專利名稱:一種廣譜抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的蚯蚓蛋白及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及蚯蚓中一種可廣譜抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，以及由此多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)序列，此外，還涉及所述蛋白質(zhì)的制備方法及其抑癌活性等。
背景技術(shù)：
蚯蚓俗稱地龍，具有解熱、鎮(zhèn)驚、降壓、抑菌及活血化瘀等功效，已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)中藥中治療多種疾病。到了上世紀(jì)80年代，又陸續(xù)報(bào)道蚯蚓抽提物對(duì)多種癌細(xì)胞具有抑制作用，并在初步臨床應(yīng)用中取得了一定的抑癌效果(第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1986，7(2)85；中國(guó)腫瘤臨床，1991，18(2)131；山西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，26(2)81；生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2002，34(5)576)。
但是，對(duì)蚯蚓中抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的有效成份及其作用機(jī)理卻至今未見(jiàn)報(bào)道。鑒于蚯蚓中抑癌成分的潛在應(yīng)用前景，迫切需要對(duì)其進(jìn)行基礎(chǔ)及開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供蚯蚓中一種可廣譜抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供制備所述蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述蛋白質(zhì)的抑癌用途及其它用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的蚯蚓EFE6多肽，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑癌功能的由(a)衍生的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，該多肽是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼所述多肽的多核苷酸；或(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸可以是對(duì)編碼所述多肽的基因進(jìn)行人工定點(diǎn)突變后所獲得的基因突變體的DNA核苷酸序列。
本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。
本發(fā)明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體。
本發(fā)明的第五方面，提供一種多肽的制備方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；或(b)從培養(yǎng)物中分離出蚯蚓EFE6多肽。
本發(fā)明的第六方面，提供一種能與所述的蚯蚓EFE6多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的第七方面，提供一種藥物組合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明所述的蚯蚓EFE6多肽的用途，它被用于(a)制備治療癌癥的藥物；(b)制備具有酯酶活性的藥物；或(c)制備具有纖維蛋白溶解活性的藥物。
本發(fā)明的其它方面由于本文技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案。
圖1顯示了從蚯蚓中分離的廣譜抑癌蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜，其中泳道1為抑癌蛋白質(zhì)，泳道2為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)。
圖2顯示了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)在HPLC中的層析圖譜。
圖3顯示了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的PCR擴(kuò)增條帶，泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖4顯示了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖5顯示了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)在原核表達(dá)載體(PGEX4T-1)中的構(gòu)建過(guò)程。
圖6顯示了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜(圖6A)和Western圖譜(圖6B)。
圖7顯示了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)對(duì)幾種癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首先從蚯蚓中分離得到一種廣譜抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，基于此完成了本發(fā)明。
更具體的，本發(fā)明人首先從威廉腔環(huán)蚓(Metaphire guillelmi)抽提物中分離到一種分子量24744.67道爾頓的廣譜抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，測(cè)定了此蛋白質(zhì)N端的一段氨基酸序列為NH2-I-L-G-G-Q-D-A-S-P-G-(SEQ ID NO3)，并以此為依據(jù)合成了相應(yīng)的引物，然后從蚯蚓中分離有關(guān)的mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用PCR法擴(kuò)增和克隆了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的基因，測(cè)定了此基因的全序列，然后將蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的編碼序列插入合適載體并轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞中，表達(dá)及分離重組的蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)，并通過(guò)Westren印跡分析加以鑒定。本發(fā)明人將此蛋白命名為“EFE6蛋白”。
本發(fā)明人除了從威廉腔環(huán)蚓中分離純化得到了所述抑癌蛋白質(zhì)外，還從其它的蚯蚓品種中分離得到了所述抑癌蛋白質(zhì)，例如，赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafoetida)等。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“EFE6蛋白”、“EFE6多肽”或“蚯蚓抑癌蛋白EFE6”可互換使用，都指具有蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)EFE6氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)EFE6。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的EFE6蛋白或多肽”是指EFE6多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化EFE6蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。EFE6多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括EFE6蛋白的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然EFE6蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白質(zhì)原序列，或與抗體IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“EFE6多肽”指具有EFE6蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與EFE6蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括了EFE6蛋白的活性片段和/或活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與EFE6 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)、以及利用抗EFE6多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含EFE6多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了EFE6多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EFE6多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供EFE6蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然EFE6多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“EFE6蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ IDNO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼EFE6蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的EFE6核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白質(zhì)序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或EFE6蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的EFE6多肽。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼EFE6多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，EFE6多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J BioChem.2633521，1988)和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含EFE6編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門(mén)氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白質(zhì)。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白質(zhì)沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的EFE6蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療因類(lèi)似EFE6蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笶FE6蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組EFE6蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激EFE6蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)EFE6 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于EFE6基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與EFE6基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制EFE6蛋白的分子，也包括那些并不影響EFE6蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的EFE6基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的EFE6基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)EFE6蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類(lèi)單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature.256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷EFE6蛋白功能的抗體以及不影響EFE6蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類(lèi)抗體可以利用EFE6基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與EFE6基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
抗EFE6蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的EFE6蛋白。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與EFE6蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷EFE6蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計(jì)成針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如EFE6蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過(guò)二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅EFE6蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用EFE6蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白質(zhì)，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與EFE6蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白質(zhì)及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果，尤其是可用于抑制腫瘤或腫瘤細(xì)胞(體內(nèi)或體外)的生長(zhǎng)。
腫瘤例子包括但并不限于各種實(shí)體腫瘤，如肺癌、小細(xì)胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睪丸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮頸癌。較佳地，所述的腫瘤選自下組肺癌、肝癌、乳房癌、或前列腺癌。
通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于癌癥方面的治療。在使用本發(fā)明EFE6蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑，如紫杉醇等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明EFE6多肽以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的EFE6蛋白施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
EFE6蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于EFE6蛋白的無(wú)表達(dá)或異常/無(wú)活性的EFE6蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)成表達(dá)變異的EFE6蛋白，以抑制內(nèi)源性的EFE6蛋白活性。來(lái)源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將EFE6基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶EFE6基因的重組病毒載體的方法可見(jiàn)于已有文獻(xiàn)(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)。另外重組EFE6基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制EFE6 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過(guò)編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過(guò)載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與EFE6蛋白結(jié)合的多肽分子可通過(guò)篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫(kù)而獲得。篩選時(shí)，必須對(duì)EFE6蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)EFE6蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的EFE6蛋白水平，可以用作解釋EFE6蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷EFE6蛋白起作用的疾病。
一種檢測(cè)樣品中是否存在EFE6蛋白的方法是利用EFE6蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與EFE6蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在EFE6蛋白。
EFE6蛋白的多聚核苷酸可用于EFE6蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，EFE6蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)EFE6蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下EFE6蛋白的異常表達(dá)。如EFE6 DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷EFE6蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開(kāi)的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用EFE6蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)EFE6蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)EFE6基因的突變也可用于診斷EFE6蛋白相關(guān)的疾病。EFE6蛋白突變的形式包括與正常野生型EFE6 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本發(fā)明EFE6蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見(jiàn)于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過(guò)與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過(guò)連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。更具體的，本發(fā)明人首先從威廉腔環(huán)蚓(Metaphire guillelmi)抽提物中分離到一種分子量24744.67道爾頓的廣譜抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，測(cè)定了此蛋白質(zhì)N端的一段氨基酸序列為NH2-I-L-G-G-Q-D-A-S-P-G-(SEQ ID NO3)，并以此為依據(jù)合成了相應(yīng)的引物，然后從蚯蚓中分離有關(guān)的mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用PCR法擴(kuò)增和克隆了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的基因，測(cè)定了此基因的全序列，然后將蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的編碼序列插入合適載體并轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞中，表達(dá)及分離重組的蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)，并通過(guò)Westren印跡分析加以鑒定。本發(fā)明人將此蛋白命名為“EFE6蛋白”。
本發(fā)明人除了從威廉腔環(huán)蚓中分離純化得到了所述抑癌蛋白質(zhì)外，還從其它的蚯蚓品種中分離得到了所述抑癌蛋白質(zhì)，例如，赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafoetida)等。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可為治療癌癥相關(guān)疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
本發(fā)明所述的蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)EFE6的其它生物活性，是指該蛋白質(zhì)還具有水解BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)的酯酶活性和水解纖維蛋白及纖維蛋白原的纖維蛋白溶解活性。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于從繁雜的蚯蚓抽提物中純化到單一純度的抑癌蛋白質(zhì)，此抑癌蛋白質(zhì)對(duì)培養(yǎng)的正常細(xì)胞是無(wú)毒或低毒的。本發(fā)明同時(shí)克隆到蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的基因，分析測(cè)定了基因序列，并成功地進(jìn)行了表達(dá)，這不僅為開(kāi)發(fā)研究蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造了良好的條件，也為開(kāi)發(fā)蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)針劑應(yīng)用于臨床治療腫瘤疾病提供了必要的化學(xué)結(jié)構(gòu)資料，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 從蚯蚓中分離純化天然的抑癌蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明人主要采用了威廉腔環(huán)蚓進(jìn)行抽提并分離純化，獲得了具有抑癌活性的組份。此外還采用了赤子愛(ài)勝蚓，也獲得了相同的結(jié)果。
以威廉腔勝蚓為例，取鮮活蚯蚓若干，洗凈后經(jīng)機(jī)械搗碎，加入冰冷的丙酮或乙醇脫水，所得沉淀晾干，即為粗蚯蚓粉，儲(chǔ)藏-20℃冰箱中備用。
取粗蚯蚓粉若干，加兩倍體積的水浸泡過(guò)夜，次日以5000rmp冷凍離心，收集上清液并裝入透析袋對(duì)水透析24h，再在5000rmp離心，上清液經(jīng)冷凍干燥成凍干粉，純化時(shí)取凍干粉少許以緩沖液溶解，然后經(jīng)離子交換和凝膠過(guò)濾層析分離，得到單一的抑癌蛋白質(zhì)組份，具體地，依據(jù)下列兩種鑒定方法確定為單一組份。
本發(fā)明人對(duì)獲得的抑癌蛋白質(zhì)組份進(jìn)行了HPLC分析，結(jié)果為單一峰，見(jiàn)圖2。
本發(fā)明人對(duì)獲得的抑癌蛋白質(zhì)組份進(jìn)行了SDS-PAGE分析為單一條帶，見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2 蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)N-端10個(gè)氨基酸序列測(cè)定純化的蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)樣品在PE491蛋白質(zhì)測(cè)序儀上經(jīng)過(guò)10個(gè)循環(huán)，測(cè)得的N-端氨基酸序列為ILGGQDASPG。
實(shí)施例3 引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)實(shí)施例2測(cè)得的蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的N-端序列，設(shè)計(jì)上游寡核苷酸兼并引物為5’AT(T/C/A)CT(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)CA(A/G)GA(T/C)GC3’(SEQ ID NO4)(括號(hào)內(nèi)為兼并核苷酸)，由于缺乏蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的C-端氨基酸序列信息，下游引物選用OligdT20，引物合成委托上海生工生物工程公司完成。
實(shí)施例4 總RNA的提取取蚯蚓體腔內(nèi)組織100mg，在液氮中研磨成粉，加1ml Trizol試劑繼續(xù)研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，4℃，12000g離心10min，上清液吸入新的離心管，25℃水浴5min，加入0.2ml氯仿，充分振蕩15s，25℃水浴5min，4℃12000g離心15min，取上層水相加0.5ml異丙醇，25℃水浴10min，4℃12000g離心10min，收集沉淀，用1ml 75％乙醇洗滌，4℃7500g離心5min，敞口于空氣中干燥5-10min，使乙醇充分揮發(fā)，加入100μl水溶解，58℃水浴10min，-70℃保存。
實(shí)施例5 RT-PCR擴(kuò)增蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)基因以實(shí)施例4中制得的蚯蚓總RNA為模板，利用Invitrogen公司的試劑盒(kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
使用實(shí)施例3中的合成引物，從上述所得cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系25μl，其中模板1μl，上游引物2μl(250pM/μl)，OligdT(10pM/μl)0.5μl，高保真酶0.5μl(5u/μl)，dNTP(2.5mM)2μl，反應(yīng)條件是先94℃變性3min，然后進(jìn)入循環(huán)，94℃25s，51℃退火45s，72℃延伸1.5min，進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10min，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳檢查，擴(kuò)增出一條約1000bp的DNA片膠，見(jiàn)圖3。產(chǎn)物以氯仿抽提，乙醇沉淀回收，溶于10μl的滅菌水中。
實(shí)施例6 蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的基因克隆。
取PCR回收產(chǎn)物2μl與T-載體1μl連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，酶切和PCR鑒定，獲得陽(yáng)性克隆。
實(shí)施例7 蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)基因的鑒定實(shí)施例6中獲得的陽(yáng)性克隆委托博亞公司測(cè)定，基因全序列和編碼的蛋白質(zhì)序列見(jiàn)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，或見(jiàn)圖4。該成熟蛋白的cDNA編碼717個(gè)核苷酸(序列中未列出起始密碼子和終止密碼子)，即239個(gè)氨基酸。
經(jīng)電腦軟件分析該蛋白質(zhì)的分子量為24744.67，等電點(diǎn)為4.28。
實(shí)施例8 兔抗蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)抗體的制備取體重為2公斤左右的雄性新西蘭大耳兔一只，以1mg蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)樣品加弗氏完全佐劑研磨成乳膠狀，在兔頸部多點(diǎn)注射，飼養(yǎng)半個(gè)月后，以1mg蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)加弗氏不完全佐劑研成乳膠狀，再在兔頸部多點(diǎn)注射，一個(gè)月后再1mg蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)加弗氏不完全佐劑再次加強(qiáng)免疫，飼養(yǎng)半個(gè)月后頸動(dòng)脈取血，4℃靜置過(guò)夜，2000轉(zhuǎn)離心3分鐘，上清液為兔抗蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)抗體。
實(shí)施例9 蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的基因表達(dá)和鑒定為核實(shí)該基因所編碼的蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)就是天然提取的蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)，將該基因的翻譯區(qū)克隆到原核表達(dá)載體PGEX4T-1(購(gòu)自Pharmacia Biotech)的EcoRI和XholI酶切位點(diǎn)中，見(jiàn)圖5。然后將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中并誘導(dǎo)基因表達(dá)。
用實(shí)施例8中制得的兔抗蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)抗體與表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE圖譜和Western雜交鑒定。
結(jié)果見(jiàn)圖6，由結(jié)果可見(jiàn)，所表達(dá)的蛋白質(zhì)與蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)抗體能夠?qū)Ｒ恍缘亟Y(jié)合。
實(shí)施例10 蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)對(duì)多種培養(yǎng)的癌細(xì)胞的抑制作用在本實(shí)施例中，分別選用了下列幾種常規(guī)的癌細(xì)胞進(jìn)行抑制試驗(yàn)SMCC7721(人肝癌細(xì)胞)，SW620(人結(jié)腸癌細(xì)胞)，H08910(人卵巢癌細(xì)胞)，HepG2(人肝細(xì)胞肝癌)，A549(人肺癌細(xì)胞)，BCAP-37(人乳腺癌細(xì)胞)，HeLa(人宮頸癌細(xì)胞)，BGC823(人低分化胃腺癌細(xì)胞)，T24(人膀胱癌細(xì)胞)和L1210(小鼠白血病細(xì)胞)。上述癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，或可購(gòu)自美國(guó)ATCC。
各種細(xì)胞分為對(duì)照組和測(cè)試組，測(cè)試組中EFE6蛋白的終濃度為50μg/ml。24小時(shí)培養(yǎng)后，與對(duì)照組細(xì)胞相比。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了L1210(小鼠白血病細(xì)胞)以外，其它各個(gè)加入EFE6蛋白的測(cè)試組中癌細(xì)胞生長(zhǎng)均發(fā)生明顯抑制，可見(jiàn)EFE6蛋白有明顯的抑癌效果，但其對(duì)L1210(小鼠白血病細(xì)胞)無(wú)作用。具體結(jié)果見(jiàn)圖7。
實(shí)施例11 蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的其它生物活性的測(cè)定1.檢測(cè)酯酶活性以BAEE為底物測(cè)定了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的酯酶活性，結(jié)果表明蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)水解BAEE。測(cè)定所用BAEE溶解在pH 7.8，0.05M Tris-HCl緩沖液中，濃度為0.8×10-3M，取2.9ml底物溶液加0.1ml EFE6蛋白(終濃度為10微克/毫升)。
在253nM下測(cè)定光密度變化，經(jīng)計(jì)算EFE6蛋白水解BAEE的效價(jià)為100活力單位/毫克蛋白質(zhì)。
2.檢測(cè)纖溶活性按Deogny所描述的纖維蛋白平板法(Clinica Chimica Acta，1975，6085)測(cè)定了蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)的纖溶活性，通過(guò)測(cè)量溶圈的面積計(jì)算纖溶活性的大小，結(jié)果表明蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)具有纖溶活性，活力達(dá)25,000mm2/mg EFE6蛋白。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求
書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>一種廣譜抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的蚯蚓蛋白及其編碼序列<130>059726<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>717<212>DNA<213>威廉腔環(huán)蚓(Metaphire guillelmi)<400>1atcctggggg gacaggatgc ctctcctgga gagttcccgt ggcaactgtc ccagttgaga 60ggtggaagcc acagctgcgg agcctctctc ctccacgcga cagctgctct cagtgccgcc 120cactgcgtcg acggagcact cgtatcatcc gttgatgtca tcgccggtct tcatcggcga 180tcagatctta ctggaacaca gacttcagct gctgcgtcat tcagcattaa cgtgaactac 240gataacggag agggtacatt cgcacatgat atctccatca tccacctcgc cacagccatc 300gacgcctcgc cagccaacat cgcgtttttg acccttcctc cagacaacag ctatcagttt 360actggtgaca cctgcactct cagtggatgg ggacgtacat ctgccagtaa cattcttccg 420gacacgctgc agaaagtcga cattgaagta atcagcacag acgagtgcaa cgttcgtatg 480gctaccgtca ttggtgccga ctgcactgat aatcaaatcg cagttttcga tgttgccgag 540aacgagggat cgtgcaacgg tgacagcgga ggcccgatga actgccagct caatggtcag 600actgtggttg ccggaataac gtcgtgggga atccagtcgg gcggcgcctg tgcaccatcc 660tacccatctg tctacaccag gacttcagcc taccttcaat ggatcagcga caaccaa 717<210>2<211>239<212>PRT<213>威廉腔環(huán)蚓(Metaphire guillelmi)<400>2
Ile Leu Gly Gly Gln Asp Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Leu1 5 10 15Ser Gln Leu Arg Gly Gly Ser His Ser Cys Ala Ala Ser Leu Leu His20 25 30Ala Thr Ala Ala Leu Ser Ala Ala His Cys Val Asp Gly Ala Leu Val35 40 45Ser Ser Val Asp Val Ile Ala Gly Leu His Arg Arg Ser Asp Leu Thr50 55 60Gly Thr Gln Thr Ser Ala Ala Ala Ser Phe Ser Ile Asn Val Asn Tyr65 70 75 80Asp Ash Gly Glu Gly Thr Phe Ala His Asp Ile Ser Ile Ile His Leu85 90 95Ala Thr Ala Ile Asp Ala Ser Pro Ala Asn Ile Ala Phe Leu Thr Leu100 105 110Pro Pro Asp Asn Ser Tyr Gln Phe Thr Gly Asp Thr Cys Thr Leu Ser115 120 125Gly Trp Gly Arg Thr Ser Ala Ser Asn Ile Leu Pro Asp Thr Leu Gln130 135 140Lys Val Asp Ile Glu Val Ile Ser Thr Asp Glu Cys Asn Val Arg Met145 150 155 160Ala Thr Val Ile Gly Ala Asp Cys Thr Asp Asn Gln Ile Ala Val Phe165 170 175Asp Val Ala Glu Asn Glu Gly Ser Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro180 185 190Met Asn Cys Gln Leu Asn Gly Gln Thr Val Val Ala Gly Ile Thr Ser195 200 205Trp Gly Ile Gln Ser Gly Gly Ala Cys Ala Pro Ser Tyr Pro Ser Val210 215 220Tyr Thr Arg Thr Ser Ala Tyr Leu Gln Trp Ile Ser Asp Asn Gln225 230 235<210>3<211>10<212>PRT<213>威廉腔環(huán)蚓(Metaphire guillelmi)
<400>3Ile Leu Gly Gly Gln Asp Ala Ser Pro Gly1 5 10<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n＝a，t，c或g<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n＝a，t，c或g<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n＝a，t，c或g<400>4athctnggng gncargaygc 20
權(quán)利要求
1.一種分離的蚯蚓多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑癌功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求
1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求
1所述多肽的多核苷酸；或(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求
3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求
3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求
5所述的載體。
7.一種權(quán)利要求
1所述多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求
6所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出權(quán)利要求
1所述的蚯蚓多肽。
8.一種能與權(quán)利要求
1所述的蚯蚓多肽特異性結(jié)合的抗體。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求
1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.權(quán)利要求
1所述的蚯蚓多肽的用途，其特征在于，所述的蚯蚓多肽用于(a)制備治療癌癥的藥物；(b)制備具有酯酶活性的藥物；或(c)制備具有纖維蛋白溶解活性的藥物。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的可廣譜抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)EFE6、編碼所述蛋白質(zhì)EFE6的多核苷酸序列以及制備所述蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的EFE6蛋白首先從蚯蚓中分離得到。本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有廣譜的抑癌用途，并且還具有酯酶活性和纖維蛋白溶解活性。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1990504SQ200510112490
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月30日
發(fā)明者劉小龍, 繆紅華, 王曉明, 朱洪, 王益清, 徐丹, 周元聰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan