專利名稱:一種用以促進神經(jīng)細胞生長的化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過促進神經(jīng)干細胞的再生與分化，以抑制神經(jīng)退化的化合物。
背景技術：
已知的神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NSCs)是指能夠進行自我更新修復，并能在體外培養(yǎng)條件下，通過一些刺激因子的刺激而分化為多種不同型態(tài)的細胞，例如神經(jīng)元細胞(Neurons)、星形膠質(zhì)細胞(Astrocytes)和少突膠質(zhì)細胞(Oligodendrocyte)。這些分化后的細胞對于哺乳動物中樞神經(jīng)的發(fā)育，以及在成年動物神經(jīng)系統(tǒng)的功能表現(xiàn)中都扮演著重要的角色。已知神經(jīng)干細胞已可從多種哺乳動物(例如小鼠、大鼠、豬和人類)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其發(fā)育至成熟的過程中被分離出來。其中，人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細胞，與其同源的嚙齒類動物類似。
哺乳類動物的神經(jīng)干細胞(neural stem cell)除存在于發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中外，同時也存在于成熟的器官中。雖然根據(jù)先前的研究報告指出，目前已可從胚胎干細胞衍生出神經(jīng)干細胞，但是內(nèi)生性神經(jīng)干細胞的調(diào)控機制，卻仍然了解有限。
對于神經(jīng)退化性疾病的治療來說，設法挽救已受損的神經(jīng)細胞，并同時刺激該神經(jīng)細胞的再生，是較為理想的治療策略。目前已有人通過使用神經(jīng)干細胞移植來嘗試修補受損的細胞，并且通過活化內(nèi)生性神經(jīng)干細胞以提供神經(jīng)細胞進行“自我更新”的可能。
雖然目前科學家對于神經(jīng)干細胞已有了一些初步的了解，但是若要將神經(jīng)干細胞應用于神經(jīng)細胞的修復上，則還需要一種可有效地控制其增生或分化成具有特定功能細胞的方法。根據(jù)以前多份研究報告顯示，神經(jīng)干細胞已經(jīng)可以在有生長因子的培養(yǎng)條件下進行增殖。這些生長因子目前已知包括堿性成纖維生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)及表皮生長因子(Epithelial Growth Factor，EGF)等。已知在無血清但含有前述生長因子的培養(yǎng)基中，在懸浮培養(yǎng)的狀態(tài)下，神經(jīng)干細胞會聚集形成所謂的“神經(jīng)球”(neurospheres)。另一方面，假若將這些生長因子去除，改為適量補充一些小分子的活性化合物、其它除堿性成纖維生長因子或表皮生長因子外的其它生長因子、或神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors)，神經(jīng)干細胞則可能會受刺激而分化，經(jīng)分化的細胞主要以星形膠質(zhì)細胞為主(90％以上)，僅有少部分會分化成為神經(jīng)元細胞(10％以下)。
另外，以前的研究結果表明，目前科學家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)營養(yǎng)因子，其包括有膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial-derived NeurotrophicFactor，GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin-3，NT3)、神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT4)，及血小板源性生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)等。這些神經(jīng)營養(yǎng)因子雖已被證實具有促進神經(jīng)細胞存活的活性，但是其在臨床上卻有許多使用上的限制。這是由于將這些神經(jīng)營養(yǎng)因子使用到活體中時，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子因為具有較大的分子量，因此并不易穿過血腦屏障(Blood BrainBarrier，BBB)而到達腦部。
因此，若能找出一些具有較小分子量且能活化內(nèi)生性神經(jīng)干細胞的化合物，用以促進神經(jīng)干細胞的增生并維持其特性，甚至是促進其分化成具有功能的神經(jīng)元細胞，這將有助于將神經(jīng)干細胞移植至宿主體內(nèi)，以提供做為退化性神經(jīng)疾病的有效預防或治療策略，并對一些具有神經(jīng)退化因子的個體提供預防的效果。

發(fā)明內(nèi)容為克服已知技術之缺點，本發(fā)明的目的是提供一種用以促進神經(jīng)細胞增生的化合物，其具有較小的分子量，因此易于穿過血腦屏障而到達腦部，進而得以抑制神經(jīng)細胞的死亡，并增加其存活率。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用以促進神經(jīng)干細胞分化的化合物，以促使神經(jīng)干細胞分化為具有特定功能的神經(jīng)元細胞。
為達到本發(fā)明的目的，根據(jù)本發(fā)明所指出的一種用以促進神經(jīng)細胞增生的化合物，其為具有如下式一所示化學結構式的異戊二烯類黃酮(prenylflavanones)化合物 其中，R1為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基(isoprene)；R2、R3、R4、R5、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、異戊二烯基(isoprene)、或如式二或式三所示香葉基(geranyl)。
已知，神經(jīng)細胞在低密度(160cells/mm2以下)的狀況下進行培養(yǎng)時，神經(jīng)細胞易于死亡，不易進行培養(yǎng)。而根據(jù)本發(fā)明所指出的化合物除可用以增進神經(jīng)細胞的存活率外，即使于低密度的培養(yǎng)狀況下，也可以顯著地減少神經(jīng)細胞的死亡。另外，本發(fā)明化合物也能用以促進神經(jīng)細胞的生長，例如可使得神經(jīng)突變粗及變長。此外，本發(fā)明化合物能用以促進神經(jīng)干細胞的形成，并能誘導其分化為神經(jīng)元細胞。
圖1為神經(jīng)干細胞添加含有本發(fā)明化合物與已知生長因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)后的外觀形態(tài)照相圖(A)化合物A；(B)化合物B；(C)化合物C；(D)化合物D；(E)化合物E；(F)化合物F；(G)化合物G；(H)化合物H；(I)空白空白對照組；(J)表皮生長因子；(K)神經(jīng)生長因子。
圖2為在培養(yǎng)基中添加本發(fā)明化合物對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞生長的影響的結果分析圖(*表示p＜0.0005)。
圖3為本發(fā)明化合物對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞以不同細胞密度進行培養(yǎng)時之影響的結果分析圖(*表示p＜0.005；**表示p＜0.05)(A)細胞密度300cells/mm2；(B)細胞密度150cells/mm2。
圖4為本發(fā)明化合物對神經(jīng)細胞的神經(jīng)突長度影響所得的照相圖(A)空白對照組；(B)化合物A；(C)化合物B；(D)化合物D；(E)化合物G。
圖5為用顯微鏡觀察神經(jīng)干細胞受誘導分化后的情形所得的照相圖，其中左排為熒光激發(fā)下的相片圖，右排是可見光下的細胞型態(tài)(A)先用化合物A培養(yǎng)，接著再用化合物A培養(yǎng)；(B)先用化合物A培養(yǎng)，之后用不添加任何生長因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)；(C)先用表皮生長因子培養(yǎng)，之后再用表皮生長因子培養(yǎng)；(D)先用表皮生長因子培養(yǎng)，之后用不添加任何生長因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
圖6為用顯微鏡觀察神經(jīng)干細胞受誘導分化后的情形所得的照相圖，其中左排為熒光激發(fā)下的相片圖，右排是可見光下的細胞型態(tài)(A)化合物D+表皮生長因子；(B)化合物D；(C)表皮生長因子；(D)不添加任何生長因子。
圖7為神經(jīng)干細胞經(jīng)培養(yǎng)30天后的外觀形態(tài)的照相圖(A)空白對照組；(B)加入化合物A；(C)加入化合物A，在熒光激發(fā)下的相片圖。
本發(fā)明將通過參考下列實施方式做進一步的說明，這里所述的實施方式并不限制本發(fā)明前面所公開的內(nèi)容。本領域的技術人員，可做些一些改良與修飾，但其仍不脫離本發(fā)明的范圍。
實施方式根據(jù)本發(fā)明所指出的一種用以促進神經(jīng)細胞增生的化合物，其是具有如下式一所示化學結構式的異戊二烯類黃酮化合物 其中，R1為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基(isoprene)；R2，R3，R4，R5，R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、異戊二烯基(isoprene)、或如式二或式三所示之香葉基(geranyl)。
本發(fā)明前述的異戊二烯類黃酮化合物，可通過已知有機化學合成技術合成，亦可通過自天然物中分離出具有近似化學結構的化合物，再經(jīng)用已知的化學修飾技術修飾部分官能團后獲得。
作為本發(fā)明前述異戊二烯類黃酮化合物具體的實施例，其具有如下的化學結構式 其中，R1、R2、R3、R5、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1~3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
或 其中，R1、R2、R3、R5、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
或 其中，R1、R2、R3、R4、R5與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1~3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
或 其中，R1、R2、R3、R4、R5與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1~3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
或
其中，R1、R2、R3、R4、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基，或異戊二烯基。
或 其中，R1、R2、R3、R4、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基，或異戊二烯基。
或
其中，R1、R3、R4、R5、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1~3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
或 其中，R1、R3、R4、R5、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1~3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
作為本發(fā)明前述用以促進神經(jīng)細胞增生的化合物更進一步的實施例，其具有如下化學結構式化合物A(Propolin A)
化合物B(Propolin B) 化合物C(Propolin C) 化合物D(Propolin D)
化合物E(Propolin E) 化合物F(Propolin F) 化合物G(Propolin G) 化合物H(Propolin H)
根據(jù)本發(fā)明所指出的化合物具有如下的特點(1)本發(fā)明化合物能在低密度(160cells/mm2以下)神經(jīng)細胞的培養(yǎng)條件下，顯著地促進神經(jīng)細胞(例如腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞)的生長，以提高神經(jīng)細胞的存活率。
(2)在對神經(jīng)細胞生長與發(fā)育的影響上，本發(fā)明化合物可顯著地比用堿性成纖維生長因子或表皮生長因子處理獲得更粗、更長及更多分支的神經(jīng)突。
(3)在促進神經(jīng)干細胞的生成方面，用本發(fā)明化合物進行處理，顯著比用堿性成纖維生長因子或表皮生長因子處理，更能促進神經(jīng)干細胞的生成，并且能維持這種球狀特性在體外培養(yǎng)的情況下存活至少30天，而這些神經(jīng)干細胞可以被誘導分化為神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞及少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞。
(4)本發(fā)明化合物可用以誘導生成以神經(jīng)元干細胞(neuronal stemcells)為主的神經(jīng)干細胞(neural stem cells)，并促使這些干細胞進一步分化為神經(jīng)元細胞(neurons)。另外，本發(fā)明化合物與已知的生長因子(growth factors)不同，因此在應用上可通過共同使用堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor)，以進行神經(jīng)干細胞的增生以有效地將神經(jīng)干細胞量化，以此即可以大量地獲得神經(jīng)元干細胞，以未來可應用于治療退化性神經(jīng)疾病的細胞療法。
由于本發(fā)明化合物具有前述的功能及特點，因此本發(fā)明化合物可作為于體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的添加劑，與前述已知技術所使用的大分子蛋白質(zhì)(例如，表皮生長因子、堿性纖維母細胞生長、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、神經(jīng)營養(yǎng)因子4，及血小板源性生長因子等)不同，本發(fā)明化合物中的異戊二烯類黃酮化合物為分子量較小的小分子物質(zhì)，其可以在培養(yǎng)液內(nèi)較久地維持其特性(大約7～9天換一次培養(yǎng)基即可)。此外，本發(fā)明化合物可誘導神經(jīng)干細胞顯著地分化為神經(jīng)元細胞。另外，本領域的技術人員，通過閱讀本發(fā)明說明書后也可得知，本發(fā)明化合物中也可進一步包含一生長因子，用于培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，以促使其增生。前述的生長因子在本發(fā)明中可舉出的例子包含表皮生長因子、堿性成纖維生長因子和神經(jīng)生長因子，但并不僅限于此。這對于一些神經(jīng)學方面的研究是一個更好的且新興的實驗用無血清的細胞培養(yǎng)添加劑。
另外，已知小分子物質(zhì)較易通過血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)而到達腦細胞，而目前美國食品及藥物管理局(Food and DrugAdministration，F(xiàn)DA)正積極進行關于人體干細胞移植治療方式的認可，尤其是關于神經(jīng)退化性疾病方面的治療，而本發(fā)明化合物中所包含的異戊二烯類黃酮為小分子的物質(zhì)，且其可在無血清的培養(yǎng)基中促進具有功能性的神經(jīng)元細胞的形成，并可以在低細胞密度的情況下促進神經(jīng)細胞的生存，因此本發(fā)明化合物所具有的這些特性，對于輔助前述人體干細胞移植的治療來說，將可提供很大的幫助。
此外，本發(fā)明的技術人員，也可通過閱讀前述的說明而了解到，本發(fā)明化合物可進一步通過已知的技術開發(fā)成為一醫(yī)藥化合物。
實施例1配制培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的生長培養(yǎng)基，其為在B-27無血清神經(jīng)細胞培養(yǎng)基(B-27 supplemented neurobasal medium，Gibco)中添加青霉素G(penicillin G)、硫酸鏈霉素(streptomycin sulphate)及0.5mM的谷氨酸(L-glutamine，Gibco)。
在麻醉狀態(tài)下從懷孕16天的母鼠(Wistar)腹腔中取出在胎囊中的未出生的胎鼠。取出胎鼠的大腦組織，用0.1％胰蛋白酶溶液(trypsinsolution)在25℃下作用1分鐘。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS solution)洗滌3次后，用已知的機械方式上下混合使其細胞打散。之后，將前述含有胎鼠大腦組織細胞的溶液通過70μm尼龍細胞濾網(wǎng)(nylon cell strainer，F(xiàn)alcon)，以將神經(jīng)干細胞釋放到溶液中。之后將此溶液以1000rpm的轉速離心10分鐘，再用前述培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的生長培養(yǎng)基置換，這樣即可獲得包含神經(jīng)干細胞細胞群的懸浮液。
將前述神經(jīng)干細胞的懸浮液以150,000cells的細胞量放置于培養(yǎng)皿(Petri dish)上，并將其在37℃、5％CO2，以及相對濕度95％的環(huán)境下進行培養(yǎng)，以培養(yǎng)神經(jīng)干細胞。培養(yǎng)細胞的生長培養(yǎng)基每三天更換1次，每次更換一半的培養(yǎng)液。
進行實驗時，將前述神經(jīng)干細胞以300cells/mm2的細胞量放置于裝載有神經(jīng)干細胞的生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。其中，在空白對照組的生長培養(yǎng)基中進一步添加表皮生長因子(5ng/mL)、堿性成纖維生長因子(5ng/mL)或神經(jīng)生長因子(5ng/mL)。而實驗組的生長培養(yǎng)基中則分別加入本發(fā)明化合物A～H?？瞻讓φ战M的生長培養(yǎng)基中則加入5μL的二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)。之后，在上述培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)七天后用顯微鏡觀察懸浮神經(jīng)干細胞的大小、外型態(tài)和存活率。所得結果示于圖1。
結果顯示，本發(fā)明化合物A～H、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子都可以使得神經(jīng)干細胞聚集成球狀(神經(jīng)球)，且比空白對照組所形成的神經(jīng)球要大。由此可明顯地看出本發(fā)明化合物可與已知生長因子達到相同促進神經(jīng)干細胞生長的目的。也就是，本發(fā)明化合物對于神經(jīng)干細胞球狀物的增生有促進的效果。
實施例2將實施例1中所得的神經(jīng)干細胞以300cells/mm2的細胞量培養(yǎng)在已吸附30μg/mL多聚賴氨酸(poly-D-lysine，Sigma)的6孔培養(yǎng)盤中，在37℃、5％CO2，以及相對濕度95％的環(huán)境下進行培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)分化而成的細胞統(tǒng)稱為大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞(cortical neurons)。
將前述的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞分別培養(yǎng)于含有10μM化合物A、化合物B、化合物D、化合物E、化合物F、化合物G和化合物H的生長培養(yǎng)基中，重復進行三次試驗。另外，對照組的生長培養(yǎng)基中加入5μL的二甲基亞砜。經(jīng)培養(yǎng)五天后，用已知計數(shù)活細胞數(shù)目的方法進行細胞計數(shù)(MTT assay)，并在540nm吸光值進行結果的分析，結果示于圖2。
通過圖2所得的結果顯示，實驗組的吸光值顯著地比空白對照組的高，其中又以化合物A、D與G的效果最好。此結果顯示本發(fā)明化合物確實能顯著地增加大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的存活率。
實施例3將實施例1中所得的神經(jīng)干細胞分別以不同的細胞密度(150,300cells/mm2)的細胞量培養(yǎng)在已吸附30μg/mL多聚賴氨酸(poly-D-lysine，Sigma)的6孔培養(yǎng)盤中，在37℃、5％CO2，以及相對濕度95％的環(huán)境下進行培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)分化而成的細胞統(tǒng)稱為大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞(cortical neurons)。
將前述大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞分別培養(yǎng)于含有化合物A、D與G的生長培養(yǎng)基中，重復進行三次試驗。另外，取5μL的二甲基亞砜加入生長培養(yǎng)基中，作為對照組。培養(yǎng)五天后，以已知計數(shù)活細胞數(shù)目的方法進行細胞計數(shù)(MTT assay)，并于540nm吸光值進行結果的分析，結果示于圖3。已知大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞以640cells/mm2的細胞密度培養(yǎng)于生長培養(yǎng)基中時，細胞的存活率可高于90％，而以160cells/mm2的細胞密度培養(yǎng)時，細胞的存活率會降至約50％。因此當培養(yǎng)時細胞密度低于160cells/mm2時，若沒有適時添加任何生長因子，則細胞的死亡率將會大幅地增加。這是由于在這種情況下，會由于細胞數(shù)太少使得細胞和細胞間的距離相隔太遠，而致使細胞和細胞間不易進行生長因子的傳遞。
由圖3所得的結果顯示，添加有本發(fā)明化合物的實驗組中，不論起始培養(yǎng)的細胞密度如何，其所得的吸光值均顯著地比對照組的高，此結果顯示本發(fā)明化合物的添加，可顯著地改善在低細胞密度下進行培養(yǎng)之神經(jīng)細胞的存活率。
實施例4
將實施例1中所得的神經(jīng)干細胞以38cells/mm2的細胞量培養(yǎng)于已吸附30μg/mL多聚賴氨酸(poly-D-lysine，Sigma)的6孔培養(yǎng)盤中，在37℃、5％CO2，以及相對濕度95％的環(huán)境下進行培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)分化而成的細胞統(tǒng)稱為大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞(cortical neurons)。
將前述將大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)在含有本發(fā)明化合物A、B、D與G的培養(yǎng)基中。另外，取5μL的二甲基亞砜加入生長培養(yǎng)基中，以作對照組。經(jīng)培養(yǎng)五天后，用顯微鏡進行細胞觀察并計算神經(jīng)突(neurite)的長度，所得結果示于圖4。
參考圖4，完全不加入任何生長因子的空白對照組，在顯微鏡下可觀察到其神經(jīng)元本體(soma)的萎縮，神經(jīng)細胞完全死亡的情況(圖4A)，所以其所測得的神經(jīng)突的長度為零。然而，實驗組經(jīng)分別加入化合物A2.5μM、化合物B 5μM、化合物D 5μM和化合物G 5μM后，在顯微鏡下可觀察到實驗組中的神經(jīng)元細胞持續(xù)生長，且神經(jīng)突向外伸長，并可觀察到一個神經(jīng)元本體至少有三條以上的神經(jīng)突伸出，而且其中一條會變長且尾端分岔為多個神經(jīng)突觸。對神經(jīng)突長度進行分析，加入化合物A后，神經(jīng)突L1長度為236μm、神經(jīng)突L2長度為161μm(圖4B)；加入化合物B后，神經(jīng)突L1長度為235μm(圖4C)；圖片D中加入化合物B后，神經(jīng)突L1長度為211μm(圖4D)；圖片E中加入化合物B后，神經(jīng)突L1長度為316μm、神經(jīng)突L2長度為216μm(圖4E)。
由此結果可以得知本發(fā)明化合物能在低細胞濃度(38cells/mm2)下，促進神經(jīng)細胞的存活，并促使其神經(jīng)突伸長，且發(fā)育為成熟的神經(jīng)元細胞。實施例5從實施例1所得的細胞懸浮液中取出100μL，將其稀釋成1mL。接著，吸取250μL的上清液培養(yǎng)在已吸附30μg/mL多聚賴氨酸(poly-D-lysine，Sigma)的載玻片上，依前述的培養(yǎng)條件培養(yǎng)3天后，以使其分化成大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞(cortical neurons)。最后通過已知的免疫熒光染色法進行染色。進行免疫熒光染色時，使用可與神經(jīng)元細胞專一性結合的抗MAP2做為一抗，以及使用可識別一抗的含熒光基質(zhì)的老鼠免疫球蛋白抗體做為二抗。當神經(jīng)元細胞被一抗識別后會使得神經(jīng)元細胞在熒光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光。
在開始培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時即加入化合物A或是表皮生長因子，而后取出神經(jīng)干細胞貼在載玻片上，然后在細胞都貼附在玻片上后，移除細胞液重新加入含有化合物A或表皮生長因子的培養(yǎng)液中，或不添加任何生長因子的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)三天后使用免疫熒光染色觀察細胞型態(tài)。
參考圖5，左排為熒光激發(fā)下的相片圖(白光的為神經(jīng)元細胞，圖中陰影的部份為死亡的細胞或是為非神經(jīng)元細胞，右排是可見光下的細胞型態(tài)，其可顯現(xiàn)此視野下的所有細胞。因此從第五圖的結果中可實際觀察看到，當一開始培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時即加入化合物A，無論以后細胞分化成大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞時有沒有加入化合物A，都會使得神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元細胞(圖5A、B)，而當細胞加入表皮生長因子時，會使得神經(jīng)細胞增生(圖5C)，但是其長出來的大多是非神經(jīng)元細胞，而即便之后不再提供表皮生長因子，細胞長出來的大多也是非神經(jīng)元細胞只是比繼續(xù)加入的少(圖5D)。由此可得知表皮生長因子雖可用以促進神經(jīng)細胞的增生，使其存活率增加，但其所增生的細胞大多為非神經(jīng)元細胞的前體細胞，但本發(fā)明化合物除可增加神經(jīng)干細胞的存活外，還可進一步影響其分化，使其向神經(jīng)元細胞發(fā)育。
實施例6實驗操作同實施例6，但在開始培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時，改為添加化合物D并同時使用表皮生長因子，而后取出干細胞貼在載玻片上，然后待細胞都貼附在玻片上后，移除細胞液重新加入含有化合物D，或表皮生長因子，或加入不含任何生長因子的培養(yǎng)液，或加入化合物D并同時使用表皮生長因子，培養(yǎng)三天后使用免疫熒光染色觀察細胞型態(tài)。
參考圖6，左排為熒光激發(fā)下的相片圖(白光的為神經(jīng)元細胞，圖中陰影的部份為死亡的細胞或是為非神經(jīng)元細胞，右排是可見光下的細胞型態(tài)，其可顯現(xiàn)此視野下的所有細胞。因此從圖6的結果中可實際觀察到，如果一開始培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時即加入化合物D以及表皮生長因子，可觀察到神經(jīng)干細胞顯著增生的狀況，并且在分化后向神經(jīng)元細胞發(fā)育(圖6A)。而當細胞分化成大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞后，僅加入表皮生長因子的，其細胞會分化成非神經(jīng)元細胞(圖6C)，而含有化合物D的，則會促使其神經(jīng)干細胞分化成為神經(jīng)元細胞(圖6B)。另外，當細胞分化成大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞后，不再加入任何生長因子的，也可使神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元細胞，但其神經(jīng)元細胞的數(shù)量會比再加入化合物D的少(圖6D)。由此可知表皮生長因子可以促進神經(jīng)細胞的增生，如果同時使用本發(fā)明化合物則會使得較多的細胞向神經(jīng)元細胞發(fā)育。由此實驗結果可進一步得知，當神經(jīng)干細胞在發(fā)育時加入了本發(fā)明化合物，將可使得神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元干細胞(neuronal stem cells)方向發(fā)育。
實施例7取由實施例1中用化合物A所培養(yǎng)出的神經(jīng)干細胞進行連續(xù)培養(yǎng)，每七天更換一次培養(yǎng)基。另外，以二甲基亞砜做為空白對照組。在培養(yǎng)至第三十天時，吸出100μL神經(jīng)干細胞的細胞液，將其稀釋至1mL。之后，吸取250μL上清液，將其培養(yǎng)于已吸附30μg/mL多聚賴氨酸(poly-D-lysine，Sigma)的載玻片上，用顯微鏡觀察神經(jīng)干細胞的外觀型態(tài)，所得結果示于圖7。
參考圖7，由圖7可以看到完全不加入任何生長因子的對照組(圖7A)中幾乎沒有存活的細胞，且無法呈現(xiàn)正常神經(jīng)干細胞會聚集成球狀的特性，細胞懸浮培養(yǎng)時已呈現(xiàn)萎縮的狀態(tài)。而加入化合物A培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞則仍可維持其聚集成球狀的特性(圖7B)，并將此細胞持續(xù)培養(yǎng)三天后用如同實施例5的免疫熒光染色法進行染色，在顯微鏡下仍可看到神經(jīng)干細胞可正常地分化為神經(jīng)元細胞，并持續(xù)進行神經(jīng)突的生長(圖7C)。
綜合上述實施例可知，本發(fā)明化合物可用于長時間培養(yǎng)神經(jīng)干細胞并能維持其聚集成球狀的特性，并仍能使神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元細胞分化。另一方面，本發(fā)明化合物可在連續(xù)培養(yǎng)時，可以每七天更換一次培養(yǎng)基的狀況下進行長時間的培養(yǎng)，且可以培養(yǎng)神經(jīng)干細胞使其存活超過三十天以上。然而，已知的生長因子，一般約3～4天即需更換一次培養(yǎng)基，這是由于已知生長因子皆為大分子蛋白質(zhì)，因此易于在常溫下失去活性，而本發(fā)明小分子化合物的特性則不受此因素的影響。
權利要求
1.一種用以促進神經(jīng)細胞生長的化合物，其中該化合物具有如下式一所示的化學結構式 其中，R1是氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基(isoprene)；而R2、R3、R4、R5、R6與R7分別為氫、羥基、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、異戊二烯基(isoprene)、或具有如式二或式三所示的香葉基(geranyl) (式二) (式三)。
2.權利要求
1所述的化合物，其中該化合物中的R2為如式二或式三所示的香葉基(geranyl)，而R1、R3、R4、R5、R6與R7分別為氫(-H)、羥(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
3.權利要求
1所述的化合物，其中該化合物中的R4為如式二或式三所示的香葉基(geranyl)，而R1、R2、R3、R5、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
4.權利要求
1所述的化合物，其中該化合物中的R5為如式二或式三所示的香葉基(geranyl)，而R1、R2、R3、R4、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
5.權利要求
1所述的化合物，其中該化合物中的R6為如式二或式三所示的香葉基(geranyl)，而R1、R2、R3、R4、R6與R7分別為氫(-H)、羥基(-OH)、1～3個碳的直鏈或支鏈烷基、或異戊二烯基。
6.權利要求
1所述的化合物，其中該化合物能刺激神經(jīng)干細胞分化成為神經(jīng)元細胞。
7.一種培養(yǎng)基的添加物，其包含權利要求
1所述的化合物。
8.如權利要求
7所述的添加物，其中該培養(yǎng)基為培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基。
9.權利要求
8所述的添加物，其中該細胞為神經(jīng)干細胞。
10.權利要求
7所述的添加物，其中該培養(yǎng)基進一步包含一生長因子。
11.權利要求
10所述的添加物，其中該生長因子選自表皮生長因子、堿性纖維母細胞生長，及神經(jīng)生長因子所組成的組。
12.一種用以刺激神經(jīng)干細胞分化的醫(yī)藥組合物，其包含權利要求
1所述的化合物。
專利摘要
一種用以促進神經(jīng)細胞生長發(fā)育及神經(jīng)干細胞生成的化合物，其是具有如右式一所示化學結構式的異戊二烯類黃酮(prenylflavanones)化合物。本發(fā)明化合物可用以增加神經(jīng)細胞的存活率，并能在低密度神經(jīng)細胞的培養(yǎng)條件下，顯著地增加神經(jīng)細胞的存活率。另外，在神經(jīng)細胞生長發(fā)育方面，本發(fā)明化合物能促進神經(jīng)細胞的生長，使得神經(jīng)纖維變粗及變長，并增加其分支。此外，本發(fā)明化合物能促進神經(jīng)干細胞(neural stemcells)的形成并且進一步研究發(fā)現(xiàn)所生成的干細胞為神經(jīng)元干細胞(neuronal stem cells)，并能誘使其分化為神經(jīng)元細胞(neurons)。
文檔編號C12N5/0797GK1990480SQ200510097522
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日
發(fā)明者黃中洋, 陳嘉南, 賀婉如 申請人:彥臣生技藥品股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan