專利名稱:一種促進(jìn)檸檬明串珠菌發(fā)酵高產(chǎn)交替蔗糖酶的調(diào)控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)檸檬明串珠菌發(fā)酵高產(chǎn)交替蔗糖酶的調(diào)控方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
交替鹿糖酶(alternansucrase)是一類催化葡糖基特異性轉(zhuǎn)移的新型糖酶,屬于水解酶GH70家族，它催化蔗糖發(fā)生聚合反應(yīng)產(chǎn)生功能性葡聚糖，該類碳水化合物不僅具有免疫抗癌作用，預(yù)防高血壓、動(dòng)脈硬化，有助于減肥，還可以用作代血漿、凝膠過(guò)濾劑、優(yōu)質(zhì)凝膠等。
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)交替蔗糖酶的研究工作停留在野生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)的研究階段，而對(duì)檸檬明串珠菌優(yōu)化發(fā)酵提高交替蔗糖酶產(chǎn)量的制造過(guò)程仍處于起步階段。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本發(fā)明人利用分離篩選的一株檸檬明串珠菌SK24.002菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，同時(shí)通過(guò)控制溫度、PH和碳源來(lái)調(diào)節(jié)菌體生長(zhǎng)與糖酶的分泌表達(dá)，最終提高交替蔗糖酶產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)檸檬明串珠菌發(fā)酵高產(chǎn)交替蔗糖酶的調(diào)控方法。利用本發(fā)明可以提高交替蔗糖酶的產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度，有利于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明所使用的檸檬明串珠菌是本發(fā)明人先前從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離得到，其分類名為朽1檬明串珠菌(Zewcoflo1Sioc citreum) SK 24.002,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2011398。保藏日期2011年11月18日。該菌株已于2011年12月28日申請(qǐng)中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?011104464069，公開號(hào)CN102492644A，
公開日2012年6月13日。
本發(fā)明的技術(shù)方案:一種促進(jìn)檸檬明串珠菌發(fā)酵高產(chǎn)交替蔗糖酶的調(diào)控方法，步驟為:
(1)菌體高密度生長(zhǎng)階段:以檸檬明串珠菌{Leuconostoc ci treum) SK24.002為出發(fā)菌株，控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度水平，初始葡萄糖濃度為10g/L，發(fā)酵4h后開始流加葡萄糖溶液使發(fā)酵液中葡萄糖濃度控制在15_20g/L，發(fā)酵溫度控制在22-25°C，發(fā)酵pH控制在6.0，發(fā)酵17-24h后停止流加葡萄糖溶液，補(bǔ)料生長(zhǎng)階段結(jié)束。
(2)糖酶高效表達(dá)階段:補(bǔ)料生長(zhǎng)階段結(jié)束之后調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度控制在28-30°C，pH控制在5.4，每隔6-10h補(bǔ)加質(zhì)量濃度60%的蔗糖溶液，控制發(fā)酵液中的蔗糖濃度為5-10g/L,兩階段共計(jì)48h后結(jié)束發(fā)酵。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì):葡萄糖10，酵母粉5-10，胰蛋白胨5-10，K2HPO4 5-10,MgSO4.7H20 0.2-0.5，MnSO4.H2O 0.01-0.015，CaCl2 0.02-0.025，吐溫 80 l_5mL/L，pH
6.8_7.0。
交替蔗糖酶在發(fā)酵液和菌體中的最終總酶活力達(dá)到510-960 U/L。[0011]本發(fā)明中交替蔗糖酶的活力是以生物催化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生果糖的量定義的，酶活力IU為每min產(chǎn)生I μ mo I果糖的量。將酶反應(yīng)液稀釋到合適倍數(shù)后過(guò)0.22 μ m的纖維素膜，然后進(jìn)行高效液相(HPLC)分析，計(jì)算果糖含量(g/L)。色譜條件=Sugarpakl鈣型陽(yáng)離子交換柱；Shodex示差折光率檢測(cè)器；柱溫:85 1:;流動(dòng)相:超純水(經(jīng)0.22 μ m膜過(guò)濾)；洗脫流速:0.4 mL/min ;上樣體積:10 μ L ;10 mg/mL的果糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液。
本發(fā)明的有益效果:利用本發(fā)明能大幅度提高交替蔗糖酶的產(chǎn)量，總酶活力達(dá)到510-960 U/L，達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。本方法操作簡(jiǎn)單，能耗低，設(shè)備簡(jiǎn)單，大大降低了生產(chǎn)成本，適于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明產(chǎn)品可以用于食品、化工、醫(yī)藥以及材料等多個(gè)領(lǐng)域，市場(chǎng)前景廣闊，經(jīng)濟(jì)效益高。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明保護(hù)的內(nèi)容并不局限于實(shí)例。
實(shí)施例1
以檸檬明串珠菌SK24.002為研究菌株，控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度水平，初始葡萄糖濃度為10g/L，發(fā)酵4h后開始流加葡萄糖溶液使其濃度控制在20g/L，發(fā)酵溫度控制在220C，發(fā)酵pH控制在6.0，發(fā)酵24h后停止流加葡萄糖溶液；同時(shí)調(diào)節(jié)溫度控制在28°C，pH控制在5.4，每隔IOh補(bǔ)加60%的蔗糖溶液，控制發(fā)酵液中的蔗糖濃度為5g/L，兩階段共計(jì)48h后結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì):葡萄糖10，酵母粉5，胰蛋白胨5，K2HPO4 10，MgSO4.7Η20 0.2，MnSO4.H2O 0.01，CaCl2 0.025，吐溫 80 lmL/L, pH 7.0。交替蔗糖酶在發(fā)酵液和菌體中的最終總酶活力達(dá)到740 U/L。
實(shí)施例2
以檸檬明串珠菌SK24.002為研究菌株，控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度水平，初始葡萄糖濃度為10g/L，發(fā)酵4h 后開始流加葡萄糖溶液使其濃度控制在15g/L，發(fā)酵溫度控制在250C，發(fā)酵pH控制在6.0，發(fā)酵17h后停止流加葡萄糖溶液；同時(shí)調(diào)節(jié)溫度控制在30°C，pH控制在5.4，每隔6h補(bǔ)加60%的蔗糖溶液，控制發(fā)酵液中的蔗糖濃度為10g/L，兩階段共計(jì)48h后結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì):葡萄糖10，酵母粉10，胰蛋白胨10,K2HPO4 5，MgSO4.7Η20 0.5，MnSO4.H2O 0.015，CaCl2 0.02，吐溫 80 5mL/L, pH 6.8。交替蔗糖酶在發(fā)酵液和菌體中的最終總酶活力達(dá)到801 U/L。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)檸檬明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)交替蔗糖酶的調(diào)控方法，其特征在于步驟為: (1)菌體高密度生長(zhǎng)階段:以檸檬明串珠菌Ueuconostoe Cl treum) CCTCC NO:M2011398為出發(fā)菌株，控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度水平，初始葡萄糖濃度為10g/L，發(fā)酵4h后開始流加葡萄糖溶液使發(fā)酵液中葡萄糖濃度控制在15_20g/L，發(fā)酵溫度控制在22-25 °C，發(fā)酵PH控制在6.0，發(fā)酵17-24h后停止流加葡萄糖溶液，補(bǔ)料生長(zhǎng)階段結(jié)束； (2)糖酶高效表達(dá)階段:補(bǔ)料生長(zhǎng)階段結(jié)束之后調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度控制在28-30°C，pH控制在5.4，每隔6-10h補(bǔ)加質(zhì)量濃度60%的蔗糖溶液，控制發(fā)酵液中的蔗糖濃度為5-10g/L，兩階段共計(jì)48h后結(jié)束發(fā)酵； 發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì):葡萄糖10，酵母粉5-10，胰蛋白胨5-10，K2HPO4 5-10,MgSO4.7H20 0.2-0.5，MnSO4.H2O 0.01-0.015，CaCl2 0.02-0.025，吐溫 80 l_5mL/L，pH6.8_7.0 ο
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法，其特征在于交替蔗糖酶在發(fā)酵液和菌體中的最終總酶活力達(dá)到 510-960 U/L。
專利摘要
一種促進(jìn)檸檬明串珠菌發(fā)酵高產(chǎn)交替蔗糖酶的調(diào)控方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)檸檬明串珠菌發(fā)酵分泌交替蔗糖酶的方法，以檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)SK24.002為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)采用溫度、pH與碳源協(xié)同控制策略，實(shí)現(xiàn)提高交替蔗糖酶產(chǎn)量的目標(biāo)，發(fā)酵液和菌體中的最終總酶活力達(dá)到510-960U/L。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能有效提高交替蔗糖酶產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度，并減少發(fā)酵液中雜蛋白的含量，提高了下游提取時(shí)的效率，生產(chǎn)費(fèi)用降低，能耗減少，有利于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/10GKCN102732489 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201210243809
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年7月16日
發(fā)明者江波, 繆銘, 白愛(ài)娟, 張濤, 許婷 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan