專利名稱:人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因表達調控，具體涉及人膽固醇酯合成酶基因。
背景技術：
人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7即人?；o酶A膽固醇?；D移酶-1基因啟動子7(以下簡稱人ACAT-1基因P7啟動子)調控該基因的表達。人ACAT-2由不同的基因編碼，在此不作進一步討論。
膽固醇酯合成酶催化膽固醇和長鏈酯酰輔酶A形成膽固醇酯，膽固醇酯合成酶即酰基輔酶A膽固醇?；D移酶(Acyl-coenzyme Acholesterolacyltransferase，簡稱ACAT，EC2.3.16)。它是一種胞內內質網(wǎng)膜上的酶，廣泛存在于人和其它生物的各種組織、細胞中。ACAT在生物體內發(fā)揮重要的生理功能。包括貯存細胞內膽固醇，減少膽固醇對細胞膜的潛在毒性，肝臟脂蛋白的裝配，膽固醇的吸收以及甾醇的合成等。ACAT在發(fā)育分化過程中的作用機理還知之甚少。以大鼠為材料觀察到胚胎鼠肝細胞中ACAT的活性極低，新生鼠肝細胞中ACAT活性很快升高。表明ACAT是個體生長發(fā)育所必須的(Smith JL，et al.1995，J.Lipid.Res，36641-52)。在單核細胞分化成巨噬細胞過程中，ACAT的表達也明顯升高，表明ACAT在細胞分化過程中起重要作用。敲除酵母細胞的ARE基因(與ACAT基因高度同源)，酵母的有絲分裂不能進行，表明ACAT是正常細胞周期所必須的。
在病理條件下，體內ACAT表達過高或過低都會引起病變，如動脈粥樣硬化癥和智力低下。由ACAT合成的膽固醇酯的聚集是動脈粥樣硬化病灶中泡沫細胞形成的主要標志。如果能特異地抑制巨噬細胞/泡沫細胞及動脈壁細胞的ACAT活性，將能直接有效的阻斷動脈動脈粥樣硬化癥的發(fā)生。
因此，篩選ACAT的特異的抑制劑成為一些制藥公司競相研究的熱點。目前通過建立的幾種體外、體內測活方法篩選到大量ACAT的抑制劑，這些抑制劑作用機理是1.增加細胞內的膽固醇外流，造成內質網(wǎng)中ACAT可利用的膽固醇剝脫；2.有些抑制劑是膽固醇或單鏈不飽和脂肪酸的類似物，可競爭抑制ACAT與其天然底物的結合；3.直接抑制動脈壁細胞中ACAT的活性。但這些抑制劑的特異性較差，毒副作用較大，而且，由于天然形式的ACAT蛋白還沒有純化成功，因此尋找ACAT特異有效的抑制劑還很困難。
1993年美國Dartmouth醫(yī)學院的T.Y.Chang實驗室利用ACAT缺陷的CHO細胞突變株AC29首次克隆了人ACAT-1基因的cDNA(Chang CCY，HubHY，Cadigan KM，Chang TY，1993，J.Biol.Chem，26820747-55)。在克隆過程中，將人成纖維細胞DNA轉染AC29細胞，經過兩代穩(wěn)定遺傳，篩選得到穩(wěn)定表達ACAT活性的轉化株。利用人特異的Alu重復序列為探針，從其基因組DNA中篩選到一個1.2kb的人基因組DNA片段ACAT G2。再以此探針從制備人cDNA庫篩選到全長的人ACAT-1基因cDNA，命名為ACAT cDNAK1。人ACAT cDNA K1長4011bp，包含有一個1.65kb的開放閱讀框架(編碼550個氨基酸)、1396bp長的5’-UTR和965bp長的3’UTR。人ACATcDNA K1的片段在昆蟲細胞(不含內源性ACAT活性)得到高表達，表明ACATcDNA K1能編碼ACAT蛋白。迄今為止，兔(Pape ME，et al.1995，J.Lipid.Res，36823-38)、小鼠(Uelmen PT，et a1.，1995，J.Biol.Chem，27026192-201)、CHO細胞(Cao G，et al.，1996，J. Biol.Chem，27114642-48)的ACAT基因cDNA已被克隆，酵母的兩種形式的膽固醇酯化基因(Yang H，et al.，1996，Science，2721353-56)及ACAT-2基因cDNA也被克隆，但至今尚未有哺乳類基因組DNA克隆的報道。
由于啟動子在基因的表達調控中起關鍵作用，而人ACAT-1基因的啟動子尚未報道。

發(fā)明內容
為此，本發(fā)明的目的是提供人膽固醇酯合成酶-1啟動子7，即人?；o酶A膽固醇酰基轉移酶-1啟動子7(以下簡稱人ACA T-1基因P7啟動子)。首先通過PCR方法篩選得到含有人ACAT-1基因組DNA片段的克隆，然后亞克隆、序列測定和轉錄活性分析鑒定了人ACAT-1基因P7啟動子。該啟動子可以作為藥物作用的靶，從而為治療膽固醇相關疾病(包括動脈粥樣硬化癥)提供一種可能的途徑。
本發(fā)明提供一種人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7，其特征在于該啟動子7具有下列DNA序列該序列1長度為-612～-1如下-612GAGCTCCACCTCCTGTCAAATCAGATTATCCAATCAGAAACAGCATTAGATTCTACAGTATGCCAAACCC -543AATTGTGAACTGTACATGCAAGGGATCTAGGTTGCATGCTCCTAATGAAAATCTAACTAGTGGAAAAACT -473GTCTTCCACGAAACCGGACCCTGGTGACAAAAAGGCTGGGGACCCCGATCTATGGCATTTGTGGAGAATT -403TTATGGCTAGCACACTTGGTAAACAAATTCAAAAGAAAACGAATCTTATCTCATTAAAAATGAACATATT -333TACATGCACAAACATAAGTTGGAATGGGGAAATTTATGTAGTTGGAAAATAGCTATTAAATGTAAACAAA -263CATAATTATAGTGTAGATTAAGGACTAGCAATCTTTTCAGAGGTAATAATAACACCAATGTTGTACATTC -193ATCCTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGCCTGGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGG -123CCCGATCTCGGCTCACTGCAACGTCCGCCTCCCAAGTTCATGCCATTCTCCTGGCTCAGCCTCTCGAGTA -53GCTGGGACTACAGGCACCCGCCACCACGTTTGGCGAATTTTTTGTATTTTTA -1首先通過PCR方法篩選得到了含有人ACAT-1基因組DNA片段的P1噬菌體質粒陽性克隆，將包含人ACAT-1基因P7啟動子的基因組DNA片段亞克隆至轉移載體中，測定并分析人ACAT-1基因P7啟動子的序列，構建了含有人ACAT-1基因P7啟動子的重組表達質粒，轉染哺乳動物細胞瞬時表達，進行啟動子轉錄活性分析，確定了該啟動子的轉錄起始位點。本發(fā)明使可能通過作用于該啟動子，在特定時期、特定組織里能改變ACAT的表達水平，為治療膽固醇相關疾病(如動脈粥樣硬化癥等)提供另一可能的途徑；另外，也可利用人ACAT-1基因P7啟動子在哺乳動物細胞中表達異源蛋白。
本發(fā)明得到了1個P1噬菌體質粒陽性克隆，它含有人ACAT-1基因P7啟動子和外顯子Xa。用人ACAT-1基因外顯子Xa特異的引物，通過PCR方法篩選人基因組DNA的P1文庫，得到了一個陽性克隆P1 4651。經限制性內切酶圖譜、亞克隆和DNA序列測定等分析，發(fā)現(xiàn)它含與ACATcDNA K1的3～1279bp相對應的序列，但不含有與ACAT cDNA K1 1280～4011bp對應的基因組DNA片段，后者所對應的相關基因組DNA序列克隆參考專利《人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子1》。經深入研究分析，所獲得的實驗證據(jù)表明人ACAT-1基因至少有兩個啟動子人ACAT-1基因P1啟動子和人ACAT-1基因P7啟動子。
本發(fā)明構建了一系列含人ACAT-1基因P7啟動子的重組質粒并測定、分析了人ACAT-1基因P7啟動子的序列。根據(jù)P14651的限制性內切酶圖譜，將人ACAT-1基因外顯子Xa的上游序列克隆入載體pBluscript SK(+/-)中，并測定外顯子Xa上游612bp的DNA序列。分析表明這段序列中有兩個CCAAT Box；一個反向的TFIID結合位點特征序列；一個Sp1結合位點，一個Ap2結合位點和一段Insulin增強子序列。表明這段序列是典型的轉錄啟動子區(qū)。
本發(fā)明將人ACAT-1基因外顯子Xa的上游序列分不同長度接在報告基因上游，構建了一系列真核表達質粒。
本發(fā)明通過將上述真核表達質粒轉染哺乳動物細胞，分析了人ACAT-1基因P7啟動子的轉錄活性和主要轉錄活性所在區(qū)段。
本發(fā)明確定了人ACAT-1基因P7啟動子的轉錄起始位點。應用引物延伸方法，發(fā)現(xiàn)人ACAT-1基因P7啟動子轉錄起始位點G(圖5)。
本發(fā)明人ACAT-1基因啟動子7在制備治療膽固醇相關疾病的藥物中作為靶。
綜上，本發(fā)明優(yōu)點如下首次得到并鑒定了含人ACAT-1基因外顯子Xa的基因組DNA的P1噬菌體質粒陽性克??；確定了這個陽性克隆的限制性內切酶圖譜；確定了該陽性克隆所包含的基因組DNA與ACAT cDNA K1的對應關系；亞克隆含人ACAT-1基因外顯子Xa的基因組DNA片段并進行DNA序列測定；將不同長度的人ACAT-1基因P7啟動子區(qū)插入報告基因上游構建了一系列真核表達質粒；把這些表達質粒轉染哺乳動物細胞，瞬時表達，分析了人ACAT-1基因P7啟動子的轉錄活性；利用引物延伸方法確定了人ACAT-1基因P7啟動子的轉錄起始位點。本發(fā)明無論對基礎理論研究還是對膽固醇相關疾病(包括動脈粥樣硬化癥)的診斷與治療及藥物篩選都具有重要意義；并可利用本發(fā)明在哺乳動物細胞中表達異源蛋白。



圖1.人ACAT-1基因P7啟動子序列。-612～-1bp的序列命名為序列1圖2.P14651克隆的限制性內切酶圖譜。
圖3.人ACAT-1外顯子Xa和其旁側序列的亞克隆。
圖4.真核表達質粒和人ACAT-1基因P7啟動子轉錄活性分析。將人ACAT-1外顯子Xa的上游旁側序列(-612～+163bp)分不同長度接入熒光素酶報告基因載體pGL2-E上游，用lipofecTAMINE方法轉染AC29細胞，測定相對熒光素酶活性。
圖5.確定人ACAT-1基因P7啟動子的轉錄起始位點。*表示轉錄起始位點。
具體實施方式
本發(fā)明通過以下實施例作進一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1人ACAT-1基因組DNA的克隆、鑒定為獲得含有人ACAT cDNA K1序列的1～1289bp的基因組DNA片段，設計合成一對引物，引物序列如下引物15’-GCACGGGTTAAGATCT-3’引物25’-GATAACCCACTGGAAG-3’引物1對應于人ACAT cDNA K1的982-997位核苷酸，引物2對應于人ACAT cDNA K1的1181～1196位核苷酸。將這對引物送往GenomicSystems，Inc.(St.Louis，MO)，利用PCR方法篩選人基因組DNA的P1文庫，得到一個陽性克隆P14651。
選用多種限制性內切酶對其進行單獨和組合酶切，1％瓊脂糖電泳，EB(溴化乙錠)染色，通過與標準分子量DNA(購自GIBCO BRL)比較來確定酶切產物的大小。大于4kb的片段經亞克隆后重新酶切以進一步確定其長度。最后獲得P1 4651中插入人基因組DNA的物理圖譜(見圖2)。合適的限制性酶切片段被亞克隆到pBluescript載體(Stratagene公司)中以備測序。以P1克隆或/和亞克隆片段為模板，得到DNA序列。測序方法按dsDNA cyclesequencing system kit(購自GIBCO BRL)。
詳細分析發(fā)現(xiàn)，P14651克隆中所插入的人基因組DNA包含了ACATcDNA K1的5’端外顯子及其上游序列近60kb和下游序列約23kb(圖2)。
實例2.含人ACAT-1基因P7啟動子的重組質粒的構建和序列分析根據(jù)P14651中插入人基因組DNA的物理圖譜，分離1.9kb的SacI-SacI片段、1.7kb的SacI-SacI片段和0.9kb的SacI-XhoI片段(這3個片段包含了人ACAT-1基因5’外顯子Xa及其上游2.5kb和下游0.7kb的序列，圖3)。將這些片段分別克隆入pBluescript SK(+/-)中，得到三個亞克隆pSK+D0，pSK+D1，pSK-D2(圖3)。在此基礎上，進一步進行酶譜和亞克隆分析，得到如圖3所示的一系列亞克隆。
以這些亞克隆為模板測序，方法按dsDNA cycle sequencing system kit(購自GIBCO BRL)。結果表明，P14651克隆包含對應于ACAT cDNA K1的3～1279bp的核苷酸序列，即ACAT cDNA K15′端1279bp序列片段為一個外顯子，命名為外顯子Xa。同時測定了其上游的612bp序列。在此所測定的片段序列中，集中了一些轉錄因子結合元件的特征序列這段序列中雖然沒有典型的TATA Box位點，但在-160bp和-575bp有兩個CCAAT Box；-5bp處有一個反向的TFIID結合位點特征序列；-29bp處一個Sp1結合位點，-135bp處是Ap2結合位點，-475bp處是Insulin增強子序列。說明這段序列是典型的轉錄啟動子區(qū)，將其命名為人ACAT-1基因P7啟動子，以區(qū)別于人ACAT-1基因P1啟動子。
實施例3.含人ACAT-1基因P7啟動子的真核表達質粒的構建為確定人ACAT-1基因P7啟動子的轉錄活性，利用高靈敏的熒光素酶報告基因載體pGL-E2，將人ACAT-1基因外顯子Xa上游序列分不同長度接在報告基因上游，構建了一系列真核表達質粒，參圖4。
實施例4.細胞培養(yǎng)、DNA轉染和人ACAT-1基因P7啟動子活性分析AC29細胞的培養(yǎng)參照文獻(K.M.Cadigan，J.G.Heider and T.Y.Chang，J.Biol.Chem.1988，263274-282)，在F12培養(yǎng)基(含10％FBS，10μg/mlstreptomycin，10u/ml penicillin)中，培養(yǎng)條件為濕度95％，5％CO2，37℃。
轉染前一天將細胞接種到直徑為35mm的六孔板，每孔細胞數(shù)為100,000-300,000，轉染時細胞豐度達30-80％。分別將pGL2-0.78-E(+)、pGL2-0.55-E、pGL2-A5-E、pGL2-0.66-E、pGL2-A6-E、pGL2-0.5-E、陽性對照質粒pGL2-C(含SV40啟動子)和陰性對照質粒pGL2-E(不含啟動子)以lipofectAMINE(GIBCO BRL)方法轉染CHO細胞突變株25-RA進行瞬時表達研究。轉染方法如下2μg樣品DNA加1μg內標質粒pCH110在200μl無血清F12培養(yǎng)基中，用5μl lipofectAMINE在室溫包裝45分鐘；此時細胞用PBS洗兩次。包裝好的DNA-脂質體混合物用無血清F12培養(yǎng)基稀釋到1ml，37℃轉染細胞5小時，然后換含10％FBS的F12培養(yǎng)基，44小時后收集細胞。
收集細胞測定luciferase活力，方法參照Promega公司的產品說明書。根據(jù)luciferase活性判斷其上游啟動子的轉錄活性，而共表達的β-半乳糖苷酶活性作為內標，用以校正因細胞培養(yǎng)的微環(huán)境(細胞密度、細胞微分布、培養(yǎng)瓶內壁等)不同而造成的轉染效率差異。相對熒光素酶活力的計算公式為 其中 測定時以熒光素酶基因上游不帶啟動子的pGL2-E作陰性對照，帶SV40啟動子的pGL2-C為陽性對照。同一批樣品之間的β-半乳糖苷酶基因轉染效率(β-半乳糖苷酶活力O.D.420/對應的蛋白量)的波動應小于1 5％，每一實驗作3份平行樣品。CHO細胞突變株AC29，其內源性ACAT活性不到野生型的1％，但能高表達外源的人ACAT-1基因。實驗結果(圖4)表明人ACAT-1基因外顯子Xa的上游612bp序列具有明顯的轉錄活性，將其命名為人ACAT-1基因P7啟動子；當插入片段的5’端從-612bp處縮短至-402bp時，其轉錄活性略有提高；當將3’端-65bp～+163bp的片段缺失掉時，轉錄活性均明顯增加，pGL2-A6-E轉化子表達的熒光素酶活性是pGL2-0.78-E(+)轉化子的將近兩倍。這些結果說明，上游-402bp～-65bp區(qū)段是ACAT遠端啟動子的主要轉錄活性區(qū)，在本實驗系統(tǒng)中，其轉錄活性約為SV40啟動子的三分之一。
類似方法轉染人A293細胞，得到相似結果。
實施例5.人ACAT-1基因P7啟動子轉錄起始位點的確定為確定ACAT基因5′端轉錄起始位點，設計了一長度為22個堿基的引物DP1，與外顯子Xa的71～92bp配對。
DP15’-ATCCCAGCACTTTAGGAGGCCG-3’參照SuperscriptTM II RNaseH-Reverse Transcriptase(GIBCO BRL)的使用說明書，1pmol的5′端標記的ACAT特異性引物DP1(5′-ATCCCAGCACTTTAGGAGGCCG-3′)與2μg人肝mRNA在70℃溫育10分鐘，然后在42℃逆轉錄反應50分鐘；同時以含有相應基因組DNA序列的亞克隆為模板，DP1為引物，用GIBCO BRL公司的dsDNA cycle sequencingsystem kit進行測序反應，產生序列l(wèi)adder。延伸產物和序列l(wèi)adder均在8％測序膠上進行電泳。所得結果與5’-RACE(rapid amplification of the cDNA5’-end)結果一致，表明圖5所示G是主要的轉錄起始位點。
權利要求
1.一種人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7，其特征在于該啟動子7具有下列DNA序列該序列1長度為-612～-1如下-612GAGCTCCACCTCCTGTCAAATCAGATTATCCAATCAGAAACAGCATTAGATTCTACAGTATGCCAAACCC -543AATTGTGAACTGTACATGCAAGGGATCTAGGTTGCATGCTCCTAATGAAAATCTAACTAGTGGAAAAACT -473GTCTTCCACGAAACCGGACCCTGGTGACAAAAAGGCTGGGGACCCCGATCTATGGCATTTGTGGAGAATT -403TTATGGCTAGCACACTTGGTAAACAAATTCAAAAGAAAACGAATCTTATCTCATTAAAAATGAACATATT -333TACATGCACAAACATAAGTTGGAATGGGGAAATTTATGTAGTTGGAAAATAGCTATTAAATGTAAACAAA -263CATAATTATAGTGTAGATTAAGGACTAGCAATCTTTTCAGAGGTAATAATAACACCAATGTTGTACATTC -193ATCCTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGCCTGGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGG -123CCCGATCTCGGCTCACTGCAACGTCCGCCTCCCAAGTTCATGCCATTCTCCTGGCTCAGCCTCTCGAGTA -53GCTGGGACTACAGGCACCCGCCACCACGTTTGGCGAATTTTTTGTATTTTTA -1
2.根據(jù)權利要求
1所述的啟動子7，其特征在于該啟動子7用于構建含有該啟動子7的重組DNA分子。
3.根據(jù)權利要求
2所述的啟動子7，其特征在于所述的重組DNA分子是帶有異源基因的重組表達載體。
4.根據(jù)權利要求
3所述的啟動子7，其特征在于所述的異源基因是報告基因。
5.根據(jù)權利要求
1所述的啟動子7，其特征在于該啟動子7用于構建含有該啟動子7的重組轉移載體。
6.根據(jù)權利要求
3所述的啟動子7，其特征在于所述重組表達載體在哺乳動物細胞中表達。
7.根據(jù)權利要求
6所述的啟動子7，其特征在于所述的哺乳動物細胞是人細胞。
8.一種人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7的應用，其特征在于該啟動子7在制備治療膽固醇相關疾病的藥物中作為靶。
專利摘要
本發(fā)明提供人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7。通過PCR方法篩選得到了P1噬菌體質粒陽性克隆，它含有人膽固醇酯合成酶-1(ACAT-1)外顯子Xa的基因組DNA片段，進一步亞克隆、序列測定和轉錄活性分析鑒定了人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7，該啟動子可用于篩選治療動脈粥樣硬化癥的藥物以及在哺乳動物細胞中表達異源蛋白。
文檔編號C12N15/113GKCN1151257SQ99113635
公開日2004年5月26日 申請日期1999年4月15日
發(fā)明者李伯良, 張大元, 段治軍, 李夏璐, 宋保亮, 何崇堯, 楊新穎 申請人:中國科學院上海生物化學研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan