專利名稱:乙醇酸的酶促生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，提供了一種使用具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶，由乙醇腈酶促生產(chǎn)乙醇酸的方法。
背景技術(shù)：
乙醇酸(H0CH2C00H ；CAS登記號為79-14-1)是羧酸的α -羥基酸家族的最簡單 成員。其特性使之理想地廣泛用于消費和工業(yè)用途，包括用于水井修復(fù)、皮革工業(yè)、油氣工業(yè)、洗衣和紡織工業(yè)、在聚乙醇酸(PGA)制備中作為單體、以及作為個人護理產(chǎn)品成分。在多個行業(yè)中，乙醇酸還是的清潔劑的主要成分(乳制品和食品加工設(shè)別清潔劑、家用和機構(gòu)用清潔劑、工業(yè)清潔劑[用于運輸設(shè)備、磚石建筑、印刷電路板、不銹鋼鍋爐和加工設(shè)備、冷卻塔/熱交換器]、以及金屬加工[用于金屬酸洗、銅拋光、蝕刻、電鍍、電解拋光])。最近，已報道聚乙醇酸作為阻氣性材料(即顯示高阻氧特性)用于包裝食品及汽水(W02005/106005Α1)。然而，乙醇酸的傳統(tǒng)化學(xué)合成產(chǎn)生了大量的雜質(zhì)，在用于制備作為阻氣性材料的聚乙醇酸之前必須除去。商業(yè)化生產(chǎn)乙醇酸的新技術(shù)，特別是一種以高純度及低成本生產(chǎn)乙醇酸的技術(shù)，將是工業(yè)上所渴望獲得的。
已知多種使用相應(yīng)的α-羥基腈作為原料以及微生物作為催化劑用于制備α-羥基酸的方法。所產(chǎn)生的α-羥基酸的例子包括乙醇酸、乳酸、2-羥基異丁酸、2-羥基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羥基-3，3- 二甲基-4- 丁內(nèi)酯和4-甲硫丁酸。這些產(chǎn)物是使用微生物合成的，例如屬于諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、金桿菌屬(Aureobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酪桿菌屬(Caseobacter)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、埃希氏桿菌屬(Escherich ia)、微球菌屬(Micrococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、枝動桿菌屬(Mycoplana)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假絲酵母屬(Candida)、無芽孢桿菌屬(Bacteridium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、鐮孢菌屬(Fusarium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、細桿菌屬(Microbacterium)、Obsumbacterium和戈登氏菌屬(Gordona)的那些微生物(相應(yīng)于 US 5，223，416 的 JP-A-4-99495、JP-A-4-99496 和 JP-A-4-218385 ;相應(yīng)于 US5，234，826 的 JP-A-4-99497 ;相應(yīng)于 US 5，296，373 的 JP-A-5-95795 ； JP-A-5-21987 ；相應(yīng)于 US 5，326，702 的 JP-A-5-192189 ;相應(yīng)于 EP-A-0610048 的 JP-A-6-237789 ;相應(yīng)于EP-A-0610049 的 JP-A-6-284899 ;相應(yīng)于 US 5，508，181 的 JP-A-7-213296)。
然而，大多數(shù)已知的上述由相應(yīng)的α -羥基腈制備α _羥基酸的方法并不產(chǎn)生并以足夠高的濃度積聚產(chǎn)物，以滿足商業(yè)上的需要。經(jīng)常的結(jié)果是在反應(yīng)初期酶就失活。US5，756，306教導(dǎo)了“當(dāng)使用腈水解酶或腈水合酶酶促水解或水合α-羥基腈以產(chǎn)生羥基酸或α-羥基酰胺時，所出現(xiàn)的問題是在短時間內(nèi)酶失活。因此，難以以高濃度和高產(chǎn)率獲得α -羥基酸或α -羥基酰胺”(第I欄，第49-54行)。維持反應(yīng)混合物中醛濃度(由α-羥基腈解離為醛和氰化氫所形成的)和/或α-羥基腈濃度在規(guī)定的范圍內(nèi)是一種避免該問題的方法。
US 5，508，181提出了涉及酶快速失活的更多困難。特別是，U. S. 5，508，181提及根據(jù)解離平衡，α-羥基腈化合物部分解離為相應(yīng)的醛。這些醛通過與蛋白結(jié)合，在短時間內(nèi)失活酶，因此很難由α-羥基腈以高產(chǎn)率獲得高濃度的α-羥基酸或α-羥基酰胺(第2欄，第16-29行)。阻止由于醛積聚所引起的酶失活的解決方案是將磷酸鹽或次磷酸鹽離子添加到反應(yīng)混合物中。US 5，326，702使用亞硫酸鹽、二亞硫酸鹽或連二亞硫酸鹽離子來 螯合醛并阻止酶失活。然而，即使通過使用上述這樣的添加劑，所產(chǎn)生和積聚的α-羥基酸的濃度仍然是不高的。
U. S. 6，037，155教導(dǎo)了 α -羥基酸產(chǎn)物的低積聚與由于解離的醛積聚所引起的短時間內(nèi)酶失活相關(guān)。這些發(fā)明人提出在水中α-羥基腈部分解離所產(chǎn)生的氰化氫(Agricultural Biological Chemistry, Vol. 46, pages 1165 (1982))以及相應(yīng)的醒或酮(Chemical Reviews, Vol. 42, pages 189 (1948))存在下，酶活性受抑制。本發(fā)明人通過使用微生物解決了醛誘導(dǎo)的酶失活問題，所述微生物酶活性能通過將氰化物添加到反應(yīng)混合物中而得到改善。氰化物的添加限制了 α-羥基腈解離為醛和氰化氫。
具體就乙醇酸生產(chǎn)來說，已知乙醇腈能可逆解離為氰化氫和甲醛，兩者都可失活酶活性。US 3，940，316描述了一種由相應(yīng)的腈制備有機酸的方法，使用了具有“腈水解(nitrilasic) ”活性的細菌，并列出乙醇腈作為底物。具體來說，該專利描述了對于該目的使用芽孢桿菌屬、無芽孢桿菌屬、微球菌屬和短桿菌屬細菌。雖然被描述具有腈水解活性，但是短桿菌R312 (Brevibacterium R312)是在US 3，940，316所有實施例中使用的唯一菌株。已知短桿菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但沒有腈水解酶活性(Toumeix等，Antonie van Leeuwenhoek, 52 :173-182(1986))。
一種通過利用屬于棒狀桿菌(Corynebacterium spp.)的微生物制備乳酸、乙醇酸和2-羥基異丁酸的方法披露于日本專利公開號昭61-56086中。JP 09028390披露了一種通過紅球菌屬或戈登氏菌屬水解酶起作用，由乙醇腈制備乙醇酸的方法。報道了對乙醇酸的選擇性幾乎為100%，沒有乙醇酸酰胺生成。US 6，037，155披露了由α -羥基腈產(chǎn)生包括乙醇酸的α-羥基酸的方法的例子。該公開內(nèi)容承認由于前述問題之故并非所有的微生物催化劑都能產(chǎn)生高濃度的乙醇酸，并教導(dǎo)應(yīng)當(dāng)進行篩選研究以便發(fā)現(xiàn)在工業(yè)上有益的微生物。US 6, 037, 155具體鑒定了抗α-輕基腈或α -輕基酸抑制效應(yīng)的Variovorax spp.和節(jié)桿菌(Arthrobacter spp.)微生物,具有持久的活性,并能在高濃度下產(chǎn)生期望的產(chǎn)物。
敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis) 72W(ATCC 55746)具有脂族腈水解酶(EC
3.5. 5. 7)活性，以及腈水合酶(EC 4. 2. I. 84)和酰胺酶(EC 3. 5. I. 4)活性組合的特征。US5，814，508披露了于35-701，在適合的緩沖液中加熱敏捷食酸菌721(4了0 55746)懸浮液一段短時間以鈍化全細胞催化劑不需要的腈水合酶和酰胺酶活性，不產(chǎn)生明顯減少的期望的腈水解酶活性。
已克隆并重組表達了編碼敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的基因((相應(yīng)于 US 6, 870, 038 的 W 01/75077)和 Chauhan 等，Appl Microbiol Biotechnol,61 118-122(2003))。敏捷食酸菌72W腈水解酶能以高產(chǎn)率將α-羥基腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α-羥基羧酸(US 6，383，786)，包括乙醇酸(US 6，416，980)。然而，對于降低工業(yè)生產(chǎn)成本，用于以高達100%轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)率將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶應(yīng)當(dāng)是十分有用的。
一種使用酶催化劑經(jīng)濟地生產(chǎn)乙醇酸的方法需要利用能以高濃度將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸，并具有高催化劑生產(chǎn)率(公斤乙醇酸/公斤酶催化劑)和容積生產(chǎn)率(乙醇酸克數(shù)/升/小時)的催化劑。酶催化劑可用于多步連續(xù)分批反應(yīng)(multiple consecutivebatch reactions)中，或用于恒量添加乙醇腈并移除乙醇酸的連續(xù)反應(yīng)中；在任何一種操作方式中，催化劑活性和壽命應(yīng)以致于獲得高容積生產(chǎn)率和催化劑生產(chǎn)率，并且在分批反應(yīng)情況下，催化劑應(yīng)當(dāng)在多個反應(yīng)循環(huán)中得到利用，而不在連續(xù)分批反應(yīng)之間明顯損失酶 活性。具有改善的用于乙醇腈水解的腈水解酶活性的突變的腈水解酶能提供改善的容積生產(chǎn)率。鑒于在乙醇腈反應(yīng)混合物中游離甲醛(以及可能的其他雜質(zhì))的失活效應(yīng)會不同程度地消極影響所有腈水解酶催化劑的事實，還需要在用于乙醇腈水解的反應(yīng)條件下穩(wěn)定酶活性的改善(產(chǎn)生相對增加的催化劑生產(chǎn)率)。
待解決的問題是提供一種利用具有明顯改善的用于乙醇腈水解的腈水解酶活性的酶催化劑增加乙醇酸體積生產(chǎn)率的方法。待解決的額外問題是提供一種增加用于乙醇酸生產(chǎn)的酶催化劑生產(chǎn)率和穩(wěn)定性，由此降低酶催化劑成本和生產(chǎn)總成本的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了由乙醇腈酶促生產(chǎn)乙醇酸的方法。提供了一種由乙醇腈生產(chǎn)乙醇酸的方法，包括
a)將適合的含水反應(yīng)混合物中的乙醇腈與包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化劑接觸，所述多肽具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代
(I)在氨基酸殘基第168位用賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸或纈氨酸取代；和
(2)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；
由此產(chǎn)生乙醇酸；和
b)以鹽或酸的形式回收(a)中產(chǎn)生的乙醇酸；其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化劑提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的增加。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種編碼具有腈水解酶活性的多肽的分離的核酸分子，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和[0023]b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；
其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的增加。
在又一方面，提供了一種當(dāng)將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時，顯示明顯改善的腈水解酶活性的分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和
b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；
·[0028]其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的增加。
序列表和牛物學(xué)保藏簡沭
以下序列描述和附于此的序列表符合37C. F. R. § I. 821-1. 825所列的指導(dǎo)專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列披露的規(guī)定。序列描述包含符合Nucleic Acids Research
13:3021-3030(1985)和 Biochemical Journal 219 (No. 2) :345-373 (1984)(它們在此并入作為參考)中所述的IUPAC-IYUB標準規(guī)定的對于核苷酸序列字符的單字母編碼和對于氨基酸的三字母編碼。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式符合37C. F. R. § I. 822的規(guī)定。
SEQ ID NO :1是用于擴增敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的引物165的核苷酸序列。隨后，將所擴增的PCR產(chǎn)物克隆入pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA ；GenBank L09137)以創(chuàng)建質(zhì)粒 Pswi38。
SEQ ID NO :2是用于擴增敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的引物166的核苷酸序列。隨后，將所擴增的PCR產(chǎn)物克隆入pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA ；GenBank L09137)以創(chuàng)建質(zhì)粒 Pswi38。
SEQ ID NO :3是用于擴增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 4是用于擴增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO :5是敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的核苷酸序列，包含由TTG至ATG的起始密碼子改變以利于在大腸桿菌中重組表達。
SEQ ID NO 6是推斷的由SEQ ID NO 5的核苷酸序列編碼的敏捷食酸菌72W腈水解酶的氨基酸序列，所述核苷酸序列包含由TTG至ATG的起始密碼子改變以利于在大腸桿菌中重組表達。
SEQ ID NO :7是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個氨基酸取代(L201Q ；Leu — GIn)。
SEQ ID NO :8是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 7)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — GIn)。
SEQ ID NO :9是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個氨基酸取代(L201A ；Leu — Ala)。
SEQ ID NO : 10是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 9)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — Ala)。
SEQ ID NO : 11是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生 單個氨基酸取代(L201C ；Leu — Cys)。
SEQ ID NO : 12是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 11)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — Cys)。
SEQ ID NO : 13是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個氨基酸取代(L201T ；Leu — Thr)。
SEQ ID NO : 14是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 13)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — Thr)。
SEQ ID NO : 15是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個氨基酸取代(L201G ；Leu — Gly)。
SEQ ID NO : 16是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 15)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — Gly)。
SEQ ID NO : 17是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個氨基酸取代(L201H ；Leu — His)。
SEQ ID NO : 18是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 17)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — His)。
SEQ ID NO : 19是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個氨基酸取代(L201K ；Leu — Lys)。
SEQ ID NO :20是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 19)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — Lys)。
SEQ ID NO :21是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個氨基酸取代(L201N ；Leu — Asn)。
SEQ ID NO :22是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 21)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — Asn)。
SEQ ID NO :23是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個氨基酸取代(L201S ；Leu — Ser)。
SEQ ID NO :24是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 23)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201 — Ser)。
SEQ ID NO :25是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個氨基酸取代(F168K ；Phe — Lys)。
SEQ ID NO :26是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 25)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個氨基酸取代(Phe 168 — Lys)。
SEQ ID NO :27是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個氨基酸取代(F168M ；Phe — Met)。
SEQ ID NO :28是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 27)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個氨基酸取代(Phe 168 — Met)。
SEQ ID NO :29是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個氨基酸取代(F168T ；Phe — Thr)。[0060]SEQ ID NO :30是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 29)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個氨基酸取代(Phe 168 — Thr)。
SEQ ID NO :31是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個氨基酸取代(F168V ；Phe — Val)。
SEQ ID NO :32是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 31)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個氨基酸取代(Phe 168 — Val)。
SEQ ID NO :33是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個氨基酸取代(T210A ；Thr — Ala)。
SEQ ID NO :34是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 33)的氨基酸序列，在敏捷 食酸菌72W腈水解酶的殘基第210位包含單個氨基酸取代(Thr210 — Ala)。
SEQ ID NO :35是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個氨基酸取代(T210C ；Thr — Cys)。
SEQ ID NO :36是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 35)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第210位包含單個氨基酸取代(Thr210 — Cys)。
SEQ ID NO 37 是在大腸桿菌 SS 1001 (ATCC PTA-1177 ；US6, 870，038，在此并入作為參考)中表達的敏捷食酸菌72W腈水解酶基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO :38是推斷的在大腸桿菌SS1001 (ATCC PTA-1177)中表達的敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO 33)的氨基酸序列。
業(yè)已依據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約條款的規(guī)定進行了以下生物學(xué)保藏
保藏人識別參考國際保藏編號保藏日
敏捷食酸菌72WATCC 557461996年3月8日
大腸桿菌 SS1001 ATCC PTA-1177 2000 年 I 月 I I 日
如本文所使用的，“ATCC”指美國典型培養(yǎng)物保藏中心，位于ATCC，10801University Blvd. ,Manassas, VA 20110-2209，USA 的國際保藏機構(gòu)?！皣H保藏編號”是在ATCC保藏的培養(yǎng)物的保藏號。
所列的保藏物應(yīng)當(dāng)在所指明的國際保藏機構(gòu)保藏至少三十(30)年，并且公眾在得到披露其的專利授權(quán)之后可以獲得。保藏物的可利用性并不構(gòu)成對實施本發(fā)明的許可，這種實施會破壞通過政府行為授予的專利權(quán)。
具體實施方式
已通過提供了一種利用具有改善的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，以高產(chǎn)率及在高濃度下由相應(yīng)的乙醇腈制備乙醇酸的方法解決了所述問題。該解決所述問題的方法包括1)利用具有改善的腈水解酶活性和/或改善的用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的催化劑生產(chǎn)率的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，和2)在用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的反應(yīng)條件下，改善催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率的方法。該在用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的反應(yīng)條件下，改善催化劑穩(wěn)定性/生產(chǎn)率的方法，包括I)利用添加劑來穩(wěn)定酶催化劑活性，2)在基本上無氧的條件下運行反應(yīng)，和3)控制乙醇腈到反應(yīng)混合物中的進料速度，以便保持乙醇腈的目標濃度。
定義
在本文中，使用了許多術(shù)語和縮寫。除非另作明確說明，否則使用以下定義。
如本文所使用的，術(shù)語“包含”表示如權(quán)利要求
中所提及的規(guī)定的特征、整體、步驟或組分的存在，但其并不排除一個或多個其他特征、整體、步驟、組分或它們的組的存在或添加。
如本文所使用的，修飾所使用的本發(fā)明成分或反應(yīng)物的數(shù)量的術(shù)語“約”指數(shù)量上的變化，所述變化可例如通過用于在真實世界中制備濃縮物或使用溶液的標準量度和液體處理工序；通過在這些工序中的疏忽過失；通過用于制造組合物或執(zhí)行方法的產(chǎn)品、原料或配料純度的差異等產(chǎn)生。術(shù)語“約”還包含由于由特定的初始混合物產(chǎn)生的組合物的不同的平衡條件之故所相異的量。無論是否為術(shù)語“約”所修飾，權(quán)利要求
包括相等的量。在一個實施方案中，術(shù)語“約”表示在所報告的數(shù)值的10%之內(nèi)，優(yōu)選在所報告的數(shù)值的5% 之內(nèi)。
如本文所使用的，術(shù)語“回收”表示分離、純化或轉(zhuǎn)移利用本發(fā)明方法所生成的產(chǎn)物。分離和純化來自反應(yīng)混合物的產(chǎn)物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，可包括但不限于選擇性沉淀、結(jié)晶、過濾、反應(yīng)性溶劑萃取、離子交換、電滲析、聚合、蒸餾、熱分解、醇解以及它們的組合。在一個實施方案中，術(shù)語“回收”還可包括將反應(yīng)混合物(通常在濾除酶催化劑之后)轉(zhuǎn)移到另一種反應(yīng)中以產(chǎn)生一種或多種額外的產(chǎn)物。
如本文所使用的，術(shù)語“酶催化劑”或“微生物細胞催化劑”指具有用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸和氨的腈水解酶活性特性的催化劑(即包含至少一種具有腈水解酶活性的多肽)。酶催化劑可以完整的微生物細胞、透化處理的微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞成分、部分純化的酶或純化的酶的形式存在。酶催化劑可以是游離的(未固定的)或固定在可溶性或不溶性支持物中或其上。如本文所使用的，“再循環(huán)的酶催化劑”指在分批反應(yīng)中被再生為酶催化劑的酶催化劑。
如本文所使用的，術(shù)語“催化劑生產(chǎn)率”和“酶催化劑生產(chǎn)率”指每克催化劑產(chǎn)生的產(chǎn)物總量。在本發(fā)明中，所述催化劑是腈水解酶(EC3. 5. 5. 7)，所產(chǎn)生的產(chǎn)物是乙醇酸和/或乙醇酸銨(取決于反應(yīng)的pH)。一般而言，在基本上pH中性的條件下進行本發(fā)明方法，以便所產(chǎn)生的乙醇酸主要以乙醇酸相應(yīng)的鹽(即乙醇酸銨)的形式存在。一般來說，在具有催化劑再循環(huán)的分批反應(yīng)中，隨每一次循環(huán)反應(yīng)催化劑活性而降低(酶失活)。
如本文所使用的，術(shù)語“敏捷食酸菌(Acidovorax facilis) ”和“敏捷食酸菌(A. facilis)”可交換地使用，并指保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(國際保藏機構(gòu))，具有保藏號55746( “ATCC 55746”)的敏捷食酸菌72W。
如本文所使用的,術(shù)語“大腸桿菌(Escherichia coli)”和“大腸桿菌(E. coli) ”可交換地使用。一些適合用于重組表達的大腸桿菌菌株描述于此，包括但不限于具有國際保藏編號ATCC 47076的大腸桿菌MG1655、具有國際保藏編號ATCC 53911的大腸桿菌FM5、具有國際保藏編號ATCC 27325的大腸桿菌W3110、具有國際保藏編號ATCC 35695的大腸桿菌MC4100和具有國際保藏編號ATCC 12435的大腸桿菌W1485。在一個實施方案中，適合的大腸桿菌菌株包括大腸桿菌FM5 (ATCC53911)和大腸桿菌MG1655 (ATCC 47076)。
如本文所使用的，術(shù)語“大腸桿菌SS1001”或“SS1001”指表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，具有ATCC登記號PTA-1177 (US 6，870, 038 ;其全文在此并入作為參考)。與野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO :6)相比，重組表達的大腸桿菌SS1001腈水解酶(SEQ ID NO 38)含有2個小的序列改變。起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG以利于重組表達，并在克隆過程中導(dǎo)入在C-末端附近引起單個氨基酸改變(Pro367[CCA] — Ser[TCA])的人工序列。
如本文所使用的，術(shù)語“乙醇腈”縮寫為“GLN”，并且與羥基乙腈、2-羥基乙腈、羥基甲腈以及CAS登記號107-16-4的所有其他異名同義。
如本文所使用的，術(shù)語“乙醇酸”縮寫為“GLA”，并且與羥基乙酸(hydroxyaceticacid)、輕基醋酸(hydroxyethanoic acid)以及CAS登記號79_14_1的所有其他異名同義。經(jīng)本發(fā)明方法產(chǎn)生的乙醇酸可以質(zhì)子化的羧酸和/或相應(yīng)的銨鹽的形式存在。
如本文所使用的，術(shù)語“乙醇酸銨”縮寫為“NH4GLA”。如本文所使用的，術(shù)語“乙交酯”指CAS登記號502-97-6的化合物。
如本文所使用的，術(shù)語“適合的含水乙醇腈反應(yīng)混合物”和“適合的含水反應(yīng)混合物，，指其中乙醇腈和酶催化劑得到接觸的物質(zhì)和水。
如本文所使用的，術(shù)語“腈水解酶催化劑”指具有腈水解酶活性(EC3. 5. 5. 7)特性的酶催化劑。腈水解酶直接將脂族腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸，不形成作為中間體的相應(yīng)的酰胺(方程式I)。
方程式I.
權(quán)利要求
1.一種由乙醇腈生產(chǎn)乙醇酸的方法，包括 a)將適合的含水反應(yīng)混合物中的乙醇腈與包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化劑接觸，由此產(chǎn)生乙醇酸，所述多肽如SEQ ID NO: 8所示；和 b)以鹽或酸的形式回收(a)中產(chǎn)生的乙醇酸；其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化劑提供了至少I. 5倍腈水解酶活性增加。
2.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑是當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性提供了至少約2倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化劑。
3.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑是當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性提供了至少約4倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化劑。
4.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑以完整的微生物細胞、透化處理的微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種成分、部分純化的酶或純化的酶的形式存在。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中所述完整的微生物細胞是重組表達所述多肽的轉(zhuǎn)化的微生物宿主細胞。
6.權(quán)利要求
4的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物宿主細胞選自叢毛單胞菌、棒狀桿菌、短桿菌、紅球菌、固氮菌、檸檬酸桿菌、腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、克雷白氏桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、畢赤酵母、克魯維酵母、假絲酵母、漢森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉菌、球擬酵母、甲基桿菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、根瘤菌和鏈霉菌。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物宿主細胞是大腸桿菌。
8.利要求7的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物宿主細胞是選自大腸桿菌MG1655和大腸桿菌FM5的大腸桿菌菌株。
9.權(quán)利要求
1-8任一項的方法，其中酶催化劑固定在可溶性或不溶性的支持物中或支持物上。
10.權(quán)利要求
I的方法，其中在含水反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的乙醇酸銨的濃度為約0.02wt% 至約 90 wt %。
11.權(quán)利要求
10的方法，其中在含水反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的乙醇酸銨的濃度為約0.02wt % 至約 40 wt %。
12.權(quán)利要求
9的方法，其中含水反應(yīng)混合物中乙醇腈的濃度為約5mM至約I M。
13.權(quán)利要求
12的方法，其中通過連續(xù)或等分物添加保持含水反應(yīng)混合物中的乙醇腈濃度。
14.權(quán)利要求
I的方法，其中含水反應(yīng)混合物中pH保持在約5.5至約7. 7。
15.權(quán)利要求
I的方法，其中在基本上無氧的條件下進行乙醇腈酶促轉(zhuǎn)化為乙醇酸。
16.權(quán)利要求
I的方法，其中含水反應(yīng)混合物進一步包含小于5wt %濃度的選自硫代硫酸鉀和連二亞硫酸鈉的穩(wěn)定劑。
17.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑是再循環(huán)的酶催化劑。
18.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細胞干重產(chǎn)生至少300克乙醇酸的催化劑生產(chǎn)率。
19.權(quán)利要求
18的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細胞干重產(chǎn)生至少450克乙醇酸的催化劑生產(chǎn)率。
20.權(quán)利要求
19的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細胞干重產(chǎn)生至少1000克乙醇酸的催化劑生產(chǎn)率。
專利摘要
本發(fā)明涉及乙醇酸的酶促生產(chǎn)。具體地，提供了由乙醇腈酶促生產(chǎn)乙醇酸的多種方法。這些方法包括1)利用具有改善的用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，和2)改善催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率的方法。該改善催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率的方法包括利用反應(yīng)穩(wěn)定劑，在基本上無氧的條件下運行反應(yīng)以及控制反應(yīng)混合物中底物的濃度。
文檔編號C12R1/19GKCN102796771SQ201210290876
公開日2012年11月28日 申請日期2005年12月21日
發(fā)明者R.迪科西莫, M.S.佩恩, A.帕諾瓦, D.P.奧基夫, J.S.湯普森 申請人:納幕爾杜邦公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan