專利名稱:一種黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用色譜法從黃芪異黃酮提取物中同時分離制備出高純度的芒柄花素(Formononetin)、3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷(3-hydroxy-9，10-dimethoxy pterocarpane)和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷(2’，7-dihydroxy-3’，4’-dimethoxy isoflavane)三種主要單體成分的方法。
背景技術(shù)：
黃芪異黃酮是黃芪的次生代謝產(chǎn)物，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，主要分為游離型的異黃酮、異黃烷和紫檀烷苷元及其結(jié)合型的糖苷類。現(xiàn)代藥理研究表明黃芪異黃酮類物質(zhì)具有抗菌消炎、抗病毒、降血脂、抗癌和具卵泡激素等作用，因此分離制備高純度的化合物單體成為一個重要的研究內(nèi)容。芒柄花素的制備主要有提取法和化學(xué)合成法兩種，而3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷的制備只有提取法。經(jīng)典的化學(xué)合成法所需原料或試劑不易得到、且反應(yīng)產(chǎn)物復(fù)雜，分離純化困難。傳統(tǒng)的提取法有步驟繁瑣、周期長、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。所使用的溶劑洗脫系統(tǒng)也較為復(fù)雜且毒性大(如氯仿)，溶劑消耗量大。因此需要一種快速、高效、重現(xiàn)性好的分離方法來滿足對上述成分的需求。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種高效、可重復(fù)、低成本、高回收率、適合于大量分離制備黃芪異黃酮主要單體組分的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，采用硅膠層析柱對含有黃芪異黃酮的植物提取物進(jìn)行富集濃縮后，再通過反相高效液相制備色譜進(jìn)行分離制備。從而保證了本制備方法在較低的成本和較高收率的情況下滿足黃芪異黃酮主要單體組分制備的重復(fù)性以及線性放大的要求。
包括以下具體步驟1)先用硅膠層析柱對含有黃芪異黃酮的提取物進(jìn)行目標(biāo)成分的富集濃縮；所使用的洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯，它們的體積比為1∶1～1.5；2)流出部分用薄層色譜檢測，薄層在紫外燈下檢出熒光，展開劑為石油醚-乙酸乙酯，它們的體積比為1∶1～1.5；將含有的目標(biāo)產(chǎn)物Rf≥0.62部分合并，濃縮成浸膏后；3)用甲醇-氯仿溶液體系溶解，甲醇-氯仿的體積比為1∶2～3，過濾膜，用高效液相制備色譜對其進(jìn)行分離、純化而得到芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷三個化合物的純品。
所述步驟1)的具體過程為，將黃芪總黃酮粗提物用甲醇溶解，與硅膠拌樣，樣品與硅膠的質(zhì)量比為1∶2～3，拌樣均勻后，揮干溶劑，研磨均勻，用硅膠填充層析柱進(jìn)行柱層析；柱層析所用石油醚的沸點(diǎn)范圍為60～90℃，硅膠為100～200目；所述步驟3)中所用的濾膜0.2～0.5μm；高效液相制備色譜是反相高效液相制備色譜，填充材料為反相硅膠C18，粒徑5～10μm；流動相(即洗脫劑)為甲醇和含甲酸的水溶液兩相體系，兩相溶劑以體積分?jǐn)?shù)比為45∶55～55∶45進(jìn)行洗脫，添加甲酸濃度范圍為0.1～0.5％；控制流速為19～300ml/min；同時采用紫外檢測器230nm在線監(jiān)測流出曲線。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.分離到的化合物純度高。本發(fā)明公開了黃芪異黃酮主要單體組分的分離、純化方法，所用的是反相高效液相色譜法，具有能夠保證較高的峰型分離度、重現(xiàn)性好、時間短、分離量大、回收率高、分離環(huán)境緩和、節(jié)約溶劑等特點(diǎn)，能直接分離大量粗提樣品，分離到的化合物純度可達(dá)98％以上，可以用于黃芪藥材及制劑的質(zhì)量控制。
2.低成本、收率高、重復(fù)性好。本發(fā)明方法回收率達(dá)80％以上，而且所用溶劑系統(tǒng)簡單，其洗脫溶劑為普通溶劑，價格便宜，因此是一種經(jīng)濟(jì)的提取黃芪異黃酮主要單體組分的方法；可為黃芪中各種異黃酮單體組分的生產(chǎn)提供新工藝。
圖1為實(shí)施例1中黃芪黃酮粗品的高效液相分析圖；圖2為實(shí)施例1中含芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷的組分Fr2的高效液相分析圖；圖3為實(shí)施例1中芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷的高效液相制備色譜圖；圖4為實(shí)施例1中純化的化合物(依次為芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷)的高效液相分析圖。
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例11.稱取黃芪總黃酮粗提物浸膏20g(高效液相色譜分析見圖1)，加甲醇使其溶解，與硅膠以質(zhì)量比為1∶2～3(w/w)拌樣，拌樣均勻后，揮干溶劑，研磨均勻。
2.用100～200目的硅膠(1300g)填充層析柱柱層析，洗脫溶劑為石油醚-乙酸乙酯(體積比為1∶1)以4倍柱體積洗脫。
3.流出部分用薄層色譜檢測，展開劑為石油醚-乙酸乙酯(體積比為1∶1)，顯色劑為含5％硫酸的甲醇溶液，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物(Rf≥0.62)的餾分，將含有芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷的部分合并為組分Fr2，濃縮成浸膏757mg。組分Fr2的高效液相色譜分析(如圖2)。
4.用反相高效液相制備色譜分離組分Fr2。將組分Fr2 92.5mg溶于5mL甲醇-氯仿(體積比為1∶2)溶液體系中，過0.45μm濾膜，作為制備色譜進(jìn)樣溶液。制備色譜柱內(nèi)徑為7.7cm，柱長20cm，柱填料為C18(粒徑10μm)，進(jìn)樣環(huán)20mL。將樣品注入制備色譜的進(jìn)樣環(huán)中，用甲醇和含0.5％甲酸的水溶液作洗脫相，兩相溶劑以體積分?jǐn)?shù)比為50∶50，以150mL/min的流速進(jìn)行等度洗脫，運(yùn)行時間為55min。通過在線的紫外檢測器監(jiān)測流分，檢測波長230nm(見圖3)，按峰切割并收集流出物，得到芒柄花素31.4mg、9，10-二甲氧基紫檀烷14.8mg、2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷24.3mg。三個化合物的純度＞98％，回收率＞87％，見圖4。
其中芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖如下； 芒柄花素 9，10-二甲氧基紫檀烷 2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷實(shí)施例2組分Fr2的制備方式同實(shí)施例1。稱取組分Fr2 287.5mg溶解于10mL甲醇-氯仿(體積比為1∶2)溶液體系中，過0.45μm濾膜，作為制備色譜進(jìn)樣溶液。制備色譜柱內(nèi)徑為10cm，柱長20cm，柱填料為C18(粒徑10μm)，進(jìn)樣20mL。將樣品注入制備色譜的進(jìn)樣環(huán)中，用甲醇和含0.5％甲酸的水溶液作洗脫相，兩相溶劑體積比為50∶50，以300mL/min的流速進(jìn)行等度洗脫，運(yùn)行時間55min。通過紫外檢測器在線監(jiān)測流分，檢測波長230nm，按峰切割并收集流出物，得到芒柄花素96mg、9，10-二甲氧基紫檀烷41.6mg、2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷68.2mg。三個化合物的純度＞98％，收率大于80％。
實(shí)施例3
組分Fr2的制備方式同實(shí)施例1。稱取組分Fr2 11mg溶解于5mL甲醇-氯仿(體積比為1∶2)溶液體系中，過0.45μm濾膜，作為制備色譜進(jìn)樣溶液。制備色譜柱內(nèi)徑為2cm，柱長25cm，柱填料為C18(粒徑10μm)，進(jìn)樣環(huán)10mL。將樣品注入制備色譜的進(jìn)樣環(huán)中，以甲醇和含0.5％甲酸的水溶液作洗脫相，兩相溶劑以體積分?jǐn)?shù)為50∶50進(jìn)行等度洗脫，流速為19mL/min，運(yùn)行時間55min。通過在線的紫外檢測器監(jiān)測流分，檢測波長230nm，按峰切割并收集流出物，得到芒柄花素3.9mg、9，10-二甲氧基紫檀烷1.76mg、2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷2.84mg。三個化合物的純度純度＞98％，收率大于85％。
為了確認(rèn)所得產(chǎn)物，對上述結(jié)晶粉末進(jìn)行了薄層色譜和質(zhì)譜鑒定，并與標(biāo)準(zhǔn)品對照。
采用硅膠G F254薄層板分別對各產(chǎn)物定性檢測，并與對照品Rf值比較。
質(zhì)譜分析結(jié)果說明所得產(chǎn)物的分子量分別為430、300、302，這些數(shù)據(jù)相應(yīng)與對照品的分子量一致。
權(quán)利要求
1.一種黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，其特征在于采用硅膠層析柱對含有黃芪異黃酮的植物提取物進(jìn)行富集濃縮后，再通過反相高效液相制備色譜進(jìn)行分離制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，其特征在于1)先用硅膠層析柱對含有黃芪異黃酮的提取物進(jìn)行目標(biāo)成分的富集濃縮；所使用的洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯，它們的體積比為1∶1～1.5；2)流出部分用薄層色譜檢測，薄層在紫外燈下檢出熒光，展開劑為石油醚-乙酸乙酯，它們的體積比為1∶1～1.5；將含有的目標(biāo)產(chǎn)物Rf≥0.62部分合并，濃縮成浸膏后；3)用甲醇-氯仿溶液體系溶解，甲醇-氯仿的體積比為1∶2～3，過濾膜，用高效液相制備色譜對其進(jìn)行分離、純化而得到芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羥基-3’，4’-二甲氧基異黃烷三個化合物的純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，其特征在于所述步驟1)的具體過程為，將黃芪總黃酮粗提物用甲醇溶解，與硅膠拌樣，樣品與硅膠的質(zhì)量比為1∶2～3，拌樣均勻后，揮干溶劑，研磨均勻，用硅膠填充層析柱進(jìn)行柱層析。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，其特征在于所述步驟3)中高效液相制備色譜是反相高效液相制備色譜，填充材料為反相硅膠C18，粒徑5～10μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2所述黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，其特征在于所述步驟3)中高效液相制備色譜進(jìn)行分離制備的流動相為甲醇和含甲酸的水溶液兩相體系，添加甲酸濃度范圍為0.1～0.5％；兩相溶劑以體積分?jǐn)?shù)比為45∶55～55∶45進(jìn)行洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2所述黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，其特征在于所述步驟3)中高效液相制備色譜進(jìn)行分離制備流速為19～300ml/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求
2所述黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，其特征在于所述步驟3)中所用的濾膜0.2～0.5μm。
8.根據(jù)權(quán)利要求
2所述黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法，其特征在于所述步驟1)中柱層析所用石油醚的沸點(diǎn)范圍為60～90℃，硅膠為100～200目。
專利摘要
本發(fā)明涉及黃芪中多種異黃酮成分的分離制備方法。本方法分為兩步①采用硅膠柱富集含有黃芪異黃酮的植物提取物；②利用反相高效液相制備色譜對目標(biāo)成分進(jìn)行分離制備。本制備方法具有低成本、收率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可為黃芪中各種異黃酮單體組分的生產(chǎn)提供新工藝。
文檔編號C07D493/00GK1990483SQ200510136731
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日
發(fā)明者張曦, 肖紅斌, 梁鑫淼 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan