、生態(tài)和諧和可持續(xù)發(fā)展，提出了 “公共植保，綠色植?！钡睦砟睿镛r(nóng)藥面臨著新的發(fā)展機遇。
木霉生防菌作為微生物活體殺菌劑，其創(chuàng)新利用過程復雜、殺菌機制較多、環(huán)境影響因素復雜，推廣時涉及的附加條件較多，這就決定了木霉生防菌種質(zhì)創(chuàng)新的評價應該是一個系統(tǒng)工程，涉及到平板生長特性比較、拮抗作用篩選、生產(chǎn)工藝的完善與產(chǎn)孢量、制劑貯存期與孢子存活率以及盆栽試驗與大田應用條件下木霉生防菌定殖存活量及存活時間、生物防治效果等一系列指標，目前普遍采用與化學農(nóng)藥相同單一的藥效評價標準是很難滿足要求的，僅涉及其中的一個環(huán)節(jié)，不全面，同時只注重防效，缺少對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)安全性的評價指標，生物農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的安全性、對農(nóng)產(chǎn)品的安全性等優(yōu)點難以突顯出來。
哈茨木霉菌T-22株系是人工修飾的株系，是由T95株系和T12株系為父本通過細胞融合技術(shù)獲得的人工雜交株系。T95株系對植物根系的纏繞能力和定植能力強，T12株系對病害的防治能力強，通過細胞融合技術(shù)將其兩者的優(yōu)點結(jié)合到一起，從而獲得了根系纏繞、定殖、病害防控能力皆優(yōu)的株系T22，同時獲得了其父本對不同土壤類型的適應能力，可以在沙壤土和粘性土壤中良好的定殖繁殖，使T22的應用更具適應性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種木霉生防菌種質(zhì)評價方法。
一種木霉生防菌種質(zhì)評價方法，包括:木霉生防菌生長特性評價，木霉生防菌拮抗作用評價，木霉生防菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量評價，木霉生防菌制劑耐貯性與孢子存活率評價，木霉生防菌在盆栽試驗條件下定殖存活量、生物防治效果評價，木霉生防菌在田間應用條件下定殖存活量、生物防治效果及生態(tài)效應評價:
(I)木霉生防菌生長特性評價:
將待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分別接種于PDA平板培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)；然后分別轉(zhuǎn)接到ro液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)；
測定平板培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌落直徑，生長特性中菌落直徑的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉菌株菌落直徑比哈茨木霉菌T-22菌落直徑提高5% -10% ；
測定平板培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的產(chǎn)孢量，生長特性中產(chǎn)孢量的種質(zhì)評價標 準為:待評價木霉菌株產(chǎn)孢量比哈茨木霉菌T-22產(chǎn)孢量提高10% -20% ；
測定液體培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌絲重量，生長特性中菌絲重量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉菌株菌絲重量比哈茨木霉菌T-22菌絲重量提高10% -15% ；
(2)木霉生防菌拮抗作用評價:
在PDA平板培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)病原真菌與待評價木霉菌株、病原真菌與哈茨木霉菌T-22，具體步驟參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T1156.2-2006 ；
對峙培養(yǎng)結(jié)束后測定病原真菌菌落半徑和被覆蓋情況，分為5級拮抗標準，拮抗作用中拮抗程度的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉菌株拮抗程度為I級或2級；
所述5級拮抗標準如下:
I級:木霉菌完全長過病菌，并覆蓋整個培養(yǎng)皿；2級:木霉菌占整個培養(yǎng)皿面積的2/3以上；3級:木霉菌占整個培養(yǎng)皿面積的1/2至2/3 ;4級:病菌占整個培養(yǎng)皿面積的2/3以上；5級:病菌長過木霉菌，并覆蓋整個培養(yǎng)皿；
(3)木霉生防菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量評價:
對待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22進行固體發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基按65-75wt%的麥麩與25-35wt%的作物秸桿粉末混合，再加入1.1-1.3倍重量的水攪拌均勻，調(diào)pH為6-6.5制得；
測定產(chǎn)孢量，固體發(fā)酵中產(chǎn)孢量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉固體培養(yǎng)物產(chǎn)孢量2.5-6.5X1010cfu/g,`比哈茨木霉菌T-22產(chǎn)孢量提高10% -20% ；
(4)木霉生防菌制劑耐貯性與孢子存活率評價:
參照農(nóng)藥熱貯測定標準GB/T19136-2003和低溫穩(wěn)定性測定標準GB/T19137-2003，將待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分別(TC處理7d、55°C處理14d，室溫放置180天、360天、540天、720天后，進行稀釋平板培養(yǎng)；
通過測定稀釋平板培養(yǎng)基上的萌發(fā)孢子數(shù)，計算孢子存活率，孢子存活率的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉孢子存活率達75%以上，或較哈茨木霉菌T-22孢子存活率提高10% -20% ；
(5)木霉生防菌在盆栽試驗條件下定殖存活量、生物防治效果評價:
取當?shù)馗鲗油寥?，晾干至含水?wt% -5wt%,過孔徑為4mm的篩，經(jīng)滅菌后，得滅菌土壤；種植作物前10-15天，按每克滅菌土壤加入1-1.5 X IO5Cfu分生孢子的量，將待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分別與上述滅菌土壤混合，加滅菌土壤重量20% -30%的水定殖，然后按0.5-1.5kg的量裝入盆中，同時向每盆中播種作物種子3-10粒，然后采用灌土法每盆注入10-15mL每毫升IO6-1O7Cfu的病原真菌菌絲及孢懸液；
分別于種植后15-90天對盆栽土壤進行取樣，采用平板計數(shù)法，測定木霉定殖存活的數(shù)量，盆栽試驗條件下定殖存活量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉在土壤中存活量達
1.5-2.3X 104cfu/g，或比哈茨木霉菌T-22在土壤中存活量提高10% -25% ；
觀察記錄作物出苗率、長勢、健康情況，盆栽試驗條件下生物防治效果的種質(zhì)評價標準為:施用待評價木霉的作物發(fā)病率比施用哈茨木霉菌T-22的作物發(fā)病率降低10% -15% ；
(6)木霉生防菌在田間應用條件下定殖存活量、生物防治效果及生態(tài)效應評價:[0028]作物種植前10-30天，按150_200kg/hm2用量將待評價木霉、哈茨木霉菌T_22施入大田15_20cm的耕層土壤,灌溉至耕層土壤相對含水量為55% -65% ；
分別于作物種植后苗期、生長期、結(jié)果期對耕層土壤進行取樣，采用平板計數(shù)法，測定待評價木霉和哈茨木霉菌T-22定殖存活的數(shù)量，田間應用條件下定殖存活量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉在土壤中存活量為l-28X 104cfu/g干土，或比哈茨木霉菌T-22提高 10% -20% ；
觀察記錄作物出苗率、長勢、健康情況，參照中華人民共和國國家標準殺菌劑GB/T17980.88-2004、GB/T17980.92-2004、GB/T17980.108-2004 標準，田間應用條件下生物防治效果的種質(zhì)評價標準為:施用待評價木霉的作物防病效果比施用哈茨木霉菌T-22的提高10% -15%，或防病效果達70%以上；
測定耕層土壤水穩(wěn)性團聚體數(shù)量、土壤有機質(zhì)、土壤有益微生物群落數(shù)，田間應用條件下生態(tài)效應的種質(zhì)評價標準為:施用待評價木霉的土壤與施用哈茨木霉菌T-22的土壤相比，土壤水穩(wěn)性團聚體數(shù)量提高10% -30%、土壤有機質(zhì)提高5% -10%、土壤有益微生物群落數(shù)提高10% -30% ；
檢測標準:水穩(wěn)性團聚體數(shù)量的檢測標準執(zhí)行中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/Tl 121.19-2008，有機質(zhì)檢測標準執(zhí)行中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1121.6-2006 ；有益微生物群落數(shù)測定:用去離子無菌水稀釋平板培養(yǎng)法，放線菌培養(yǎng)用高氏一號培養(yǎng)基，固氮菌培養(yǎng)用阿須貝氏培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均按本領(lǐng)域慣用配方配制，菌體個數(shù)計算方法按慣用方式計算。
為了提高評價結(jié)果的準確性，上述評價試驗均可多次重復后取平均值。
所述步驟⑴中，平板培養(yǎng)條件為:25_28°C培養(yǎng)5-7天；液體培養(yǎng)條件為:25-28°C搖床培養(yǎng) 2-4d，搖·床轉(zhuǎn)速 180_210r/min。
所述步驟(2)中，對峙培養(yǎng)條件為:25-28 °C培養(yǎng)3_5天；
所述步驟⑵中和(5)中的病原真菌選自:大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、尖鍵刀菌(Fusarium oxysporum)之一。
所述步驟(3)中，固體發(fā)酵條件為:28-30°C，保濕培養(yǎng)2-3d，然后20_28°C，自然濕度培養(yǎng)3-5天。所述的固體發(fā)酵也可按照現(xiàn)有技術(shù)進行，如可參照公開號為CN101028006A、申請?zhí)枮?00610011087.8、名稱為:木霉生物農(nóng)藥的制備工藝中的記載進行。
所述步驟(4)中，將木霉固體發(fā)酵物用無菌水稀釋為IO6-1O9個/ml，稀釋平板培養(yǎng)基每升組分如下:
馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水定容至IOOOml ；
所述步驟(5)中，滅菌采用6tlCo- Y射線照射，照射劑量l_5kGy ;所述病原真菌菌絲及孢懸液是將病原真菌培養(yǎng)10天后用組織搗碎器搗碎稀釋至濃度為106-107cfu/mL菌絲體及孢子的懸浮液。病原真菌選自:大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、尖鍵刀菌(Fusarium oxysporum)之一
上述PDA平板培養(yǎng)基、H)液體培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，PDA平板培養(yǎng)基每升組分如下:
馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水定容至1000ml ；
PD液體培養(yǎng)基每升組分如下:[0044]馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水定容至1000ml ；
上述步驟(5)和(6)中的作物為:棉花、小麥、花生之一；棉花的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治棉花黃、枯萎病GB/T17980.92-2004 ;小麥的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治小麥紋枯病GB/T17980.108-2004，花生的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004。
上述測定、檢測、計算方法如無特別說明均為本領(lǐng)域慣用測定、檢測、計算方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過相同的測定、檢測、計算方法獲得的待評價木霉的相關(guān)數(shù)據(jù)與哈茨木霉菌T-22的相關(guān)數(shù)據(jù)進行比較，均能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。
有益效果
本發(fā)明通過將待評價木霉菌株在生長特性、拮抗作用、固體發(fā)酵產(chǎn)孢量、耐貯性與孢子存活率、盆栽試驗條件下定殖存活量、生物防治效果、在田間應用條件下定殖存活量、生物防治效果及生態(tài)效應方面與哈茨木霉菌T-22進行對比，構(gòu)建出一套木霉生防菌種質(zhì)評價方法體系。該體系有利于篩選生防效果良好、對自然環(huán)境友好的新的木霉菌株，并且可以加快菌種篩選速度，為快速尋找發(fā)現(xiàn)具有經(jīng)濟價值的新木霉菌株提供了有效的途徑。


圖1是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22培養(yǎng)皿中生長24小時菌落直徑的柱狀圖；
圖2是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22液體培養(yǎng)3天菌絲重量的柱狀圖；
圖3是以菌落形成單位(cfu)數(shù)表示實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22固體培養(yǎng)7天產(chǎn)孢量結(jié)果；
圖4是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22在55°C耐高溫14天孢子萌發(fā)結(jié)果;
圖5是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22在0°C耐低溫7天孢子萌發(fā)結(jié)果;
圖6是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22在常溫陰涼貯存180天孢子存活率；
圖7是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22在常溫陰涼貯存360天孢子存活率；
圖8是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22在常溫陰涼貯存540天孢子存活率；
圖9是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22在常溫陰涼貯存720天孢子存活率；
圖10以菌落形成單位(cfu)數(shù)表示實施例1盆栽試驗中待測木霉菌株和哈茨木霉囷T22應用后土壤定殖結(jié)果；
圖11是實施例1盆栽試驗中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22施用后對大麗輪枝菌發(fā)病的抑制作用；[0060]圖12以菌落形成單位(cfu)數(shù)表示實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22田間試驗施用后土壤定殖結(jié)果；
圖13是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22田間試驗對棉花黃萎病的防病效果；
圖14是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22田間施用后對土壤有機質(zhì)的影響；
圖15是實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22田間試驗對土壤水穩(wěn)性團聚體數(shù)量的影響；
圖16以菌落形成單位(cfu)數(shù)表示實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22田間試驗對土壤中固氮菌群落數(shù)量的影響；
圖17以菌落形成單位(cfu)數(shù)表示實施例1中待測木霉菌株和哈茨木霉菌T22田間試驗對土壤中放線菌群落數(shù)量的影響；
具體實施方式
下面結(jié)合實例對本發(fā)明的技術(shù)方案進一步詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例中所述哈茨木霉菌T22購自美國Bioworks有限公司(下簡稱木霉菌T22)；棉花魯棉11號購自山東棉花研究中心，小麥濟麥17號購自山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，花生花育16號購自山東省花生研究所；
大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)購自山東棉花研究中心，立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)購自煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究所,尖鐮刀菌(Fusarium oxysporum)購自山東農(nóng)業(yè)大學。·
培養(yǎng)基
稀釋平板培養(yǎng)基每升組分如下:
馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水定容至1000ml ；
PDA平板培養(yǎng)基每升組分如下:
馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水定容至1000ml ；
PD液體培養(yǎng)基每升組分如下:
馬鈴薯200g,葡萄糖20g,水定容至1000ml ；
實施例中的實驗材料
木霉菌株來源:木霉T36、木霉T52、木霉T64、木霉T80從山東各生態(tài)區(qū)自然分離純化，其中:木霉T36分離自青島常綠山林的耕層土壤、木霉T52分離自濟南多年發(fā)病棉田的耕層土壤、木霉T64分離自壽光日光溫室老棚的耕層土壤、木霉T80分離自淄博蔬菜田的耕層土壤，上述木霉菌株通過土樣稀釋涂皿、顯微鏡下單孢分離純化培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)20次穩(wěn)定，低溫保存；
木霉T128、木霉T309、木霉T317、木霉T406為山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所復合誘變所得，原始菌株為木霉T64，此菌株生長速度較快、產(chǎn)孢量較多，拮抗作用較強，通過60Co-Y射線和紫外線復合誘變后再通過穩(wěn)定性試驗、系列逆境處理和拮抗作用篩選獲得；
木霉T33購自中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所；[0080]木霉T48購自中國農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院生態(tài)科學與工程系；
木霉T62購自山東大學生命科學學院生物科學系；
木霉T153購自中國科學院微生物研究所；
實施例中待評價木霉菌株為:木霉T33、木霉T36、木霉T48、木霉T52、木霉T62、木霉T64、木霉T80、木霉T128、木霉T153、木霉T309、木霉T317、木霉T406。
實施例參照標準:
田間藥效試驗，棉花的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治棉花黃、枯萎病GB/T17980.92-2004 ;小麥的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治小麥紋枯病GB/T17980.108-2004，花生的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004;水穩(wěn)性團聚體數(shù)量的檢測標準執(zhí)行中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T1121.19-2008，有機質(zhì)檢測標準執(zhí)行中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1121.6-2006 ；
微生物群落測定:用去離子無菌水稀釋平板培養(yǎng)法，放線菌培養(yǎng)用高氏一號培養(yǎng)基，固氮菌培養(yǎng)用阿須貝氏培養(yǎng)基，菌體個數(shù)計算方法按慣用方式計算。土樣稀釋IO5倍，取
0.1ml在高氏一號培養(yǎng)基涂皿，30°C培養(yǎng)5-7天，測定放線菌數(shù)量，土樣稀釋IO6倍，取0.1ml涂皿，在阿須貝氏培養(yǎng)基上涂皿，37°C培養(yǎng)3-5天，測定固氮菌數(shù)量。
高氏一號培養(yǎng)基每升組分如下:
可溶性淀粉20g, KNO3 lg, NaCl 0.5g, K2HPO4 0.5g, MgSO4 0.5g, FeSO4 0.01g,3%K2Cr2072ml，瓊月旨 20g, pH 7.0-7.4，水定容至 1000ml。
阿須貝氏培養(yǎng)基每升組分如下:
KH2PO4 0.2g, MgSO4.7H20 0.2g, NaCl 0.2g, CaSO4.2H20 0.2g, CaCO3 3.0g,甘露醇10.0gJ|^g20g，pH 7.2，水定容至 1000ml。
實施例1
本實施例實驗地塊為山東省農(nóng)業(yè)科學院試驗田。
一種木霉生防菌種質(zhì)評價方法，包括:木霉生防菌生長特性評價，木霉生防菌拮抗作用評價，木霉生防菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量評價，木霉生防菌制劑耐貯性與孢子存活率評價，木霉生防菌在盆栽試驗條件下定殖存活量、生物防治效果評價，木霉生防菌在田間應用條件下定殖存活量、生物防治效果及生態(tài)效應評價:
(I)木霉生防菌生長特性評價:
將待評價木霉菌株和哈茨木霉菌T-22分別接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28°C平板培養(yǎng)7天；然后分別轉(zhuǎn)接到H)液體培養(yǎng)基中28°C搖床液體培養(yǎng)4天，搖床轉(zhuǎn)速180r/min ；
測定平板培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌落直徑，按照本發(fā)明生長特性中菌落直徑的種質(zhì)評價標準:待評價木霉菌株菌落直徑比哈茨木霉菌T-22菌落直徑提高5%以上的菌株是木霉T80、木霉T317、木霉T309、木霉T128，7各菌株與木霉T-22持平，木霉T36、木霉T62菌株生長稍慢；
測定平板培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的產(chǎn)孢量，按照本發(fā)明生長特性中產(chǎn)孢量的種質(zhì)評價標準:待評價木霉菌株產(chǎn)孢量> 1.5 X IO9Cfu/皿有10株，比哈茨木霉菌T-22產(chǎn)孢量提高15%以上的菌株是木霉T309、木霉T48、木霉T128、木霉T64、木霉T153，木霉T62、木霉T80、木霉T317產(chǎn)孢量少；[0098]測定液體培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌絲重量，按照本發(fā)明生長特性中菌絲重量的種質(zhì)評價標準:待評價木霉菌株菌絲重量比哈茨木霉菌T-22菌絲重量提高10%以上的菌株是木霉T309、木霉T128、木霉T48、木霉T153，菌株木霉T33、木霉T62、木霉T80、木霉T317菌絲重量低；
重復上述待評價木霉的檢測實驗10次，結(jié)果取平均值，見圖1、表1、圖2。
表1、平皿培養(yǎng)產(chǎn)孢
權(quán)利要求
1.一種木霉生防菌種質(zhì)評價方法，其特征在于，包括:木霉生防菌生長特性評價，木霉生防菌拮抗作用評價，木霉生防菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量評價，木霉生防菌制劑耐貯性與孢子存活率評價，木霉生防菌在盆栽試驗條件下定殖存活量、生物防治效果評價，木霉生防菌在田間應用條件下定殖存活量、生物防治效果及生態(tài)效應評價: (1)木霉生防菌生長特性評價: 將待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分別接種于PDA平板培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)；然后分別轉(zhuǎn)接到H)液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)； 測定平板培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌落直徑，生長特性中菌落直徑的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉菌株菌落直徑比哈茨木霉菌T-22菌落直徑提高.5%-10% ； 測定平板培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的產(chǎn)孢量，生長特性中產(chǎn)孢量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉菌株產(chǎn)孢量比哈茨木霉菌T-22產(chǎn)孢量提高10%-20% ； 測定液體培養(yǎng)條件下待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22的菌絲重量，生長特性中菌絲重量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉菌株菌絲重量比哈茨木霉菌T-22菌絲重量提高.10%-15% ； (2)木霉生防菌拮抗作用評價: 在PDA平板培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)病原真菌與待評價木霉菌株、病原真菌與哈茨木霉菌T-22，具體步驟參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T1156.2-2006 ； 對峙培養(yǎng)結(jié)束后測定病原真菌菌落半徑和被覆蓋情況，分為5級拮抗標準，拮抗作用中拮抗程度的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉菌株拮抗程度為I級或2級； 所述5級拮抗標準如下: I級:木霉菌完全長過病菌，并覆蓋整個培養(yǎng)皿；2級:木霉菌占整個培養(yǎng)皿面積的2/3以上；3級:木霉菌占整個培養(yǎng)皿面積的1/2至2/3 ；4級:病菌占整個培養(yǎng)皿面積的2/3以上；5級:病菌長過木霉菌，并覆蓋整個培養(yǎng)皿； (3)木霉生防菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量評價: 對待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22進行固體發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基按65-75wt%的麥麩與25-35wt%的作物秸桿粉末混合，再加入1.1-1.3倍重量的水攪拌均勻，調(diào)pH為6-6.5制得； 測定產(chǎn)孢量，固體發(fā)酵中產(chǎn)孢量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉固體培養(yǎng)物產(chǎn)孢量.2.5-6.5X1010cfu/g,比哈茨木霉菌T-22產(chǎn)孢量提高10%_20% ； (4)木霉生防菌制劑耐貯性與孢子存活率評價: 參照農(nóng)藥熱貯測定標準GB/T19136-2003和低溫穩(wěn)定性測定標準GB/T19137-2003，將待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分別(TC處理7d、55°C處理14d，室溫放置180天、360天、.540天、720天后，進行稀釋平板培養(yǎng)； 通過測定稀釋平板培養(yǎng)基上的萌發(fā)孢子數(shù)，計算孢子存活率，孢子存活率的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉孢子存活率達75%以上，或較哈茨木霉菌T-22孢子存活率提高.10%-20% ； (5)木霉生防菌在盆栽試驗條件下定殖存活量、生物防治效果評價: 取當?shù)馗鲗油寥溃栏芍梁?wt%-5wt%，過孔徑為4mm的篩，經(jīng)滅菌后，得滅菌土壤；種植作物前10-15天，按每克滅菌土壤加入1-1.5 X IO5Cfu分生孢子的量，將待評價木霉菌株、哈茨木霉菌T-22分別與上述滅菌土壤混合，加滅菌土壤重量20%-30%的水定殖，然后按0.5-1.5kg的量裝入盆中，同時向每盆中播種作物種子3-10粒，然后采用灌土法每盆注入10-15mL每毫升IO6-1O7Cfu的病原真菌菌絲及孢懸液； 分別于種植后15-90天對盆栽土壤進行取樣，采用平板計數(shù)法，測定木霉定殖存活的數(shù)量，盆栽試驗條件下定殖存活量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉在土壤中存活量達·1.5-2.3X 104cfu/g，或比哈茨木霉菌T-22在土壤中存活量提高10%_25% ； 觀察記錄作物出苗率、長勢、健康情況，盆栽試驗條件下生物防治效果的種質(zhì)評價標準為:施用待評價木霉的作物發(fā)病率比施用哈茨木霉菌T-22的作物發(fā)病率降低10%-15% ； (6)木霉生防菌在田間應用條件下定殖存活量、生物防治效果及生態(tài)效應評價: 作物種植前10-30天 ，按150-200kg/hm2用量將待評價木霉、哈茨木霉菌T-22施入大田15_20cm的耕層土壤,灌溉至耕層土壤相對含水量為55%_65% ； 分別于作物種植后苗期、生長期、結(jié)果期對耕層土壤進行取樣，采用平板計數(shù)法，測定待評價木霉和哈 茨木霉菌T-22定殖存活的數(shù)量，田間應用條件下定殖存活量的種質(zhì)評價標準為:待評價木霉在土壤中存活量為l_28X 104Cfu/g干土，或比哈茨木霉菌T-22提高·10%-20% ； 觀察記錄作物出苗率、長勢、健康情況，參照中華人民共和國國家標準殺菌劑GB/T17980.88-2004、GB/T17980.92-2004、GB/T17980.108-2004 標準，田間應用條件下生物防治效果的種質(zhì)評價標準為:施用待評價木霉的作物防病效果比施用哈茨木霉菌T-22的提高10%-15%，或防病效果達70%以上； 測定耕層土壤水穩(wěn)性團聚體數(shù)量、土壤有機質(zhì)、土壤有益微生物群落數(shù)，田間應用條件下生態(tài)效應的種質(zhì)評價標準為:施用待評價木霉的土壤與施用哈茨木霉菌T-22的土壤相t匕，土壤水穩(wěn)性團聚體數(shù)量提高10%-30%、土壤有機質(zhì)提高5%-10%、土壤有益微生物群落數(shù)提高 10%-30% ； 檢測標準:水穩(wěn)性團聚體數(shù)量的檢測標準執(zhí)行中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T·1121.19-2008，有機質(zhì)檢測標準執(zhí)行中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1121.6-2006 ;有益微生物群落數(shù)測定:用去離子無菌水稀釋平板培養(yǎng)法，放線菌培養(yǎng)用高氏一號培養(yǎng)基，固氮菌培養(yǎng)用阿須貝氏培養(yǎng)基； 所述步驟(2)中和(5)中的病原真菌選自:大麗輪枝菌{Verticillium dahliae)、立枯絲核菌{Rhizoctonia solani)、尖鍵刀菌(Fusarium oxysporum)之一； 所述步驟(5)和(6)中的作物為:棉花、小麥、花生之一；棉花的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治棉花黃、枯萎病GB/T17980.92-2004 ；小麥的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治小麥紋枯病GB/T17980.108-2004，花生的出苗率、長勢、健康情況判斷標準參照中華人民共和國國家標準殺菌劑防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004。
2.如權(quán)利要求
1所述的木霉生防菌種質(zhì)評價方法，其特征在于，所述步驟(I)中，平板培養(yǎng)條件為:25-28°C培養(yǎng)5-7天；液體培養(yǎng)條件為:25-28°C搖床培養(yǎng)2_4d，搖床轉(zhuǎn)速180-210r/min。
3.如權(quán)利要求
1所述的木霉生防菌種質(zhì)評價方法，其特征在于，所述步驟(2)中，對峙培養(yǎng)條件為:25-28 °C培養(yǎng)3-5天。
4.如權(quán)利要求
1所述的木霉生防菌種質(zhì)評價方法，其特征在于，所述步驟(3)中，固體發(fā)酵條件為:28-30°C，保濕培養(yǎng)2-3d，然后20-28°C，自然濕度培養(yǎng)3_5天。
5.如權(quán)利要求
1所述的木霉生防菌種質(zhì)評價方法，其特征在于，所述步驟(4)中，將木霉固體發(fā)酵物用無菌水稀釋為IO6-1O9個/ml，稀釋平板培養(yǎng)基每升組分如下: 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水定容至1000ml。
6.如權(quán)利要求
1所述的木霉生防菌種質(zhì)評價方法，其特征在于，所述步驟(5)中，滅菌采用6tlCo-Y射線照射，照射劑量l_5kGy。
7.如權(quán)利要求
1所述的木霉生防菌種質(zhì)評價方法，其特征在于，所述步驟(5)中，病原真菌菌絲及孢懸液是將病原真菌培養(yǎng)10天后用組織搗碎器搗碎稀釋至濃度為IO6-1O7Cfu/mL菌絲體及 孢子的懸浮液。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種木霉生防菌種質(zhì)評價方法，包括木霉生防菌生長特性評價，木霉生防菌拮抗作用評價，木霉生防菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量評價，木霉生防菌制劑耐貯性與孢子存活率評價，木霉生防菌在盆栽試驗條件下定殖存活量、生物防治效果評價，木霉生防菌在田間應用條件下定殖存活量、生物防治效果及生態(tài)效應評價；該方法有利于篩選生防效果良好、對自然環(huán)境友好的新的木霉菌株，并且可以加快菌種篩選速度，為快速尋找發(fā)現(xiàn)具有經(jīng)濟價值的新木霉菌株提供了有效的途徑。
文檔編號C12Q1/06GKCN102660627 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201210112684
公開日2013年9月18日 申請日期2012年4月17日
發(fā)明者陳建愛, 杜方嶺, 周善躍, 裘紀瑩, 劉孝永 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan