專利名稱:一種濕法冶金中嗜酸菌基因組dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嗜酸菌基因組DNA的提取方法。
技術(shù)背景利用嗜酸菌將貧礦和尾礦中金屬溶出并回收的方法稱為生物濕法冶金(biohydrometallurgy)。早在18世紀(jì)，在西班牙Rio Tinto礦山，人們就知道從礦山浸出水中回收銅。在分離和鑒定氧化亞鐵硫桿菌后，20世紀(jì)50年代生物濕法冶金正式作為一項(xiàng)技術(shù)被確認(rèn)。1958年美國(guó)開(kāi)始利用生物濕法冶金提取銅，1966年加拿大開(kāi)始提取鈾，接著濕法提取鋅、鈷、鎳、金等金屬也獲得了成功，生物濕法冶金在全世界被廣泛應(yīng)用。1997年和2001年，我國(guó)也分別在江西德興銅礦和福建紫金山銅礦建成兩座千噸級(jí)以上的生物提銅堆浸廠。近二十年來(lái)，生物氧化法提取金發(fā)展迅速。目前，在南非、澳大利亞、巴西、加納、加拿大和津巴布韋等國(guó)家已建成了近二十家細(xì)菌氧化提金廠。生物氧化提金技術(shù)在我國(guó)黃金工業(yè)上的應(yīng)用雖然起步較晚，但是因?yàn)樗衔覈?guó)國(guó)情，發(fā)展十分迅速。2000年以后，我國(guó)分別在山東煙臺(tái)、萊州和遼寧鳳城建成三座細(xì)菌氧化提金廠。
生物濕法冶金與其它方法相比，反應(yīng)溫和，環(huán)境友好，能耗低，流程短。在礦石日益貧雜和環(huán)境問(wèn)題突出的今天，生物濕法冶金技術(shù)將是有效的金屬元素提取和廢物利用的手段。
目前，生物濕法冶金在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用日益廣泛，這就需要人們對(duì)濕法冶金工藝中的嗜酸菌進(jìn)行有效的監(jiān)測(cè)，以控制反應(yīng)條件、優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)。但是由于嗜酸菌個(gè)體微小，所以難以用一般光學(xué)顯微鏡觀察監(jiān)測(cè)，其它的生理生化方法又十分繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為濕法冶金生產(chǎn)中嗜酸菌監(jiān)測(cè)提供了有效的手段。最近，國(guó)外已有研究者利用基因克隆文庫(kù)技術(shù)、SSCP、16S-23S基因間序列技術(shù)等研究濕法冶金中嗜酸菌群落的發(fā)展變化。這些技術(shù)都是基于嗜酸菌基因組DNA的。目前，雖然用于分離和提取微生物基因組DNA的方法很多，并且也都已經(jīng)比較成熟。但是，濕法冶金中的嗜酸菌是存在于反應(yīng)器pH低于2.0的礦漿中，存在狀態(tài)非常特殊，所以用于提取其它微生物基因組DNA的方法均不適用于嗜酸菌。相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的嗜酸菌DNA提取方法手續(xù)繁瑣，而且結(jié)果并不理想。因此，這就需要我們尋找一種簡(jiǎn)單方便而且效果穩(wěn)定的嗜酸菌DNA提取方法。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了提供一種新的、簡(jiǎn)單快捷的、效果穩(wěn)定的適用于礦漿嗜酸菌基因組DNA的提取方法。
所述的微生物基因組DNA的提取方法，其包括以下步驟1、菌體收集10000rpm離心8分鐘收集培養(yǎng)好的礦漿，棄上清。
2、菌體洗滌用0.02M硫酸洗滌礦漿兩遍，以除去對(duì)后續(xù)工作有害的重金屬離子；再用STE緩沖溶液洗滌一遍(蔗糖10％，Tris·HCl 50mM，EDTA 10mM，NaCl 100mM，pH8.0)，將礦漿pH值調(diào)至8.0，以免酸性環(huán)境水解后續(xù)步驟釋放出的DNA。
3、菌體裂解用STE緩沖溶液懸浮礦漿，加入溶菌酶至終濃度5mg/ml，37℃水浴處理30分鐘；加入蛋白酶K至終濃度3mg/ml，SDS至終濃度2％，50℃水浴處理45分鐘；加入直徑為0.1mm的玻璃珠0.5g，在漩渦振蕩器上低速振蕩1分鐘。
4、去除蛋白將裂解后的溶液10000rpm離心8分鐘，取上清；加等體積的氯仿抽提兩次，取上清。
5、基因組DNA的沉淀向上清液中加入10％的3M乙酸鈉，再加入等體積的異丙醇，-20℃放置1小時(shí)；12000rpm離心10分鐘，棄上清。
6、沉淀用75％的乙醇洗滌一次，自然干燥，最后用50μL無(wú)菌水溶解，并加入1μL濃度為1μg/mL的RNase，即得到較純的、可直接用于PCR等分子生物學(xué)操作的嗜酸菌基因組DNA。
附圖是DNA的瓊脂糖電泳圖譜，其中的1泳道是λ噬菌體DNA經(jīng)HindIII限制型內(nèi)切酶酶切后的電泳圖譜；左邊的兩個(gè)泳道分別為下面三個(gè)實(shí)施例的基因組DNA提取的效果圖。
以下通過(guò)具體實(shí)事例詳細(xì)說(shuō)明發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1leathen培養(yǎng)基中加入硫粉至終濃度2％，用硫酸調(diào)節(jié)pH至2.0，接種嗜酸菌10％，170rpm，40℃恒溫振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。離心收集菌體，其基因組DNA的提取結(jié)果見(jiàn)附圖第2泳道，提取DNA的產(chǎn)量為35μg/g礦漿。
實(shí)施例2取某高砷難浸精金礦，用9K培養(yǎng)基調(diào)制礦漿，礦漿濃度15％，pH1.8，接種嗜酸菌10％，170rpm，40℃恒溫振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。離心收集菌體，其基因組DNA的提取結(jié)果見(jiàn)附圖第3泳道，提取DNA的產(chǎn)量為45μg/g礦漿。
實(shí)施例3取某鐵閃鋅精礦，用9K培養(yǎng)基調(diào)制礦漿，礦漿濃度10％，pH2.0，接種嗜酸菌10％，170rpm，40℃恒溫振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。離心收集菌體，其基因組DNA的提取結(jié)果見(jiàn)附圖第3泳道，提取DNA的產(chǎn)量為50μg/g礦漿。
用A260/A280對(duì)以上提取的三種基因組DNA的質(zhì)量進(jìn)行了檢測(cè)，比值都達(dá)到了1.8，結(jié)果表明三種DNA的純度較高。
權(quán)利要求
1.一種濕法冶金中嗜酸菌基因組DNA的提取方法，其特征在于離心收集好的礦漿需先用0.2M的硫酸洗滌兩遍，除去重金屬離子；再用STE緩沖溶液洗滌一遍，將礦漿的pH調(diào)至8.0。
2.權(quán)利要求
1所述的一種濕法冶金中嗜酸菌基因組DNA的提取方法，其特征在于STE提取緩沖溶液的成份為蔗糖10％，Tris·HCl 50mM，EDTA 10mM，NaCl 100mM，pH8.0。
3.權(quán)利要求
1所述的一種濕法冶金中嗜酸菌基因組DNA的提取方法，其特征在于菌體裂解最后一步加入玻璃珠低速振蕩1分鐘，使菌體完全裂解。
4.權(quán)利要求
1所述的一種濕法冶金中嗜酸菌基因組DNA的提取方法，其特征在于DNA沉淀時(shí)需加入10％的乙酸鈉。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種新的、簡(jiǎn)單快捷的、效果穩(wěn)定的適用于礦漿嗜酸菌基因組DNA的提取方法。離心收集培養(yǎng)好的礦漿后，分別用0.2M硫酸和STE緩沖溶液洗滌(pH8.0)，加入溶菌酶37℃處理30分鐘，接著加入蛋白酶K和SDS于50℃處理45分鐘后，加入玻璃珠低速渦漩1分鐘，使細(xì)胞完全裂解，然后直接用氯仿抽提除蛋白，最后經(jīng)無(wú)水乙醇沉淀和75％乙醇洗滌即得到較純的、可直接用于PCR等基因操作的基因組DNA。
文檔編號(hào)C22B3/00GK1990864SQ200510135538
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月30日
發(fā)明者張洪勛, 郝春博, 白志輝, 謝慧君, 張保國(guó), 丁杰平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan