專利名稱:抗菌化合物的制作方法
本申請享有2004年5月24日提交的U.S.臨時申請60/573,899的優(yōu)先權。
發(fā)明背景本發(fā)明涉及具有抗菌活性的新天然產(chǎn)物。
由細菌引起的感染是增長中的醫(yī)學問題，因為這些病原體中的許多對各種常見的抗生素是抗性的。這樣的微生物包括金黃色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylcoccus epidermidis)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)，釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)，肺炎鏈球菌(Streptcccus pneumoniae)，糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，屎腸球菌(Entercccus faecium)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，Actinobacter calcaeticus，大腸桿菌(Escherichia coli)和嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。本發(fā)明的抗生素包括對治療的重要貢獻，該治療用于治療對各種已知抗生素抗性的傳染。對于綜述，參見F.D.Lowy TheJournal of Clinical Investigation 2003，111(9)，1265。
本發(fā)明中，描述了從鏈霉菌屬(Streptomyces)真細菌發(fā)酵分離的新天然產(chǎn)物。該化合物呈現(xiàn)了對抗各種病原菌的抗菌活性，已經(jīng)證明其中許多病原菌對目前可獲得的抗生素是抗性的。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了通式I所示的新天然產(chǎn)物或其藥物學上可接受的鹽，及其作為抗菌劑的用途
所述化合物可有效治療細菌感染。
本發(fā)明還涉及通過用真細菌，鏈霉菌發(fā)酵來制備化合物I的方法。本發(fā)明還涉及從發(fā)酵液中分離通式I化合物的方法。
附圖簡述圖1是化合物I在C5D5N中的13C NMR光譜。
圖2是化合物I在C5D5N中的1H NMR光譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明描述了結構通式I的化合物 或其藥物學上可接受的鹽。
本發(fā)明化合物藥物學上可接受的鹽包括常規(guī)的無毒鹽，如從無毒的無機或有機堿所形成的。例如，這樣的常規(guī)無毒鹽包括那些從無機堿如堿或堿土金屬氫氧化物產(chǎn)生的鹽，例如，鉀鹽、鈉鹽、鋰鹽、鈣鹽或鎂鹽等；和從有機堿制備的鹽，所述有機堿是例如胺，例如二芐基乙二胺、三甲基胺、哌啶、吡咯烷、芐胺等，或氫氧化季銨如氫氧化四甲胺等。
可以從本發(fā)明化合物通過常規(guī)化學方法來合成藥物學上可接受的鹽。通常，通過在合適的溶劑或各種溶劑組合中游離酸與化學計量或與過量的所需成鹽無機或有機堿反應來制得鹽。
本發(fā)明的化合物I呈現(xiàn)了用于治療細菌感染的抗菌活性。證明了對抗金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、枯草芽胞桿菌和大腸桿菌各種菌株的抗菌活性，包括對許多已知抗生素抗性的菌種，如二甲氧基苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)，萬古霉素抗性的腸球菌(VRE)，多重藥物抗性的屎腸球菌，大環(huán)內(nèi)酯抗性的金黃色葡萄球菌和表皮金黃色葡萄球菌，和linezolide抗性的金黃色葡萄球菌和屎腸球菌。
本發(fā)明化合物可以配制成藥物組合物，通過將化合物I與藥物學上可接受的載體混合。以下列出了這樣載體的實例。
可以以粉末或晶體形式，液體溶液，或懸浮液來使用化合物?？梢酝ㄟ^各種方法來給藥；那些主要的興趣包括局部、口服和通過注射(靜脈內(nèi)或肌內(nèi))非腸道。
用于注射(一種傳送途徑)的化合物，可以制成安瓿的單位計量形式，或配制于多劑量容器內(nèi)?？勺⑸涞慕M合物可以采用這樣的形式，如懸浮液、溶液或油性或水性載體中的乳濁液，并可以含有各種配制劑?；蛘?，活性成分可以是粉末(凍干或非凍干)形式，用于在傳送時用合適的載體如無菌水重建。可注射的組合物中，載體通常包括無菌水、鹽水或另一種可注射液體，例如，用于肌內(nèi)注射的花生油。此外，可以包括各種緩沖劑，防腐劑等。
局部施加可以配置于載體中如疏水性或親水性基料來形成膏劑、霜劑、洗劑，配制于含水的、油質(zhì)或醇液體中來形成涂抹料，或配制于干稀釋劑中來形成粉末。
口服組合物可以采用這樣的形式如片劑、膠囊、口服懸浮液和口服溶液?？诜M合物可以使用載體如常規(guī)配制劑，并可以包括持續(xù)釋放特性以及快速釋放形式。
待給藥的劑型很大程度上取決于待治療患者的情況和大小，給藥的途徑和頻率，病原菌對化合物的敏感度，感染的毒力和其他因素。然而，將這樣的事情留給醫(yī)師根據(jù)抗菌領域公知的治療原理來常規(guī)處理。
給藥于人的組合物，不管是液體或固體，每單位劑量可以含有約0.01％至高約99％的化合物I，一實施方案的范圍為約10-60％。組合物通常含有約15mg至約2.5g的化合物I，一實施方案的該范圍為約250mg至1000mg。非腸道給藥中，單位劑量通常包括無菌水溶液中的純化合物I或用于溶液的可溶粉末形式，可以將其調(diào)節(jié)至中性pH和等滲。
在此所述的本發(fā)明還包括治療需要這樣治療的哺乳動物細菌感染的方法，所述方法包括將治療感染有效量的化合物I給藥于哺乳動物。
給藥化合物I方法的一實施方案包括口服和非腸道方法，例如，i.v.灌輸，i.v.快速濃注和i.m.注射。
對于成人，優(yōu)選每天給藥一至四次每kg體重約5-50mg化合物I。優(yōu)選劑量是250mg至1000mg抗菌劑，每天給予一至四次。更具體地，對于輕微感染，推薦每天兩至三次約250mg的劑量。對于中度感染，對抗高度敏感革蘭氏陽性微生物，推薦每天三至四次約500mg的劑量。對于嚴重的、致命的感染，對抗抗生素敏感度上限的微生物，推薦每天三至四次約1000-2000mg的劑量。
對于兒童，優(yōu)選每天給予2，3或4次約5-25mg/kg體重的劑量；通常推薦10mg/kg的劑量。
本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)化合物I的方法，其包括在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)鏈霉菌屬的微生物，然后從發(fā)酵液中回收本發(fā)明的化合物。鏈霉菌屬的微生物，ATCC#PTA-5942，使用以下分類學研究鑒定為真細菌鏈霉菌屬，以MA7339保藏于Merck保藏中心。
隨后將生物體置于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)永久保藏，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852，并已經(jīng)指定保藏號為ATCC#PTA-5942(Merck#MA7339)。
在專利頒布時將不能取消地消除任何關于公眾獲得微生物的限制。盡管，結合本發(fā)明描述了這些特定物種的使用，存在能夠產(chǎn)生化合物I的其他物種和上述生物體的突變體，及其用途涉及實施本發(fā)明的方法。
通過合適培養(yǎng)基在受控條件下的需氧發(fā)酵來產(chǎn)生結構通式I的化合物，通過接種真細菌鏈霉菌的培養(yǎng)物。合適培養(yǎng)基優(yōu)選是含水的并含有可同化碳、氮和無機鹽的來源。
用于鏈霉菌發(fā)酵的培養(yǎng)基主要是公知的Difco胰胨豆胨培養(yǎng)液，單獨或與本領域技術人員常用的添加營養(yǎng)素一起。
應當注意到在此所述的營養(yǎng)培養(yǎng)基僅僅是可以使用的多種培養(yǎng)基的說明，且不是以任何方式來限制本發(fā)明的范圍。
在約10至約40℃的溫度范圍內(nèi)進行發(fā)酵；然而，為了最佳結果，優(yōu)選在約28℃進行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH為約5.5至約7.5。
可以理解對于本發(fā)明化合物的發(fā)酵生產(chǎn)，本發(fā)明不限于使用ATCC保藏號為ATCC# PTA-5942(Merck# MA7339)的特定鏈霉菌。特別理想和確定的是使用從所述培養(yǎng)物產(chǎn)生或衍生的其他天然或人工突變體，或鏈霉菌屬的其他變種或物種包括于本發(fā)明范圍內(nèi)，只要它們可以產(chǎn)生本發(fā)明的化合物。從ATCC# PTA-5942(Merck# MA7339)人工生產(chǎn)鏈霉菌的突變物種或菌株可以通過常規(guī)物理或化學突變來實現(xiàn)，例如，所需培養(yǎng)物的紫外線照射，或亞硝基胍處理等。還證明了重組DNA技術如原生質(zhì)體融合，質(zhì)粒引入，染色體片段引入等也是有用的。
實施例1種子培養(yǎng)基組成
pH7.0
YME.TE(生產(chǎn)培養(yǎng)基，g/l)
pH＝7.0將鏈霉菌ATCC# PTA-5942(Merck# MA7339)的冷凍培養(yǎng)物(1.3mL)接種于含有50mL種子培養(yǎng)基的250mL燒瓶中。將燒瓶在28.0℃以220RPM振蕩培養(yǎng)48小時。通過將第一代種子的3％接種物轉(zhuǎn)移至含有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中來產(chǎn)生二代種子。將燒瓶在28.0℃以220RPM振蕩培養(yǎng)48小時。將二代種子的5％接種物轉(zhuǎn)移250ml中的至30ml YME-TE中，并在32.0℃以220RPM振蕩培養(yǎng)12天。
化合物I的分離向兩升發(fā)酵液中，加入兩升丙酮并在振蕩器上振蕩兩小時并過濾。將濾過物在減壓下濃縮來除去大部分丙酮并裝載于75mLamberchrome(CG161s)柱上。用90％水至100％甲醇的梯度來洗脫柱子，將化合物洗脫于寬的區(qū)域中，然后將其濃縮并凍干，獲得170mg半純化級分。將該級分的80mg部分通過制備性HPLC(Zorbax Rx C821.4×250mm)來純化，使用20-98％含有1％三氯醋酸的含水乙腈梯度來產(chǎn)生1.1mg的化合物I。通過光譜分析來闡明結構(參見以下的)。
化合物I的物理數(shù)據(jù)
表化合物I在500MHz的1H和13C NMR值
培養(yǎng)物的特征描述了化合物生產(chǎn)者培養(yǎng)物MA-7339的一般描述。
根據(jù)Shirling和Gottlieb(Int.J.Syst.Bacteriol.(1996)16313-340)的方法來觀察生長、一般培養(yǎng)特征和碳源利用的觀察。通過與顏色Methuen手冊(A.Komerup和J.H.Wauscher，第三版，1978)中所包含的顏色標準相比較來測定培養(yǎng)物的顯色。
使用Lechevalier和Lachevalier(1980)的方法來測定細胞的化學組成。
使用改進的樣品制備(Sasser，1990)來測定脂肪酸組成。通過毛細管氣相色譜使用裝有苯基甲基硅酮柱(0.2mm×25m)的HewlettPackard Model 6890N氣相色譜/微生物鑒定系統(tǒng)軟件(MIDI，Inc.，Newark，Del)了來進行脂肪酸甲酯(FAME)的分析。通過微生物鑒定系統(tǒng)軟件來測定單個脂肪酸鑒定。
從使用引物27f和1525r(Lane，1991)獲得的1500bp PCR片段來測定完整16S rDNA序列。將PCR產(chǎn)物用作測序反應中的模版，使用ABI PRISMTM染色終止基因循環(huán)測序試劑盒(Perkin Elmer)。使用GCG片段裝配系統(tǒng)(Wisconsin Package，版本8)來裝配部分序列，并使用程序CLUSTALW(Intelligenetics，Ins)來進行序列比對。使用最大-節(jié)儉分析來進行比對序列的系統(tǒng)發(fā)生分析，使用節(jié)儉分析系統(tǒng)發(fā)生(PAUP)程序版本4.0.(Swofford，1993)的分支和結合(branch-and-bound)算法。
來源從西班牙巴利阿里群島Mallrorca收集的土壤中獲得菌株MA7339。用1％(w/v)氯胺T預處理后分離菌株，并置于補充20μg/ml萘啶酮酸的基于腐殖酸的瓊脂上。在酵母麥芽提取物瓊脂上純化后，檢測分離物的活性，測試時，作為FabF_SPAR_C篩子中的瓊脂填充物。
一般生長特征菌株MA7339在各種瓊脂培養(yǎng)基上28℃生長良好，如酵母麥芽提取物、燕麥粉、甘油天冬酰胺、無機鹽淀粉和胰胨豆胨瓊脂?？偟木湫螒B(tài)是典型的鏈霉菌，記錄其在不同瓊脂培養(yǎng)基中的生長特征，包括孢子團顏色，基質(zhì)菌絲體著色和不同色素的產(chǎn)生(表1)。
-菌落形態(tài)(在酵母麥芽提取物瓊脂上，ISP2)基質(zhì)菌絲體初始發(fā)白的黃色在培養(yǎng)21天后轉(zhuǎn)變成帶黃色的棕色(5D7)。初始的白色氣生菌絲體持續(xù)發(fā)展，在21天培養(yǎng)后轉(zhuǎn)變成發(fā)白的灰色(5E1/5E2)，帶有褐色的濕滲出物液滴。
-微形態(tài)通過光學顯微鏡在400X和1000X放大倍數(shù)下直接測定平板上的孢子鏈形態(tài)。在酵母麥芽提取物瓊脂上培養(yǎng)7，14和21天后進行觀察。氣生菌絲體從大規(guī)模分枝的基質(zhì)菌絲體長出。稀疏的分枝氣生菌絲體初始分化成短的和不規(guī)則緊密螺旋的孢子鏈螺旋。由少于10-20個孢子形成擔子體，且隨著時間趨于在較老培養(yǎng)物的暗黑色粘性孢子團中接合。在大部分其他測試培養(yǎng)基中觀察到相似的形態(tài)，但是接合程度不同。相反，在甘油天冬酰胺瓊脂中，菌株作為無性營養(yǎng)菌絲體生長。
化學分類學分析細胞壁組成的分析表明菌株MA 7339在全生物體的水解產(chǎn)物中含有LL-A2pm，鏈霉菌的一個特征，且葡萄糖和核糖作為主要的細胞壁糖。菌株富含飽和的支鏈以及異-和反異-脂肪酸且全細胞甲醇分解產(chǎn)物含有主要的脂肪酸15:0反異(12.43％)和16:0異(17.94％)，這也是鏈霉菌的特征。盡管如此，主要成分是脂肪酸物質(zhì)15:0異(20.43％)。表2中給出了完整的脂肪酸組成。
所有這些化學分類學分析表明菌株對應于鏈霉菌屬的成員。
生理特征菌株MA7339呈現(xiàn)了以下的碳利用模式(表3)蔗糖、D-木糖、D-果糖和棉子糖的充分利用；D-葡萄糖、L-肌醇和D-甘露醇的中度利用；和L-阿拉伯糖、纖維素和鼠李糖的沒有利用。
16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)生分析對于菌株MA-7739，已經(jīng)測定了完整的16S rDNA序列(圖1)。將序列與Genebank的鏈霉菌核苷酸序列(AB045882)以及普拉特鏈霉菌(S.platnsis)菌株MA7327和MA7331相比對。使用最大節(jié)儉方法來建立基于這些16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)生樹。每組的模擬復制品用作統(tǒng)計學置信度的測量。認為基于95％模擬復制品建立的分組是統(tǒng)計學顯著的。
將菌株MA7339與普拉特鏈霉菌菌株ATCC13865以及菌株MA7327和MA7331相聯(lián)系。該密切的關系得到模擬值(97％)的高度支持并表明該分離物可以鑒定為普拉特鏈霉菌種的另一個菌株(圖2)。
表1.鏈霉菌MA7339的培養(yǎng)特征(21天，28℃)
表2菌株MA7339中發(fā)現(xiàn)的主要脂肪酸
表3菌株MA7339的碳水化合物利用模式
在以下化合物作為唯一碳源來生長；28℃，7，14，21天進行觀察；生長水平3＝充分利用；2＝中度利用；1＝差的利用；0＝?jīng)]有利用。
圖1.菌株MA7339的16S rDNA菌株MA733916S rDNA片段(從1至1445)1 CCTCCTTCGG GAGGGGATTA GCTGGCGAAC GGGTGAGTAA CACGTGGGCA51 ATCTGCCCTT CACTCTGGGA CAAGCCCTGG AAACGGGGTC TAATACCCGG101 ATACGACACA CGACCGCATG GTCTGTGTGT GGAAAGCTCC GGCGGTGAAG151 GATGAGCCCG CGGCCTATCA GCTTGTTGGT GGGGTGATGR CCTACCAAGG201 CGACGACGGG TAGCCGGCCT GAGAGGGCGA CCGGCCACAC TGGGACTGAG251 ACACGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTGGGGAATA TTGCACAATG301 GGCGAAAGCC TGATGCAGCG ACGCCGCGTG AGGGATGACG GCCTTCGGGT351 TGTAAACCTC TTTCAGCAGG GAAGAAGCGA GAGTGACGGT ACCTGCAGAA401 GAAGCGCCGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGGCGCA451 AGCGTTGTCC GGAATTATTG GGCGTAAAGA GCTCGTAGGC GGCTTGTCAC501 GTCGGATGTG AAAGCCCGGG GCTTAACCCC GGGTCTGCAT TCGATACGGG551 CAGGCTAGAG TTCGGTAGGG GAGATCGGAA TTCCTGGTGT AGCGGTGAAA601 TGCGCAGATA TCAGGAGGAA CACCGGTGGC GAAGGCGGAT CTCTGGGCCG
651 ATACTGACGC TGAGGAGCGA AAGCGTGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC701 CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA CGTTGGGAAC TAGGTGTGGG CGACATTCCA751 CGTCGTCCGT GCCGCAGCTA ACGCATTAAG TTCCCCGCCT GGGGAGTACG801 GCCGCAAGGC TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCAGCG851 GAGCATGTGG CTTAATTCGA CGCAACGCCA AAGAACCTTA CCAAGGCTTG901 ACATACACCG GAAACGTCTG GAGATCAGGC GCCCCCTTGT GTCCGGTGTA951 TCATGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGGTT1001 TAAKTCCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGTT CTGTGTTGCC AGCATGCCCT1051 TCGGGGTGAT GGGGACTCAC AGGAGACTGC CGGGGTCAAC TCGGAGGAAG1101 GTGGGGACGA CGTCAAGTCA TCATGCCCCT TATGTCTTGG GCTGCACACG1151 TGCTACAATG GCCGGTACAA TGAGCTGCGA TACCGCGAGG TGGAGCGAAT1201 CTCAAAAAGC CGGTCTCAGT TCGGATTGGG GTCTGCAACT CGACCCCATG1251 AAGTCGGAGT TGCTAGTAAT CGCAGATCAG CATTGCTGCG GTGAATACGT1301 TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACG TCACGAAAGT CGGTAACACC1351 CGAAGCCGGT GGCCCAACCC CTTGTGGGAG GGAATCGTCG AAGGTGGGAC1401 TGGCGATTGG GACGAAGTCG TAACAAGGTA GCCGTACCGG AAGGT以下描述了用于測定化合物I抗菌活性的實驗方案。
材料陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton培養(yǎng)液(MH；BBL)50％裂解的馬血(LHB；BBL)(冷凍存儲)RPMI 1640(BioWhittaker)人血清(Pel-Freez)嗜血測試培養(yǎng)基(HTM，Remel)胰胨豆胨培養(yǎng)基(TSB，5mL/管；BBL)0.9％的氯化鈉(鹽水，Baxter)胰胨豆胨+5％羊血瓊脂平板(TSA；BBL)Sabouraud葡萄糖瓊脂平板(BBL)巧克力瓊脂平板(BBL)
2×脫脂乳(Remel)Microbank珠子(Kramer Scientific)MIC 2000微量滴定平板培養(yǎng)箱2×胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB，BBL)+15％甘油/50％馬血清96-孔微量滴定平板，蓋子，接種盤(Dynex Laboratories)8-道Finn多通道吸移管管理器，0.5-10μL體積。
方法培養(yǎng)基制備陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton培養(yǎng)液(BBL)根據(jù)制造商的說明來制備(將22g溶解于1000mL水中；高壓滅菌22分鐘)。冷凍存儲。在使用之前使用Corning 0.45Tm纖維素醋酸酯濾器無菌過濾。
50％裂解的馬血將脫纖維蛋白的馬血與無菌蒸餾水1∶1稀釋；冷凍，融化并再冷凍(至少7次)，然后離心。冷凍存儲于-20℃。
陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton+2.5％裂解的馬血將5mL 50％裂解的馬血無菌加入100mL陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton培養(yǎng)液中。在使用之前使用Corning 0.45Tm纖維素醋酸酯濾器無菌過濾。
陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton+50％人血清將50mL人血清無菌加入50mL 2X陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton培養(yǎng)液中。在使用之前使用Corning0.45Tm纖維素醋酸酯濾器無菌過濾。
嗜血測試培養(yǎng)基(Remel)接受制造商制備好的。在使用之前使用Corning 0.45Tm纖維素醋酸酯濾器無菌過濾。
0.9％氯化鈉(鹽水；Abbott Labs)接受制造商制備好的。
2×脫脂乳(Remel)接受制造商制備好的。
所有瓊脂平板接受制造商制備好的。
所測試抗生素的最高濃度＝64g/mL(從50％DMSO中的1mg/mL溶液開始)每孔DMSO的終濃度＝3.2％分離物的選擇和維持所用的菌株是來自Merck培養(yǎng)中心或臨床測試的分離物。流感嗜血菌的菌株是用于Merck體內(nèi)測試的小鼠病原菌。大腸桿菌菌株是細胞壁可滲透的菌株。Candida albicans菌株用作對照。將這些培養(yǎng)物作為a)Microbank珠子；b)2×脫脂乳；或c)2×Trypticase大豆培養(yǎng)液+15％甘油/50％馬血清(嗜血菌和肺炎鏈球菌)中的冷凍儲液維持于-80℃。
接種物制備將所選擇的分離物再次培養(yǎng)于巧克力瓊脂平板(流感嗜血菌)，胰胨豆胨+5％羊血瓊脂平板(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌、芽胞桿菌)或Sabouraud葡萄糖瓊脂(假絲酵母)，并在35℃培養(yǎng)。將嗜血菌和肺炎鏈球菌在5％CO2中培養(yǎng)；所有其他分離物在大氣中培養(yǎng)。在測試前將分離物再次培養(yǎng)2次。
從平板選擇菌落并用于制備胰胨豆胨培養(yǎng)液中等于0.5McFarland標準的接種物。從肺炎鏈球菌制備等于1.0M cFarland標準密度的接種物。所有培養(yǎng)物的接種密度為TSB中～108CFU/mL。將該TSB接種物以1∶10稀釋于無菌鹽水中(4mL接種物+36mL鹽水；等于～107CFU/mL)并保持于冰上直至用于接種微量滴定平板。
對隨機選擇的分離物進行菌落計數(shù)來證實CFU/孔(TSB接種物以10-5，10-6涂布于TSA II+5％SB或巧克力瓊脂平板，培養(yǎng)過夜，35℃，CO2)。
平板填充將96孔微量滴定平板(Dynex)的所有孔裝滿100TL培養(yǎng)基。制備嗜血測試培養(yǎng)基來測試流感嗜血菌；制備陽離子-調(diào)節(jié)的MullerHinton+5％裂解的馬血平板來測試腸球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌。RPMI 1640用于測試假絲酵母。在陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton和陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton+50％人血清中測定對抗金黃色葡萄球菌Smith的MIC，來測定化合物是否受到血清中一些成分的滅活(通過MIC提高來表示)。將裝滿的平板包裝于塑料袋中(以最小化蒸發(fā))，冷凍存儲并在使用前融化。
化合物的制備以重量基礎來制備化合物。在100％DMSO中制備2mg/mL的化合物，然后在1∶1稀釋度的DMSO/2x CAMHB中稀釋至1mg/mL(終濃度＝50％DMSO/50％CAMHB)。將化合物連續(xù)1∶1稀釋于BDBiosciences Deep Well聚丙烯96孔平板中的50％DMSO/50％CAMHB中(起始濃度1mg/mL)。
微量培養(yǎng)液稀釋測試使用Finn自動化多道移液管，(0.5-10μL體積)，將6.4TL抗微生物溶液加入裝滿的微量滴定平板的孔中(第一個孔中的抗微生物劑濃度＝64g/mL；DMSO的濃度＝3.2％)。以這種方式加入抗微生物劑來保持每個孔中的DMSO量恒定(來保持化合物溶解和計算通過DMSO非特異性殺滅的可能性)。最后一列含有3.2％DMSO的生長對照。
伴隨每次測試，進行對照。它們是青霉素G和氯霉素，以和化合物相同的方式來制得。對于血清蛋白結合測試包括ertapenem作為對照。
平板接種將微量滴定平板的所有孔接種(鹽水稀釋的)培養(yǎng)物，使用MIC2000系統(tǒng)，一種自動化平板培養(yǎng)裝置，其傳送每孔1.5TL的接種物。將平板在大氣中35℃培養(yǎng)。還培養(yǎng)了未接種平板作為無菌檢測。在22-24小時培養(yǎng)后記錄結果。閱讀平板至沒有生長。將MIC定義為導致22-24小時培養(yǎng)后沒有生長的最低抗菌水平。
化合物I證明了對抗金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、枯草芽胞桿菌和大腸桿菌各種菌株的抗菌活性?；衔颕還證明了對抗對許多已知抗生素抗性的各種菌種的抗菌活性，如2，6二甲氧基苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)，萬古霉素抗性的腸球菌(VRE)，多種藥物抗性的屎腸球菌，大環(huán)內(nèi)酯抗性的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，和linezolid抗性的金黃色葡萄球菌和屎腸球菌。對于這些測試菌種，最小抑制濃度(MIC)值為0.5至32μg/mL。根據(jù)NCCLS準則獲得MIC。
序列表<110>Merck Sharp & DohmeAngela BasilioOlga GenilloudIgnacio GonzalezOscar SalazarMerck & Co.Inc.
Hiranthi JayasuriyaSheo B.SinghJun Wang<120>抗菌化合物<130>21516Y PCT<150>60/573,899<151>2004-05-24<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1445<212>DNA<213>微生物<400>1cctccttcgg gaggggatta gctggcgaac gggtgagtaa cacgtgggca atctgccctt 60cactctggga caagccctgg aaacggggtc taatacccgg atacgacaca cgaccgcatg 120gtctgtgtgt ggaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt 180ggggtgatgr cctaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac 240tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg 300ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc 360tttcagcagg gaagaagcga gagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt 420gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga 480gctcgtaggc ggcttgtcac gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat 540tcgatacggg caggctagag ttcggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa 600tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat ctctgggccg atactgacgc 660tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 720
cgttgggaac taggtgtggg cgacattcca cgtcgtccgt gccgcagcta acgcattaag 780ttccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 840acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcca aagaacctta ccaaggcttg 900acatacaccg gaaacgtctg gagatcaggc gcccccttgt gtccggtgta tcatggtggt 960gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttggggtt taaktccccg caacgagcgc 1020aacccttgtt ctgtgttgcc agcatgccct tcggggtgat ggggactcac aggagactgc 1080cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg 1140gctgcacacg tgctacaatg gccggtacaa tgagctgcga taccgcgagg tggagcgaat 1200ctcaaaaagc cggtctcagt tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt 1260tgctagtaat cgcagatcag cattgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1320gcccgtcacg tcacgaaagt cggtaacacc cgaagccggt ggcccaaccc cttgtgggag 1380ggaatcgtcg aaggtgggac tggcgattgg gacgaagtcg taacaaggta gccgtaccgg 1440aaggt 144權利要求
1.結構通式I的化合物 或其藥物學上可接受的鹽。
2.制備結構通式I化合物的方法 其包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)ATCC#PTA-5942(MA7338)鏈霉菌或其天然或人工突變體并從發(fā)酵液中回收化合物I。
3.權利要求
2的方法，其中在約10至約40℃的溫度進行發(fā)酵。
4.權利要求
3的方法，其中在約28℃的溫度進行發(fā)酵。
5.ATCC保藏號為ATCC#PTA-5942(MA7338)的鏈霉菌。
6.藥物組合物，所述組合物包含藥物學上可接受的載體和有效量的權利要求
1的結構I化合物。
7.治療需要這樣治療的宿主細菌感染的方法，所述方法包括給藥有效量的權利要求
1的結構I化合物。
專利摘要
用真細菌鏈霉菌發(fā)酵營養(yǎng)培養(yǎng)基來產(chǎn)生結構通式(I)的新抗菌化合物。
文檔編號A61K31/185GK1993313SQ200580016619
公開日2007年7月4日 申請日期2005年5月20日
發(fā)明者A·巴西利奧, O·格尼洛德, H·亞亞蘇里亞, I·貢扎萊斯, S·B·辛, O·薩拉扎, J·王 申請人:默克公司, 默沙東西班牙股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan