專利名稱:通過二硫化物交聯(lián)進(jìn)行體外蛋白質(zhì)合成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)高效合成具有分子內(nèi)或分子間二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
人們?cè)噲D通過基因重組技術(shù)來生產(chǎn)可用作藥物或試劑的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，考慮到操作的簡(jiǎn)便性和效率，人們已將諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，霉菌和酵母這樣的微生物，諸如蠶這樣昆蟲，諸如牛這樣哺乳動(dòng)物，以及可栽培植物、昆蟲和動(dòng)物細(xì)胞，目前已用于基因重組技術(shù)中。通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法已被廣泛應(yīng)用。不過，使用這種方法可能導(dǎo)致，譬如目的蛋白的表達(dá)水平低、表達(dá)無活性的蛋白及形成聚集物這些問題。因此，需要反復(fù)進(jìn)行諸如檢查培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)條件或誘導(dǎo)條件，或試驗(yàn)多種表達(dá)系統(tǒng)這樣的試誤(trial-and-error)過程。已報(bào)道許多蛋白甚至在考察這些條件后，也很難被合成。
與此同時(shí)，已知一種不使用這些生物或細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成方法，其也被稱為“無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成”。這種無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)也描述為“體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)”。通過該系統(tǒng)，用從大腸桿菌、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、麥胚細(xì)胞或其它類似細(xì)胞中所制備的提取物或天然成分對(duì)模板基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄/翻譯，從而合成蛋白質(zhì)。無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的特征在于可克服使用生物或細(xì)胞所遇到的限制。這是因?yàn)橛迷撓到y(tǒng)可合成干擾生物和細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)，可通過96孔板或384孔板的形式合成多種蛋白質(zhì)，并可同時(shí)對(duì)多種合成條件進(jìn)行測(cè)試。
但已知即使使用這種無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，仍有一個(gè)問題，即合成的蛋白質(zhì)形成了凝聚物而不形成為相應(yīng)的天然結(jié)構(gòu)。其原因可能是具有分子間和/或分子內(nèi)二硫鍵的蛋白質(zhì)的二硫鍵不能正確交聯(lián)。有些蛋白質(zhì)具有分子間和/或分子內(nèi)二硫鍵，而有些沒有。許多轉(zhuǎn)運(yùn)并分泌到細(xì)胞表面或細(xì)胞外環(huán)境的蛋白質(zhì)具有二硫鍵。而這些蛋白質(zhì)具有特別重要的應(yīng)用價(jià)值。例如，諸如胰島素、細(xì)胞因子和血細(xì)胞生長(zhǎng)因子等絕大多數(shù)已商品化的蛋白質(zhì)制品，其組分中都含有具有分子間二硫鍵的蛋白。
因此，為了高效生產(chǎn)這種具有分子間/分子內(nèi)二硫鍵的蛋白質(zhì)，對(duì)無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)。例如，已進(jìn)行了以下方法向細(xì)胞提取物中加入微粒體組分的方法(非專利文獻(xiàn)1Biochem.J.254805-810(1988)，下文以現(xiàn)有技術(shù)1表示)；對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行透析的方法，添加氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽的方法，凝膠過濾的方法，調(diào)節(jié)氧化-還原(redox)電勢(shì)的方法(非專利文獻(xiàn)2FEBS Lett.514290-4(2002)；非專利文獻(xiàn)3Nature Biotech.1579-84(1997)；專利文獻(xiàn)1JP Patent Publication(Kokai)No.2003-116590；專利文獻(xiàn)2WO 03/072796 A1，下文以現(xiàn)有技術(shù)2表示)。
而且已知一種使用了可維持還原態(tài)的酶的缺失變異體來形成二硫鍵的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.9613703-13708(1999)，下文以現(xiàn)有技術(shù)3表示)。通過該方法，目的蛋白可用缺失硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶的大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。但通常缺失這種酶的細(xì)胞系生長(zhǎng)非常緩慢，或者需要特殊的培養(yǎng)條件，這在工業(yè)實(shí)用性上是很大的障礙。這種方法利用可在大腸桿菌中導(dǎo)致基因重組的系統(tǒng)來表達(dá)蛋白。不過如上所述，對(duì)生物的直接使用存在多種限制。此外，許多生物除硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶外，還含有許多未被鑒定的可控制氧化-還原反應(yīng)的酶和底物(非專利文獻(xiàn)4Nature ReviewMolecular Cell Biology 3836-847(2002))。因此，即使外源蛋白可用這種缺失變異體進(jìn)行表達(dá)，或用以缺失變異體的細(xì)胞提取物為無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)來進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，也很難形成穩(wěn)定的二硫鍵。因此，報(bào)道了一種用碘乙酰胺處理細(xì)胞提取物以滅活這些酶和底物的方法(US 6,548,276 B2，下文以現(xiàn)有技術(shù)4表示)。根據(jù)該方法，不僅可滅活谷胱甘肽還原酶和氧還蛋白還原酶，而且也可以滅活多種控制細(xì)胞內(nèi)氧化-還原反應(yīng)的酶和底物。但由于碘乙酰胺以非特異形式修飾硫醇，因此它也可能修飾轉(zhuǎn)錄/翻譯相關(guān)的因子和酶基團(tuán)、核糖體蛋白及類似物質(zhì)。從而產(chǎn)生的問題是體外蛋白合成反應(yīng)的高效性和精確性被破壞。
同時(shí)，與已廣泛使用的、用生物和細(xì)胞通過重組方式來合成蛋白的方法一樣，化學(xué)合成的肽或通過無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)合成的蛋白質(zhì)也可用變性劑進(jìn)行完全變性，然后對(duì)其進(jìn)行再生(非專利文獻(xiàn)5Biochemistry 263129-3134(1987)，下文以現(xiàn)有技術(shù)5表示)。在現(xiàn)有技術(shù)5中，由于蛋白質(zhì)是化學(xué)合成的、或即使使用生物體也是以無活性的不可溶形式回收的，因此可生產(chǎn)例如毒素蛋白。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)再生時(shí)，不再使用細(xì)胞，試劑和鹽可相互自由結(jié)合，從而在具有二硫鍵的蛋白質(zhì)中正確地引入二硫鍵。但當(dāng)使用該方法時(shí)也有一些問題，需要不同的步驟來進(jìn)行蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)再生，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)再生是耗時(shí)的步驟(需要幾天到一周的時(shí)間)。
另外，根據(jù)眾所周知的測(cè)定催化促進(jìn)和/或異構(gòu)化二硫鍵的酶的活性的方法，用作底物的核糖核酸酶A(RNaseA)被還原而變性，RNaseA與某種測(cè)定了活性的酶一起再折疊并再生后測(cè)定其活性，所獲得的核糖核酸酶活性可作為一個(gè)指標(biāo)(非專利文獻(xiàn)6Biochem J.1976159377-384)。
專利文獻(xiàn)1JP Patent Publication(Kokai)No.2003-116590 A專利文獻(xiàn)2WO 03/072796 A1專利文獻(xiàn)3US 6,548,276 B2非專利文獻(xiàn)1Biochem.J.254805-810(1988)非專利文獻(xiàn)2FEBS Lett.514290-294(2002)非專利文獻(xiàn)3Nature Biotech.1579-84(1997)非專利文獻(xiàn)4Nature Review Molecular Cell Biology 3836-847(2002)非專利文獻(xiàn)5Biochemistry 263129-3134(1987)非專利文獻(xiàn)6Biochem J.159377-384(1976)
發(fā)明內(nèi)容
[蛋白質(zhì)合成]傳統(tǒng)的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)在生產(chǎn)具有分子內(nèi)和/或分子間二硫鍵的蛋白時(shí)具有下列缺點(diǎn)。在現(xiàn)有技術(shù)1中，要考慮到必須從胰腺或者其它部位通過勻化和離心的方式來制備微粒體部分；微粒體部分是通過破壞被稱作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)——二硫鍵最初就是在這里形成的——的細(xì)胞器來獲得的，這樣微粒體部分中形成二硫鍵的效率要低于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；并且形成的二硫鍵與天然狀態(tài)會(huì)有所差異，因此可能會(huì)觀察不到蛋白活性——這是個(gè)問題。在現(xiàn)有技術(shù)2中，無需制備微粒體部分，可通過諸如添加氧化型谷胱甘肽與還原型谷胱甘肽或者透析這樣的簡(jiǎn)單方法來制備細(xì)胞提取物。不過，難以制備具有很好重復(fù)性的氧化-還原狀態(tài)從而使得二硫鍵可以高效交聯(lián)的反應(yīng)液。這是因?yàn)橥ǔＳ米鳠o細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的細(xì)胞提取物含有多種類型的處于還原態(tài)的酶和底物，包括硫氧還蛋白還原酶[EC 1.6.4.5]和谷胱甘肽還原酶[EC 1.6.4.2](Nature Review Molecular Cell Biology 3836-847(2002))。因此，認(rèn)為這些酶和底物的功能在調(diào)節(jié)氧化-還原態(tài)時(shí)會(huì)出現(xiàn)困難，即便經(jīng)透析或添加谷胱甘肽也如此。當(dāng)向無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中加入諸如氧化型谷胱甘肽(GSSG)這樣的氧化劑時(shí)，可使用GSSG和還原型谷胱甘肽(GSH)的氧還緩沖液。GSSG∶GSH的比例一般在1∶5到1∶10之間。該比例基于氧化劑濃度以及從多項(xiàng)研究中所獲得的比例，在這些研究中，先將RnaseA或溶菌酶還原變性進(jìn)行再折疊，由此檢測(cè)結(jié)構(gòu)與活性之間的相互關(guān)系(Biochemistry 1991 30613-619；Biochemistry 197095015-5023))。因此，該比例對(duì)于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)而言并非一定合適。此外，術(shù)語“氧化-還原電位”指的是由于氧化型與還原型之間化學(xué)電位差異形成的電位，通過在可實(shí)現(xiàn)可逆電轉(zhuǎn)移的平衡態(tài)中使用諸如鉑電極這樣的電極來測(cè)量。該電位只是基于參與溶液中氧化還原反應(yīng)的多種有機(jī)/無機(jī)物(例如，氧、金屬、半胱氨酸和亞鐵血紅素)在氧化還原平衡態(tài)時(shí)的電位的觀察資料獲得的。因此，它并不是一個(gè)能夠表現(xiàn)硫醇和二硫化物之間平衡態(tài)的指標(biāo)，并不反應(yīng)蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)。所以，即便氧化-還原電位能夠如現(xiàn)有技術(shù)2中所示那樣輕易調(diào)節(jié)到給定水平，想要調(diào)控蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成也是非常困難的。
在現(xiàn)有技術(shù)1和2兩個(gè)實(shí)例中，問題在于蛋白合成效率會(huì)降低。這是因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞提取物經(jīng)過諸如添加微粒體、透析或者添加氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽等處理后，其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境與最初進(jìn)行蛋白合成的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相比已經(jīng)發(fā)生了變化。因此，無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)在工業(yè)水平上的應(yīng)用非常困難。
本發(fā)明人已經(jīng)揭示了一種方法，其中構(gòu)成體外DNA轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或者RNA翻譯系統(tǒng)反應(yīng)液中的部分或者全部蛋白組分，均用一對(duì)可彼此附著的物質(zhì)中的一個(gè)來標(biāo)記(JP Patent Publication(Kokai)No.2003-102495 A，即下文中的重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(再構(gòu)成タンパク質(zhì)合成系)。該方法與傳統(tǒng)無細(xì)胞系統(tǒng)及體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(即下文中的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng))完全不同。具體而言，該方法的特點(diǎn)在于在不使用細(xì)胞提取物的情況下純化與蛋白合成相關(guān)的不同組分，通過重構(gòu)合成蛋白質(zhì)，由此可以合成或者快速純化不具有分子內(nèi)二硫鍵的蛋白(Nature Biotechnology 19732-734(2001))。但并沒有關(guān)于具有分子內(nèi)/分子間二硫鍵的蛋白，由不同組分以怎樣的濃度重構(gòu)可使得它們能具有原始結(jié)構(gòu)和功能，并且可高效合成。
因此，期待出現(xiàn)一種更方便、且可有效生產(chǎn)具有分子內(nèi)和/或分子間二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的目的就是提供一種通過使用重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，可方便、高效生產(chǎn)具有二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法。
上述傳統(tǒng)方法的問題是需要將RNaseA進(jìn)行暫時(shí)變性，而且再折疊的步驟比較耗時(shí)。
本發(fā)明的發(fā)明人為了達(dá)到上述目的進(jìn)行了深入的研究，從而發(fā)現(xiàn)通過使用除去了影響氧化還原狀態(tài)的酶和底物、并能夠人工調(diào)節(jié)二硫鍵和硫醇之間的氧化還原平衡狀態(tài)的重構(gòu)蛋白質(zhì)系統(tǒng)可高效合成具有原始結(jié)構(gòu)和活性的、含有分子間/分子內(nèi)二硫鍵的蛋白。該體系可代替細(xì)胞提取物或粗組分，所述細(xì)胞提取物或粗組分由于含有多種硫氧還蛋白還原酶[EC 1.6.4.5]和谷胱甘肽還原酶[EC 1.6.4.2]等維持還原狀態(tài)的酶和底物而使氧化還原狀態(tài)難以調(diào)節(jié)。
另外，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)由純度90％或以上的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水所組成的重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)是特別優(yōu)選的。從而完成了本發(fā)明。
一般來說，在細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成位點(diǎn)，氧化還原狀態(tài)接近于還原態(tài)，因此細(xì)胞中合成的蛋白是還原態(tài)的。在無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)中，再現(xiàn)了這種細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，因此在體系中通常含有DTT和其它還原劑。不過也報(bào)道當(dāng)不含有還原劑時(shí)，則不利于提取物的保存或降低翻譯效率(Eur.J Biochem.2704780-4786(2003))同時(shí)，與硫醇形成二硫鍵也不需要還原態(tài)。因此，希望除去體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系中作為還原劑的DDT，或降低加入到該體系中的DTT的量，以在蛋白中形成二硫鍵。但如上所述，其得到的效果有限。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明的方法，既然在重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中影響二硫鍵和硫醇平衡狀態(tài)的組分的量是可以確定的，因此可加入幾μM到1mM的量DTT。另外，也可以不加入DTT。
另外，一般認(rèn)為使用不含DTT的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的傳統(tǒng)方法，即使在蛋白質(zhì)可形成二硫鍵的條件下，合成的蛋白質(zhì)量也會(huì)降低，而且合成有活性的目標(biāo)蛋白的效率被削弱。但令人驚訝的是，當(dāng)使用本發(fā)明所述的重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)時(shí)，合成的蛋白質(zhì)量不發(fā)生改變，甚或會(huì)增加，從而可高效合成蛋白質(zhì)。
換句話說，與傳統(tǒng)方法不同，本發(fā)明提供了一種高效合成具有二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法，其中蛋白質(zhì)合成試劑包含特定存在量和純度、且不含影響氧化還原狀態(tài)的雜質(zhì)的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水再生的，不使用無細(xì)胞提取物；而且重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)質(zhì)的二硫鍵和硫醇間的氧化還原平衡是可人工調(diào)節(jié)的。
另外，優(yōu)選地，經(jīng)重構(gòu)的上述蛋白質(zhì)合成基本試劑，使其含有特定量的、高度純化的且純度為90％或以上的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。蛋白質(zhì)合成基本試劑例如可以使用除去了DTT的Pure system(PostGenome Institute Co.，Ltd.)。根據(jù)上述的蛋白質(zhì)合成方法，可通過向上述蛋白質(zhì)合成試劑中加入(i)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑和/或(ii)催化氧化還原反應(yīng)的酶而人工調(diào)節(jié)二硫鍵和硫醇間的氧化還原平衡。可在反應(yīng)起始前、反應(yīng)中或反應(yīng)后加入這些物質(zhì)。
更具體而言，(i)作為調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑，包括例如DTT和氧化型谷胱甘肽。另外，(ii)作為催化氧化還原反應(yīng)的酶的實(shí)例，包括蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和二硫鍵交換蛋白。
此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成方法可用作生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)方法，包括測(cè)定生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的活性、加入的催化氧化還原反應(yīng)的氧化還原酶試劑添加量和加入的氧化還原試劑的添加量之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)合成試劑是由預(yù)定的、特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水重構(gòu)的。優(yōu)選地，可以變更蛋白質(zhì)合成試劑中可催化氧化還原反應(yīng)的氧化還原酶試劑和氧化還原試劑的量。如上所述，通過向重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中加入可改變氧化還原平衡狀態(tài)的試劑至所需的終濃度，則可以在生產(chǎn)的蛋白質(zhì)中形成或不形成二硫鍵交聯(lián)。
換句話說，根據(jù)本發(fā)明通過重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)正確地了解所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)形成所需的二硫鍵交聯(lián)的條件。因此得到的信息可作為上述蛋白質(zhì)合成條件。
可在反應(yīng)起始前、反應(yīng)中或反應(yīng)終止后加入氧化還原酶試劑和氧化還原試劑。
氧化還原酶試劑的實(shí)例包括DTT和GSSG。氧化還原試劑的實(shí)例包括蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和二硫鍵交換蛋白。
可提前制備不同濃度的試劑，并在反應(yīng)起始前(加入模板核酸前)、反應(yīng)中或反應(yīng)終止后加到各反應(yīng)體系中。
具體而言，可以使用前述蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)通過上述方法來進(jìn)行活性測(cè)定，但要在翻譯時(shí)或翻譯后加入已測(cè)定活性的催化促進(jìn)和/或異構(gòu)化二硫鍵的酶。作為底物的蛋白質(zhì)是以編碼該蛋白質(zhì)的模板DNAs或RNA加入的。用作底物的蛋白質(zhì)類型沒有特別限定。優(yōu)選地，這種蛋白質(zhì)具有已知的結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選地，它們是酶類。這種底物的實(shí)例包括溶菌酶和堿性磷酸酶。另外，根據(jù)本方法，可測(cè)定促進(jìn)二硫鍵形成和/或催化二硫鍵異構(gòu)化的酶活性，而另一方面，可篩選抑制所述活性的底物。對(duì)于篩選而言，可使用催化促進(jìn)二硫鍵形成或催化二硫鍵異構(gòu)化的酶與檢測(cè)底物進(jìn)行篩選。
進(jìn)一步，本發(fā)明包括由以下(1)a)和b)、(2)a)和c)或(3)a)，b)和c)所組成的試劑盒a)包含具有特定的存在量和純度的多種組分的、在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑；b)至少一種具有特定的存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定的存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
具體而言，根據(jù)本發(fā)明，提供一種包含以下a)到c)的試劑盒a)包含具有特定的存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑，而且在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)；b)至少一種具有特定的存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定的存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
本發(fā)明描述包括作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)No.2004-136520的說明書和/或附圖等處所述的部分或全部?jī)?nèi)容。
附圖簡(jiǎn)要描述圖1所示的是核糖體粗提取物的6％到36％蔗糖密度梯度組分。
圖2所示的是經(jīng)12％SDS-PAGE/考馬斯亮蘭染色的His標(biāo)記的丙氨酰-tRNA合成酶(AlaRS)、精氨酸t(yī)RNA合成酶(ArgRS)、天冬酰氨tRNA合成酶(AsnRS)、天冬氨酸t(yī)RNA合成酶(AspRS)、半胱氨酸t(yī)RNA合成酶(CysRS)、谷氨酰胺tRNA合成酶(GlnRS)和谷氨酸t(yī)RNA合成酶(GluRS)的照片。
圖3所示的是合成的人溶菌酶的電泳照片(鍵頭指示合成的人溶菌酶)。
圖4所示的是合成的人溶菌酶的比活性。
圖5所示的是合成的mIL6蛋白質(zhì)的量。
圖6所示的是合成的DHFR蛋白質(zhì)的量。
圖7所示的是合成的人溶菌酶的比活性(PDI濃度的影響)。
圖8所示的是合成的人溶菌酶的比活性(存在0.13μM PDI時(shí)DTT濃度的影響)。
圖9所示的是合成的堿性磷酸酶的活性(存在0.13μM PDI和1mMDTT時(shí)GSSG濃度的影響)。
圖10所示的是合成的堿性磷酸酶的活性(存在PDI時(shí)DTT濃度變化的影響)。
圖11所示的是合成的溶菌酶的活性(加入或不加DsbC的影響)。
圖12所示的是合成的堿性磷酸酶的活性(本發(fā)明的方法與使用細(xì)胞提取物的方法的比較)。
圖13所示的是EF-Tu洗脫組分的電泳照片。
圖14所示的是純化的DsbA(泳道1)和DsbC(泳道2)的電泳照片。
發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明不限于以下的優(yōu)選實(shí)施方案。另外，所有修改和變化都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的體外DNA轉(zhuǎn)錄/翻譯體系或RNA翻譯體系包括加入諸如mRNA、cDNA等可編碼目標(biāo)蛋白的模板的蛋白質(zhì)合成的基本組分的蛋白質(zhì)合成試劑、和(i)用來人工調(diào)節(jié)二硫鍵和硫醇間的氧化還原平衡的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑、和/或(ii)催化氧化還原的酶。
本發(fā)明的方法包括合成具有分子內(nèi)或分子間二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法，包括用(1)包含以下a)和b)的反應(yīng)體系，(2)包含以下a)，b)和c)的反應(yīng)體系，(3)包含以下a)，b)和d)的反應(yīng)體系，(4)包含以下a)，b)，c)和d)的反應(yīng)體系a)至少一個(gè)編碼目標(biāo)蛋白的模板核酸；b)蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的基本試劑，其包含具有特定存在量和純度的多種成分，在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)；c)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及d)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
蛋白質(zhì)合成基本試劑，特征在于其組分包括具有特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。但不必包括以上所有組分，可以根據(jù)需要選擇性地包含上述組分。
用于構(gòu)建體系的組分不必包括細(xì)胞提取物或細(xì)胞提取物的粗成分。另外，期望能夠計(jì)算影響蛋白質(zhì)二硫鍵形成的物質(zhì)的濃度。
在本發(fā)明的重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，構(gòu)建體系的所有組分都是重構(gòu)的。因此很容易確定這些組分并計(jì)算其含量。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成基本反應(yīng)試劑可用于進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)錄/翻譯或RNA翻譯等用于蛋白質(zhì)合成的反應(yīng)系統(tǒng)。在本發(fā)明中，術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸通過肽鍵相互連接，包括肽、寡肽和多肽。術(shù)語“RNA”包括化學(xué)合成的RNA和mRNA。術(shù)語“DNA”包括合成的DNA、DNA載體、基因組DNA、PCR產(chǎn)物和cDNA。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成基本反應(yīng)試劑，包括具有特定存在量和純度的組分，各組分指分別進(jìn)行純化、其濃度可測(cè)定且可以定量的組分。在本發(fā)明中，具有特定存在量和純度的多種組分，是那些通過諸如鹽析、色譜、電泳、溶解度差異、重結(jié)晶和離心等純化物質(zhì)的方法分別進(jìn)行純化的物質(zhì)。這些通過色譜、電泳、質(zhì)量分析、離心等類似分析方法所獲得的物質(zhì)的純度均在約80％或以上，更優(yōu)選地在90％或以上。例如，對(duì)蛋白質(zhì)而言，主要通過色譜進(jìn)行純化，其純度通過SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行測(cè)定。對(duì)核糖體而言，主要通過超離心純化，其純度通過超離心沉降分析而測(cè)定。核糖體是一種聚合的分子，分子量為幾百萬，包括大量RNA分子(原核生物中有3種RNA分子23S、5S和16S；真核生物中有4種RNA分子28S、5.8S、5S和18S)和大量核糖體蛋白(原核生物中約50種，真核生物中約80種)。由于是聚合的分子，故可通過沉降分析來鑒定并測(cè)定其純度。另外，tRNAs通常是包含74到94個(gè)核苷酸并具有多種核苷酸序列的分子，可通過電泳來分離鑒定分子，并測(cè)定260nm和280nm處吸光度而測(cè)定其純度。另外，低分子量物質(zhì)例如氨基酸和鹽可通過常規(guī)方法例如色譜、融點(diǎn)測(cè)定、元素分析和質(zhì)量分析進(jìn)行鑒定，并測(cè)定其純度。
作為蛋白質(zhì)合成基本試劑的用于轉(zhuǎn)錄/翻譯的因子和酶的實(shí)例，不僅包括來源于大腸桿菌等原核細(xì)胞中的物質(zhì)，而且也包括來源于真核細(xì)胞的物質(zhì)(1)對(duì)基于RNA的翻譯而言，包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、tRNAs、三磷酸腺苷(ATP)、鳥苷三磷酸(GTP)、氨基酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水，對(duì)于來源于大腸桿菌等原核細(xì)胞的反應(yīng)體系進(jìn)一步包括甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶；及(2)對(duì)基于DNA的轉(zhuǎn)錄/翻譯而言，除了(1)，還包括尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)和諸如T7 RNA聚合酶之類的RNA聚合酶。
構(gòu)建本發(fā)明的反應(yīng)體系的各種類型的因子和酶在大腸桿菌、霉菌、酵母和培養(yǎng)細(xì)胞等生物體內(nèi)均存在。因此，可分別高效純化這些物質(zhì)作為組分。但優(yōu)選地是使用重組產(chǎn)物，因?yàn)檫@可以大規(guī)模地獲得各種蛋白質(zhì)，而且會(huì)減少未知的、不必要的或抑制性組分被引入反應(yīng)體系的可能性。
具體而言，將編碼起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶或RNA聚合酶的基因連接到合適的載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、霉菌、酵母或類似系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。 然后純化蛋白質(zhì)，獲得構(gòu)建本發(fā)明的反應(yīng)體系的組分。當(dāng)用轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生各種類型的因子和酶時(shí)，蛋白質(zhì)可完整表達(dá)或以融合蛋白的形式表達(dá)。融合蛋白的實(shí)例包括組氨酸標(biāo)簽(以下以His-Tag表示)、strept-Tag、GST-Tag和FLAG-Tag(Appl Microbiol Biotechnol.60(5)523-533(2003))。
根據(jù)需要可從多種方法中選擇使用已知的His-Tag和鎳柱來純化His標(biāo)記的蛋白質(zhì)組分。作為實(shí)例，這種方法簡(jiǎn)要描述如下1.通過基因工程技術(shù)獲得目標(biāo)蛋白N末端結(jié)合了His-Tag(含6個(gè)His)的融合蛋白；2.在冰上超聲破碎表達(dá)His標(biāo)記蛋白的細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮于上樣緩沖液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH 8.0)中；3.將細(xì)胞裂解液進(jìn)行離心(30,000g，4℃，30分鐘)分離；4.向上述獲得的上清中加入用冰冷上樣緩沖液平衡的50％Ni2+-NTA漿(Qiagen公司制)，4℃攪拌1小時(shí)；
5.將樹脂上樣到柱上，然后用20倍柱體積的上樣緩沖液在4℃洗滌柱；6.用20倍柱體積的上樣緩沖液(含10mM咪唑，pH 8.0)在4℃洗滌柱；及7.用20倍柱體積的上樣緩沖液使目標(biāo)蛋白從柱上洗脫下來，收集組分(每份1ml)，并通過SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白，其中，所述緩沖液中咪唑濃度梯度設(shè)定為從10到250mM。
更優(yōu)選地，在上述蛋白質(zhì)純化后，向本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入以下不直接參與蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的、構(gòu)建反應(yīng)體系的各種因子和酶如肌酸激酶、肌激酶和核苷二磷酸激酶等與能量再生相關(guān)的酶；及諸如無機(jī)焦磷酸酶這樣的降解轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)所產(chǎn)生的無機(jī)焦磷酸的酶。
此處，鹽必須含有轉(zhuǎn)錄/翻譯所需的陽離子和陰離子。通常使用包括谷氨酸鉀、氯化銨、醋酸鎂和氯化鈣等。除了上述鹽類，也可以選擇使用其他合適的鹽。水包括不含離子、微生物、酶的水，例如用Milli-Qsystem(Millipore)生產(chǎn)的水制備裝置制備的水及商品化的純水。
核糖體是肽合成的場(chǎng)所。當(dāng)其與mRNA結(jié)合時(shí)，氨酰tRNA位于核糖體A位點(diǎn)，而甲酰甲硫氨酰tRNA或肽酰tRNA位于P位點(diǎn)，從而形成肽鍵(Science 289920-930(2000))。在本發(fā)明中，只要是具有這種功能的核糖體即可，與其來源無關(guān)?？捎玫膶?shí)例包括來源于大腸桿菌的核糖體和來源于真核細(xì)胞的核糖體。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的核糖體來源于如大腸桿菌A19菌株和大腸桿菌MRE600菌株等大腸桿菌。
作為本發(fā)明的體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的起始因子是形成翻譯起始復(fù)合物所必需的，或明顯促進(jìn)翻譯起始復(fù)合物形成的因子，可使用那些已知來源于大腸桿菌的因子，譬如IF1、IF2和IF3(Biochemistry295881-5889(1990))。起始因子IF3啟動(dòng)作為翻譯起始的必要步驟的70S核糖體解離為30S亞基和50S亞基。另外，它在翻譯起始復(fù)合物形成時(shí)抑制除了甲酰甲硫氨酰tRNA外的其他tRNA插入到P位點(diǎn)。起始因子IF2與甲酰甲硫氨酰tRNA結(jié)合，并將甲酰甲硫氨酰tRNA運(yùn)送到30S核糖體亞基的P位點(diǎn)，從而形成翻譯起始復(fù)合物。起始因子IF1促進(jìn)起始因子IF2和IF3的功能。本發(fā)明中所用的起始因子的優(yōu)選實(shí)例包括來源于例如大腸桿菌K12菌株等大腸桿菌的起始因子。另外，也可使用來源于真核細(xì)胞的起始因子。
共有兩種類型的EF-Tu延伸因子GTP和GDP。GTP與氨酰tRNA結(jié)合，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體的A位點(diǎn)。當(dāng)EF-Tu離開核糖體時(shí)，GTP被水解轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP(EMBOJ.177490-7497(1998))。同時(shí)，延伸因子EF-Ts與EF-Tu(GDP)結(jié)合，促進(jìn)GDP轉(zhuǎn)化為GTP(Archives ofBiochemistry and Biophysics 348157-162(1997))。另外，延伸因子EF-G在肽鏈延伸過程中肽鍵形成后促進(jìn)轉(zhuǎn)位反應(yīng)(Nature StructureBiology 6643-647(1999)；FEMS Microbiology Reviews 23317-333(1999))。本發(fā)明所用的延伸因子的優(yōu)選實(shí)例是來源于大腸桿菌的延伸因子，例如來源于大腸桿菌K12菌株的延伸因子。另外，也可使用來源于真核細(xì)胞的延伸因子。
終止因子是在蛋白質(zhì)合成終止、翻譯的肽鏈解離并開始后續(xù)的mRNA翻譯的過程中核糖體再生所必須的。當(dāng)在沒有終止因子的反應(yīng)體系中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成時(shí)，反應(yīng)在終止密碼子之前停止，從而形成核糖體、肽和mRNA的穩(wěn)定復(fù)合物(多聚體展示方法、核糖體展示方法和體外病毒方法)。另外，通過從反應(yīng)體系中省略RF1和/或RF2而可向肽鏈中引入非天然氨基酸。換句話說，當(dāng)分別省略RF1和RF2時(shí)，可分別在UAG密碼子和UGA密碼子處高效引入非天然氨基酸。
當(dāng)終止密碼子(UAA、UAG或UGA)來到核糖體的A位點(diǎn)時(shí)，終止因子RF1和RF2移動(dòng)到A位點(diǎn)以促進(jìn)肽鏈從肽酰tRNA(位于P位點(diǎn))解離。RF1可識(shí)別終止密碼子UAA和UAG，而RF2可識(shí)別UAA和UGA。終止因子RF3可在RF1和RF2引起肽鏈解離后將RF1和RF2從核糖體上解離下來。核糖體循環(huán)因子(RRF)促進(jìn)在P位點(diǎn)的tRNA在蛋白質(zhì)合成終止后解離下來，使核糖體再生以進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)合成。在本發(fā)明中，RRF也被看作是一種終止因子。另外，在EMBOJ.164126-4133(1997)和EMBOJ.164134-4141(1997)中解釋了RF1、RF2、RF3和RRF終止因子的功能。本發(fā)明所用的終止因子的優(yōu)選實(shí)例是來源于例如源自大腸桿菌K12菌株等大腸桿菌的終止因子。另外，也可使用來源于真核細(xì)胞的終止因子。
氨酰tRNA合成酶是一種在ATP存在下通過將氨基酸與tRNA共價(jià)連接而合成氨酰tRNA的酶(RNA 3954-960(1997)；Protein，NucleicAcid and Enzyme，391215-1225(1994))。本發(fā)明所用的氨酰tRNA合成酶的優(yōu)選實(shí)例是來源于諸如自大腸桿菌K12菌株等大腸桿菌的氨酰tRNA合成酶。另外，也可使用來源于真核細(xì)胞的氨酰tRNA合成酶。另外，也可使用識(shí)別非天然氨基酸的人工氨酰tRNA合成酶(JP PatentNo.2668701)。
甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶(MTF)是一種將甲酰基連接到甲硫氨酰tRNA氨基上而合成N-甲酰甲硫氨酰(fMet)tRNA進(jìn)行原核生物蛋白質(zhì)合成的酶。即甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶可使N10-甲?；~酸的甲?；D(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)于起始密碼子的甲硫氨酰tRNA的N末端，形成fMet-tRNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96875-880(1999))。增加的甲酰基可被起始因子IF2識(shí)別，作為蛋白質(zhì)合成的起始信號(hào)。MTF不存在于真核細(xì)胞質(zhì)中的合成系統(tǒng)中；但存在于真核線粒體和葉綠體合成系統(tǒng)中。本發(fā)明所用的MTF的優(yōu)選實(shí)例是來源于諸如自大腸桿菌K12菌株等大腸桿菌的MTF。
RNA聚合酶是一種將DNA序列轉(zhuǎn)錄為RNA的酶，存在于各種生物中。其中一個(gè)實(shí)例是來源于T7噬菌體的T7 RNA聚合酶。該酶可與稱為T7啟動(dòng)子的特異DNA序列結(jié)合，將下游的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA。本發(fā)明的發(fā)明人在T7 RNA聚合酶的N末端加入一個(gè)His-Tag，從而可在大腸桿菌BL21細(xì)胞系中以融和蛋白的形式大量表達(dá)聚合酶，并用鎳柱通過親和層析進(jìn)行純化。在本發(fā)明中，可與T7 RNA聚合酶一樣使用其它類型的RNA聚合酶。例如，在本發(fā)明中可使用商品化的T3RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
氨基酸的實(shí)例包括天然或非天然氨基酸和帶有天然或非天然氨基酸的tRNA。當(dāng)用這種帶非天然氨基酸的tRNA時(shí)，可將非天然氨基酸引入到蛋白質(zhì)中。
所用的tRNA的實(shí)例包括從大腸桿菌、酵母和類似物質(zhì)中純化的tRNA。另外，可使用反義密碼子或其它堿基被選擇性修飾的人工合成的tRNA(J.Am.Chem.Soc.12134-40(1996)，Nature Biotech.20177-182(2002))。例如，當(dāng)以CUA為反義密碼子的tRNA帶有非天然氨基酸時(shí)，則作為終止密碼子的UAG可被翻譯為非天然氨基酸。用這種方法可通過位點(diǎn)特異的方式在蛋白質(zhì)中引入非天然氨基酸。
另外，通常使用磷酸鉀緩沖液(pH 7.3)作為緩沖液。
影響二硫鍵形成的物質(zhì)的實(shí)例包括可催化二硫鍵氧化還原反應(yīng)的氧化還原酶和/或可調(diào)節(jié)二硫鍵氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。更具體而言，影響二硫鍵形成的酶和/或試劑的實(shí)例包括(i)催化氧化還原的酶，例如包括谷胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白還原酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、二硫鍵交換蛋白和硫氧還蛋白樣蛋白的蛋白質(zhì)；和/或(ii)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑，例如低分子量化合物，包括還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、DTT、2-巰基乙醇和硫氧還蛋白。本發(fā)明中的術(shù)語“氧化還原試劑”是指可將二硫鍵還原為硫醇或?qū)⒘虼佳趸纬啥蜴I的試劑。
優(yōu)選地，促進(jìn)/調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中二硫鍵交聯(lián)的酶和/或底物可用作影響二硫鍵形成的物質(zhì)的(i)氧化還原酶(催化氧化還原反應(yīng)的酶)和/或(ii)氧化還原試劑(可調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑)，。另外，在翻譯反應(yīng)中不必加入(i)催化氧化還原反應(yīng)的酶和/或(ii)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑，其可在反應(yīng)終止后加入這些試劑。優(yōu)選地，當(dāng)在翻譯終止后加入這些試劑時(shí)，應(yīng)在加入后將其放置在37℃幾十分鐘到約1小時(shí)。
當(dāng)DTT用作調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑時(shí)，其濃度為0到1mM，優(yōu)選地為0.001到0.5mM，更優(yōu)選地為0.060到0.5mM。
當(dāng)氧化型谷胱甘肽作為調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑時(shí)，其濃度為0到8mM，優(yōu)選地為0.1到4mM，更優(yōu)選地為1到4mM。
根據(jù)上述蛋白質(zhì)合成的方法，二硫鍵交換蛋白優(yōu)選地為DsbA和/或DsbC。
蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(EC 5.3.4.1.)是一種分子量約為55 kDa的酶，存在于真核生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)壁，可催化二硫鍵的形成、異構(gòu)化和/或還原反應(yīng)。還認(rèn)為該蛋白質(zhì)具有分子伴侶類似的活性。如上所述，該蛋白質(zhì)可在從生物中純化后用作組分。而且可通過重組合成的方法獲得該蛋白質(zhì)。例如，可使用從牛肝純化的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PIRdatabase accession no.ISBOSS)或通過使用大腸桿菌重組表達(dá)酵母的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因而獲得的純化蛋白質(zhì)。
另外，已知以下蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，它們可用作本發(fā)明的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PIR database accession no.ISHUSS)；人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶相關(guān)的蛋白質(zhì)(GenBank accession no.4758304)；和酵母蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶同系物(PIR database accessionno.A44483)。
至于二硫鍵交換蛋白，有四種類型分別稱為二硫鍵交換蛋白A、B、C和D(DsbA、B、C和D)的蛋白質(zhì)存在于大腸桿菌等。DsbA是一種21 kDa具有類似硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)的酶，可催化二硫鍵的形成。DsbB是20kDa的蛋白質(zhì)，具有四個(gè)跨膜區(qū)和兩個(gè)周質(zhì)區(qū)。DsbB可維持DsbA的氧化狀態(tài)。DsbC是一種周質(zhì)蛋白，可形成同型二聚體，具有類似硫氧還蛋白的折疊。DsbC是一種主要負(fù)責(zé)二硫鍵異構(gòu)化、并作為分子伴侶的酶。DsbD是一種分子量59 kDa的蛋白質(zhì)，包括2個(gè)周質(zhì)區(qū)和8個(gè)跨膜區(qū)。DsbD的功能是可維持半胱氨酸作為處于還原狀態(tài)的DsbC的活性中心。
已知以下蛋白質(zhì)是二硫鍵交換蛋白，可用作本發(fā)明的二硫鍵交換蛋白大腸桿菌的DsbA(SWISS-PROT protein database accession no.P24991)；大腸桿菌的DsbC(SWISS-PROT protein database accession no.P21892)；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶dsbA同系物(PIR database accession no.S32895)；腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的硫醇-二硫鍵交換蛋白dsbA同系物NMB0278(PIR database accession no.C81217)；線蟲(Caenorhabditis elegans)的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶I型異構(gòu)體(GeneBank accession no.AAB94647)；和Datisca glomerata的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶同系物(GeneBankaccession no.AAD28260)。
如上所述，可從微生物中純化這些二硫鍵交換蛋白作為組分，而且它們也可以通過重組方法來獲得。
當(dāng)使用蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)作為氧化還原酶時(shí)，其濃度優(yōu)選地是0到10μM，更優(yōu)選地是0.001到5μM，進(jìn)一步優(yōu)選地是0.001到2μM。當(dāng)用二硫鍵交換蛋白作為氧化還原酶時(shí)，其濃度優(yōu)選地是0到10μM，更優(yōu)選地是0.01到10μM，進(jìn)一步優(yōu)選地是0.1到10μM。
另外，優(yōu)選地，二硫鍵交換蛋白包含最低量的谷胱甘肽還原酶和硫氧還蛋白還原酶。優(yōu)選地，硫氧還蛋白還原酶和/或谷胱甘肽還原酶在構(gòu)成蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的組分中的含量為100ng/ml或更少。
另外，如上所述的各組分純度的測(cè)定方法將在下面舉例說明。
可通過以下方式計(jì)算純度上述含有諸如起始因子、延伸因子、終止因子、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、DsbA和DsbC這樣的蛋白質(zhì)的組分，通過His-Tag和鎳柱純化His標(biāo)記蛋白的方法進(jìn)行純化；通過SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白；通過光密度計(jì)測(cè)定每個(gè)泳道的電泳圖譜。
純化的核糖體的純度可通過蔗糖密度梯度分析進(jìn)行測(cè)定。
通常已商品化的試劑，譬如tRNAs、氨基酸、核糖核苷三磷酸、FD、其它類型的緩沖液、DTT和氧化型谷胱甘肽，可按這種試劑商品化形式的純度使用。另外，所有這些商品化的試劑純度均為80％或以上。
對(duì)于本發(fā)明的檢測(cè)方法，可使用[合成具有分子內(nèi)或分子間二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法]所述的反應(yīng)體系。
本發(fā)明的檢測(cè)方法包括測(cè)定氧化還原酶濃度、氧化還原試劑濃度與至少含有一個(gè)肽鏈的合成蛋白質(zhì)的活性之間的相關(guān)性，其中，所述的合成蛋白質(zhì)可通過一個(gè)二硫鍵形成交聯(lián)，而且基于這種交聯(lián)形式可調(diào)節(jié)其活性。通過包含以下a)到d)，和具體地(1)a)，b)和c)，(2)a)，b)和d)，和(3)a)，b)和c)和d)的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)a)至少一個(gè)模板核酸；b)包含多種具有特定的存在量和純度、在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的組分；c)至少一種具有特定的存在量和純度的、可催化二硫鍵氧化還原的氧化還原酶；及d)至少一種具有特定的存在量和純度的、調(diào)節(jié)二硫鍵氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
測(cè)定通過以上反應(yīng)體系合成的蛋白質(zhì)的活性，從而測(cè)定添加的c)氧化還原酶和d)氧化還原試劑之間的相關(guān)性。所測(cè)定的蛋白質(zhì)的活性不僅限于酶活性，還可包含例如，受體和蛋白質(zhì)的結(jié)合活性、細(xì)胞增殖活性、結(jié)合活性和細(xì)胞增殖活性之間的比活性等活性。
更具體而言，制備各種濃度的c)氧化還原酶和d)氧化還原試劑，其中c)和d)均可只含有單一物質(zhì)或者是多種物質(zhì)的混合物。這種氧化還原酶的實(shí)例包括蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、二硫鍵交換蛋白和同系物的酶類。這種氧化還原試劑的實(shí)例包括DTT、GSSG、GSH和硫氧還蛋白。然后起始蛋白合成反應(yīng)。此處，c)和d)可在蛋白質(zhì)合成反應(yīng)開始時(shí)加入，也可以在合成反應(yīng)中加入，或者在合成反應(yīng)停止后加入。當(dāng)在合成反應(yīng)終止后加入c)和d)時(shí)，優(yōu)選地，產(chǎn)物在加入后置于37℃靜置幾十分鐘到1小時(shí)。在上述蛋白質(zhì)合成的每個(gè)例子中，測(cè)定反應(yīng)溶液中所合成的蛋白質(zhì)的活性。此處，被合成的蛋白質(zhì)沒有特別限定，只要是至少具有一個(gè)分子間和/或分子內(nèi)二硫鍵交聯(lián)形成的蛋白質(zhì)即可。例如，可在反應(yīng)溶液中合成多種蛋白質(zhì)，從而形成異源寡聚體或類似物質(zhì)，從而可測(cè)定其活性。
如上所述，可測(cè)定蛋白質(zhì)活性、c)氧化還原酶和/或d)氧化還原試劑的相關(guān)性。
利用所獲得的相關(guān)性，通過測(cè)定實(shí)現(xiàn)預(yù)定活性水平(期望活性水平)必須的c)氧化還原酶和/或d)氧化還原試劑的濃度；向b)蛋白合成反應(yīng)試劑中加入c)氧化還原酶和/或d)氧化還原試劑，使其達(dá)到可獲得期望活性的濃度；及加入a)編碼目標(biāo)蛋白的模板核酸，從而可在反應(yīng)體系中高效合成目標(biāo)蛋白。
參考以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限定于此。
實(shí)施例1核糖體的制備用氧化鋁顆粒破碎處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的大腸桿菌A19細(xì)胞系(300克)。將破碎的細(xì)胞懸浮在緩沖液A(10mM HEPES-氫氧化鉀(pH 7.6，HEPES-KOH)，10m氯化鎂(MgCl2)，50mM氯化鉀(KCl)和1mMDTT)中。然后通過離心(30,000g，4℃，1小時(shí))除去氧化鋁顆粒和破碎的細(xì)胞。接著向得到的上清部分加入脫氧核糖核酸酶(DNase)至終濃度1μg/ml，然后離心(100,000g，4℃，4小時(shí))。將得到的沉淀懸浮在緩沖液A中，制備粗核糖體提取物。將粗核糖體提取物進(jìn)行6％到36％(w/v)蔗糖密度梯度離心。圖1所示的片段來自分離成分。將得到的核糖體組分在100,000g進(jìn)行離心。將得到的沉淀懸浮在核糖體緩沖液(20mM HEPES-KOH(pH 7.6)，6mM MgOAc，30mM NH4Cl，7mMβ-巰基乙醇)中，從而得到純化的核糖體。將部分純化的核糖體進(jìn)行6％到36％(w/v)蔗糖密度梯度分析，可形成單一的峰。核糖體的純度為90％或以上。
實(shí)施例2構(gòu)建高表達(dá)氨酰-tRNA合成酶的質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化子的生產(chǎn)用從大腸桿菌A19細(xì)胞系提取的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增編碼丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列，從而得到5′端被SphI，3′端被HindIII識(shí)別的DNA片段。將得到的DNA片段插入到已被SphI和HindIII切割的質(zhì)粒pQE30(QIAGEN公司制)中。從而得到可高表達(dá)N端融合His-Tag的丙氨酰-tRNA合成酶的載體。用得到的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/pREP4。另一個(gè)高表達(dá)ARS的載體以同樣方法構(gòu)建。表1列出載體、限制性酶和His-Tag的位置。另外，用表1列出的pQE系列質(zhì)粒和pET系列質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/pREP4和大腸桿菌BL21/DE3。
備注″R.E.″表示限制性酶。
實(shí)施例3構(gòu)建其它可高表達(dá)蛋白因子和酶的質(zhì)粒以下高表達(dá)蛋白因子和酶的質(zhì)粒按實(shí)施例2中所述方式構(gòu)建MTF、T7聚合酶、IF1、IF2、IF3、EF-G、EF-Tu、EF-Ts和RF1。
此外，表達(dá)未列到表1中的蛋白因子和酶的質(zhì)粒也可以相同方式構(gòu)建。另外，使用pQE系列載體或pET系列載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/pREP 4或大腸桿菌BL21/DE3。
實(shí)施例4
蛋白因子和酶的高表達(dá)與純化為了高表達(dá)His標(biāo)記的丙氨酰-tRNA合成酶，在LB培養(yǎng)基(6升)培養(yǎng)實(shí)施例2獲得的大腸桿菌BL21/pREP4細(xì)胞轉(zhuǎn)化子至660nm吸光度為0.7。向培養(yǎng)液中加入異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖胺(IPTG)至終濃度為0.1mM，然后在37℃再培養(yǎng)4小時(shí)。將培養(yǎng)液離心，得到的細(xì)胞懸浮在懸浮緩沖液(50mM HEPES-KOH(pH 7.6)，1M NH4Cl，10mM MgCl2，0.3mg/ml白蛋白溶菌酶，0.1％TritonX-100，0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和6mM β-巰基乙醇)中。超聲懸浮液以破碎細(xì)胞。將超聲懸浮液離心(100,000g，4℃ 1小時(shí))。然后除去破碎的細(xì)胞。將獲得的上清部分加入已預(yù)裝Ni2+的10-ml Hi-Trap鰲合柱(Pharmacia公司制)中，然后用100ml含10mM咪唑(50mMHEPES-KOH(pH 7.6)，1M NH4Cl和10mM MgCl2)的HT緩沖液洗滌。用線性梯度為10到400mM咪唑的HT緩沖液將His標(biāo)記的丙氨酰-tRNA合成酶從柱上洗脫下來。用儲(chǔ)液緩沖液(50mM HEPES-KOH(pH 7.6)，100mM KCl，10mM MgCl2和30％甘油)透析含純化蛋白質(zhì)的組分。根據(jù)以牛血清白蛋白(BSA)為參照、用蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(Bio-Rad)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算純化的His標(biāo)記的丙氨酰-tRNA合成酶的濃度。將純化的His標(biāo)記的丙氨酰-tRNA合成酶等分為1ml，并用液氮快速冷凍，然后儲(chǔ)存于-80℃。以相同方法純化His標(biāo)記的丙氨酰-tRNA合成酶(AlaRS)、精氨酸t(yī)RNA合成酶(ArgRS)、天冬酰氨tRNA合成酶(AsnRS)、天冬氨酸t(yī)RNA合成酶(AspRS)、半胱氨酸t(yī)RNA合成酶(CysRS)、谷氨酰胺tRNA合成酶(GlnRS)和谷氨酸t(yī)RNA合成酶(GluRS)。圖2所示的是His標(biāo)記的因子經(jīng)12％SDS-PAGE電泳圖進(jìn)行分離(進(jìn)行考馬斯亮蘭染色)。通過光密度計(jì)計(jì)算出每種因子的純度均為90％或以上。另外，未顯示在圖2中的表1中的其它因子和酶也通過SDS-PAGE分離。用光密度計(jì)以相同方法計(jì)算每種因子的純度均為90％或以上。
實(shí)施例5翻譯實(shí)驗(yàn)(一般方法)蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑的成分(50μl)如下2mM ATP，2mMGTP，1mM CTP，1mM UTP，10mM磷酸肌酸，2.8A 260單位tRNA混合物，0.5μgFD，0.1mM各種氨基酸，9mM醋酸鎂，5mM磷酸鉀(pH 7.3)，95mM谷氨酸鉀，5mM氯化銨，0.5mM氯化鈣，1mM亞精胺，8mM腐胺，12pmol核糖體，1μg IF1，2μg IF2，0.75μg IF3，1μg EF-G，2μg EF-Tu，1μg EF-Ts，0.5μg RF1，0.5μg RF3，0.5μgRRF，30-300單位ARS MTF，0.2μg肌酸激酶(CK)，0.15μg肌激酶(MK)，0.054μg核苷二磷酸激酶(NDK)，1.78單位PPiase，和0.5μgT7 RNA聚合酶。向這種蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑中加入1pmol模板DNA，37℃反應(yīng)1小時(shí)。
在反應(yīng)后必須除去核糖體時(shí)，使用分子量為100kDa或更小的物質(zhì)才可通過的超濾膜除去核糖體。
另外，核糖體和上述列于表1中的組分項(xiàng)目通過實(shí)施例1和4所述的方法制備，并測(cè)定其純度。其它所用的組分是商品化的純化試劑。
而且當(dāng)上述組分應(yīng)用于下述實(shí)施例6和12時(shí)，表1所列的項(xiàng)目、核糖體、DsbA和DsbC通過實(shí)施例1、4和13所述的方法制備，并測(cè)定其純度。其它所用的組分是商品化的純化試劑。
實(shí)施例6人溶菌酶的合成已報(bào)道溶菌酶是一種具有四個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，而且兩個(gè)或多個(gè)這樣的二硫鍵必須互相交聯(lián)以表現(xiàn)出活性的蛋白質(zhì)(J Biol Chem2513147-3153(1976))。因此，溶菌酶一直作為檢測(cè)結(jié)構(gòu)與活性相關(guān)性的模式蛋白。此處，根據(jù)本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)方法合成了人溶菌酶，以檢測(cè)合成的蛋白量和比活性。
使用以下兩條引物從人溶菌酶cDNA克隆(人基因庫，Stratagene公司)中通過PCR擴(kuò)增大小為0.42 kbp的成熟的人溶菌酶基因正向引物序列AAGGAGATATACCAATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG；及反向引物序列GGATTAGTTATTCATTACAGTCCACAACCTTGAACAT。
然后用序列為GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA的正向引物和上述反向引物通過PCR擴(kuò)增含T7啟動(dòng)子區(qū)的長(zhǎng)約0.51kbp的模板DNA。模板DNA的序列如序列表中的SEQ IDNO4所示。
向?qū)嵤├?中所述的每個(gè)蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑(用于本發(fā)明方法)，及50μl通過向反應(yīng)試劑加入1mM DTT得到的反應(yīng)液(用于傳統(tǒng)方法)中，加入1pmol制備好的模板DNA，進(jìn)行蛋白質(zhì)合成反應(yīng)。
合成的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離，并用SYPRO Orange(Amersham pharmacia公司制)進(jìn)行染色。將分子量為17000的人溶菌酶帶與已知濃度的BSA帶相比較，以得到合成的人溶菌酶的濃度。用Micrococcus luteus ATCC 4698細(xì)胞系冷凍干燥粉(SIGMA)，在每分鐘可降低0.001的450nM吸光度的酶量為1個(gè)單位的條件下測(cè)定人溶菌酶活性(Imoto T.，Johnson L. N.，North A.T.C.，Phillips D.C.，Rupley J.A.，The Enzymes，3rd ed.，7，665-868(1972))。圖3和4所示的分別是合成蛋白質(zhì)的電泳圖和比活性。從圖3和4可明顯看出，在傳統(tǒng)方法下，合成的蛋白質(zhì)可通過電泳確定，但沒有檢測(cè)到酶活性。而在本發(fā)明的方法中，可檢測(cè)到比活性約為300單位/毫克。因此表明根據(jù)本發(fā)明的方法，具有二硫鍵的蛋白進(jìn)行了正確折疊。而且檢測(cè)了其它具有二硫鍵的蛋白，也可得到大致相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。
實(shí)施例7鼠白介素6(mIL 6)的合成用鼠cDNA文庫以與實(shí)施例6相同方式制備mIL6。另外，用大腸桿菌基因組DNA以與實(shí)施例6相同方式制備大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DHFR)的模板DNA。然后制備以下5種反應(yīng)溶液向?qū)嵤├?(傳統(tǒng)方法)的蛋白合成反應(yīng)試劑中加入1mM DTT得到的反應(yīng)溶液；實(shí)施例5的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑；和向?qū)嵤├?的試劑中分別加入終濃度為2、4和8mM GSSG而得到的反應(yīng)溶液。每種反應(yīng)溶液中均加入1pmol模板DNA，以進(jìn)行各反應(yīng)溶液中的蛋白質(zhì)合成。在DHFR合成時(shí)，蛋白質(zhì)合成后將反應(yīng)溶液通過超濾膜。然后將DHFR的反應(yīng)溶液和mIL6的反應(yīng)溶液分別進(jìn)行SDS-PAGE，并用SYPRO Red對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光染色。用熒光圖像儀分析染色圖譜，根據(jù)mIL6和DHFR的染色濃度計(jì)算反應(yīng)溶液中蛋白質(zhì)的量。圖5和6所示的分別是獲得的mIL6蛋白和DHFR蛋白的量。從圖5和6可明顯看出，當(dāng)合成沒有分子間二硫鍵的DHFRs時(shí)，傳統(tǒng)方法可得到最大量的蛋白質(zhì)，而本發(fā)明的方法得到的蛋白質(zhì)的量少一些。另外表明，當(dāng)合成有分子間二硫鍵的mIL6時(shí)，本發(fā)明的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)量超過傳統(tǒng)方法產(chǎn)生的量。另外進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)，只是使用了不同的具有二硫鍵的蛋白質(zhì)的模板DNA來代替mIL6模板DNA。因此得到了大致相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。
實(shí)施例8蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的影響制備4種反應(yīng)溶液，每種均包含實(shí)施例5中的蛋白質(zhì)合成基本反應(yīng)試劑，并加入2mM GSSG。然后向反應(yīng)溶液中加入來源于牛的PDI(Takara Bio Inc.)至終濃度分別為0、0.0325、0.13和0.52μM。然后，向50μl反應(yīng)溶液中加入人溶菌酶模板DNA(1pmol)，進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。以與實(shí)施例6所用相同方式測(cè)定溶菌酶的比活性。圖7所示的是加到反應(yīng)體系中的PDI濃度與合成的人溶菌酶比活性間的關(guān)系。從圖7可明顯看出，當(dāng)PDI濃度為0.0325μM或更多時(shí)，可提高具有二硫鍵的蛋白質(zhì)的比活性。另外，可通過本發(fā)明的方法測(cè)定PDI活性。另外，當(dāng)用其它類型的PDIs和二硫鍵交換蛋白來代替牛PDI時(shí)，可得到大致相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。
實(shí)施例9二硫蘇糖醇(DTT)濃度的影響制備6種反應(yīng)溶液，每種均包含實(shí)施例5中的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑，并加入0.13μM PDI。然后向反應(yīng)溶液中加入DTT至終濃度分別為1000、500、250、125、62.5和0μM。然后，向50μl反應(yīng)溶液中加入1pmol人溶菌酶模板DNA，進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。以與實(shí)施例6所用相同方式測(cè)定溶菌酶的比活性。如圖8所示的結(jié)果。從圖8可明顯看出，當(dāng)DTT濃度為125μM或更少時(shí)，可得到較強(qiáng)的溶菌酶活性。
實(shí)施例10堿性磷酸酶的合成堿性磷酸酶是具有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的蛋白質(zhì)，因此它可作為模式蛋白來檢測(cè)二硫鍵形成與酶活性的關(guān)系。在這里合成了堿性磷酸酶。
使用針對(duì)大腸桿菌基因組DNA和大腸桿菌堿性磷酸酶的PCR引物，以與實(shí)施例6相同的方式來合成大腸桿菌堿性磷酸酶的模板DNA。制備5種反應(yīng)溶液，每種都包含實(shí)施例5的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑，并加入1mM DTT和0.13μM PDI。之后，分別向反應(yīng)溶液中加入濃度為0、1、2、3和4 mM的GSSG。
然后，向50μl反應(yīng)溶液中加入1pmol堿性磷酸酶的模板DNA，進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。以與實(shí)施例5相同的方法測(cè)定合成的蛋白質(zhì)的濃度。通過以對(duì)硝基苯基磷酸二鈉鹽為底物(Biochim Biophys Acta.258178-87(1972))測(cè)定405nm處吸光度來測(cè)定所合成的堿性磷酸酶的活性。圖9所示的是堿性磷酸酶的相對(duì)活性。從圖9可明顯看出，通過傳統(tǒng)方法，也就是用蛋白反應(yīng)試劑加入1mM DTT和0.13μMPDI，沒有檢測(cè)到堿性磷酸酶的活性。另一方面，通過本發(fā)明的方法，也就是用蛋白反應(yīng)試劑加入1mM或2mM GSSG，可獲得堿性磷酸酶的活性。甚至在體系中存在1mM DTT時(shí)也可檢測(cè)到堿性磷酸酶的活性。因此，可證明合成的蛋白質(zhì)發(fā)生了正確的折疊。另外，制備不同的反應(yīng)溶液，分別包含實(shí)施例5中的反應(yīng)溶液和濃度為1000、500、250、125和0μM DTT。如上所述，向每種反應(yīng)溶液中加入模板DNA，然后堿性蛋白合成。然后測(cè)定堿性磷酸酶的活性。結(jié)果如圖10所示。沒有PDI，只是改變DTT的濃度。因此，結(jié)果表明可在DTT的濃度為500μM或更小時(shí)獲得堿性磷酸酶的活性。
實(shí)施例11DsbC的影響通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌的DsbC，并以與實(shí)施例2相同的方法構(gòu)建高表達(dá)dsbC的載體，只是所獲得的DNA片段其序列可被5′的BamHI和3′的HindIII識(shí)別。用獲得的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/pREP4。然后，以與實(shí)施例4相同的方法獲得純化的DsbC。蛋白質(zhì)純度在90％或以上。通過向?qū)嵤├?的蛋白質(zhì)合成試劑中加入1mM DTT和2mMGSSG而制備3種反應(yīng)溶液(每種50μl)。向這些反應(yīng)溶液中分別添加濃度0、0和0.5μM的DsbC，及0、1和1pmol的實(shí)施例6中的人溶菌酶基因的模板DNA。通過與實(shí)施例6所用相同的方法測(cè)定合成的蛋白質(zhì)量和溶菌酶的活性。圖11所示的是特異的酶活性。從圖11可以明顯看出，加入DsbC可使溶菌酶的比活性顯著增加。另外，當(dāng)使用其它的二硫鍵交換蛋白代替DsbC時(shí)，以及當(dāng)不同類型的二硫鍵交換蛋白同時(shí)使用時(shí)，可得到大致相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。
實(shí)施例12本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成試劑與傳統(tǒng)的細(xì)胞提取物的比較根據(jù)商品說明書通過大腸桿菌細(xì)胞提取物的體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(Roche Rapid Translation System 100)合成大腸桿菌的堿性磷酸酶，不過添加了終濃度為0、1、2和3mM的GSSG。另外，通過本發(fā)明的方法以與實(shí)施例10所用的相同方式合成大腸桿菌堿性磷酸酶。圖12所示的是合成的堿性磷酸酶的比活性。從圖12可明顯看出，用大腸桿菌細(xì)胞提取物體系即使加入各種濃度的GSSG也沒有檢測(cè)到堿性磷酸酶的活性，而另一方面，通過本發(fā)明的合成方法可得到很高的堿性磷酸酶的活性。
實(shí)施例13EF-Tu、DsbA和DsbC純度的確定在冰上超聲破碎表達(dá)含帶有His-Tag的EF-Tu的蛋白的細(xì)胞，以將其懸浮在上樣緩沖液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH 8.0)中。然后，將得到的細(xì)胞裂解物離心(30,000g，4℃，30分鐘)。之后，向上述獲得的上清中加入已在冰冷上樣緩沖液中平衡的50％Ni2+-NTA漿(Qiagen)，并在4℃攪拌1小時(shí)。然后將樹脂加到柱上，并在4℃用20倍柱體積的上樣緩沖液(含10mM咪唑，pH 8.0)進(jìn)行洗滌。用20倍柱體積咪唑濃度梯度為10到250mM的上樣緩沖液將目標(biāo)蛋白從柱上洗脫下來。然后收集組分(每個(gè)1ml)。通過SDS-PAGE確定目標(biāo)蛋白。用光密度計(jì)讀取每個(gè)泳道的電泳圖譜，從而可計(jì)算純度。圖13所示的是EF-Tu洗脫組分的電泳圖。每個(gè)泳道的電泳圖譜通過光密度計(jì)讀取，然后收集純度為90％或以上的Ef-Tu組分。
另外，圖1 4所示的是純化的DsbA(泳道1)和DsbC(泳道2)的電泳圖。這兩個(gè)酶的純度均為90％或以上。
工業(yè)實(shí)用性[蛋白質(zhì)合成方法]根據(jù)本發(fā)明，可加入幾微摩爾到1mM在傳統(tǒng)反應(yīng)溶液中要優(yōu)先除去的DTT。而且也可以不加入DTT。
另外，通常認(rèn)為使用除去DTT的無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)的傳統(tǒng)方法所合成蛋白的量在這種體系可能會(huì)降低，即使二硫鍵可在蛋白質(zhì)中形成，有活性的目標(biāo)蛋白的合成效率也將被破壞。但根據(jù)本發(fā)明，通過重構(gòu)蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可使合成蛋白質(zhì)的量保持穩(wěn)定，或在某些情況下有所提高。因此，蛋白質(zhì)可被高效合成。
根據(jù)本發(fā)明活性測(cè)定方法，在蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中合成的底物為沒有二硫鍵的單鏈多肽，從而不需要還原和變性步驟。因此，在合成時(shí)或合成后，加入測(cè)定活性的酶，可以折疊蛋白質(zhì)的活性或結(jié)構(gòu)作為指示物。因此，本發(fā)明的方法的特征在于所需的步驟和時(shí)間與傳統(tǒng)方法相比較大大簡(jiǎn)化和縮短。
本申請(qǐng)所引用的所有出版物，專利和專利申請(qǐng)均全部并入本申請(qǐng)作為參考。
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<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2ggattagtta ttcattacac tccacaacct tgaacat 37<210>3<211>85<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata tacca 85<210>4<211>495<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata taccaatgaa ggtctttgaa aggtgtgagt tggccagaac 120
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權(quán)利要求
1.一種合成具有分子內(nèi)或分子間二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法，包括使用包含以下a)，b)，和c)和/或d)的反應(yīng)系統(tǒng)a)至少一個(gè)編碼目標(biāo)蛋白的模板核酸；b)包含多種具有特定存在量和純度的組分的、在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑；c)至少一種具有特定存在量和純度的、可催化二硫鍵氧化還原的氧化還原酶；及d)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)二硫鍵氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
2.權(quán)利要求
1所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中蛋白質(zhì)合成基本反應(yīng)試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
3.權(quán)利要求
1所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
4.權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中氧化還原酶是催化促進(jìn)和/或異構(gòu)化蛋白質(zhì)的二硫鍵的酶。
5.權(quán)利要求
1-4中任一項(xiàng)所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中氧化還原酶包括蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶類(PDIs)或二硫鍵交換蛋白。
6.權(quán)利要求
5所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的濃度為0到10μM。
7.權(quán)利要求
5或6所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中二硫鍵交換蛋白的濃度為0到10μM。
8.權(quán)利要求
1-7中任一項(xiàng)所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中氧化還原試劑為二硫蘇糖醇或氧化型谷胱甘肽。
9.權(quán)利要求
8所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中氧化型谷胱甘肽的濃度為0到8mM。
10.權(quán)利要求
8或9所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中二硫蘇糖醇的濃度為0到1mM。
11.權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中硫氧還蛋白還原酶在反應(yīng)體系中的濃度不超過100ng/ml。
12.權(quán)利要求
1-11中任一項(xiàng)所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中谷胱甘肽還原酶在反應(yīng)體系中的濃度不超過100ng/ml。
13.一種檢測(cè)方法包括在包含以下a)，b)和c)和/或d)的反應(yīng)體系中改變氧化還原酶試劑和氧化還原試劑的濃度；合成包含至少一個(gè)肽鏈的蛋白質(zhì)，其中所述肽鏈分子內(nèi)或分子間通過至少一個(gè)二硫鍵進(jìn)行交聯(lián)，其活性可根據(jù)這種交聯(lián)方式進(jìn)行調(diào)節(jié)；測(cè)定蛋白質(zhì)的活性；及測(cè)定蛋白質(zhì)活性、氧化還原酶試劑濃度和氧化還原試劑濃度之間的關(guān)系a)至少一個(gè)編碼目標(biāo)蛋白的模板核酸；b)包含具有特定存在量和純度的多種組分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑；c)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及d)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
14.權(quán)利要求
13所述的檢測(cè)方法，其中蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
15.權(quán)利要求
13所述的檢測(cè)方法，其中蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
16.權(quán)利要求
13-15中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中氧化還原酶是催化促進(jìn)和/或異構(gòu)化蛋白質(zhì)的二硫鍵的酶。
17.權(quán)利要求
13-16中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中氧化還原酶包括蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶類(PDIs)或二硫鍵交換蛋白。
18.權(quán)利要求
13-17中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中氧化還原酶是濃度為0μM到10μM的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶類。
19.權(quán)利要求
13-18中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中氧化還原酶是濃度為0μM到10μM的二硫鍵交換蛋白。
20.權(quán)利要求
13-19中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中氧化還原試劑為二硫蘇糖醇或氧化型谷胱甘肽。
21.權(quán)利要求
20所述的檢測(cè)方法，其中氧化型谷胱甘肽的濃度為0到8mM。
22.權(quán)利要求
13-21中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中硫氧還蛋白還原酶在反應(yīng)體系中的濃度不超過100ng/ml。
23.權(quán)利要求
13-21中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其中谷胱甘肽還原酶在反應(yīng)體系中的濃度不超過100ng/ml。
24.一種測(cè)定催化促進(jìn)和/或異構(gòu)化蛋白質(zhì)二硫鍵的酶的活性的方法，包括以下a)，b)和c)a)至少一個(gè)模板核酸；b)包含多種具有特定的化合物名稱、存在量和純度的組分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成基本反應(yīng)試劑；c)包含至少一種具有特定的化合物名稱、存在量和純度的組分、可調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)試劑的氧化還原試劑。
25.權(quán)利要求
24中測(cè)定活性的方法，其中蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
26.權(quán)利要求
24中測(cè)定活性的方法，其中蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
27.一種方法，該方法包括在包含下述a)和b)的基本蛋白質(zhì)合成反應(yīng)系統(tǒng)中添加不同濃度的c)和d)，合成包含至少一種蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)通過至少一個(gè)二硫鍵形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，而且可根據(jù)這種交聯(lián)形式調(diào)節(jié)其活性；測(cè)定蛋白質(zhì)的活性；測(cè)定蛋白質(zhì)活性、催化氧化還原反應(yīng)的酶濃度和調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑濃度之間的關(guān)系，由此確定可使目標(biāo)蛋白活性超過預(yù)期活性水平的c)和/或d)的濃度，其中所述的a)～d)如下a)編碼至少一個(gè)目標(biāo)蛋白的至少一個(gè)模板核酸；b)包含多種具有特定存在量和純度的組分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成基本反應(yīng)試劑；c)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；d)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
28.權(quán)利要求
27所述的方法，其中蛋白質(zhì)合成基本反應(yīng)試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
29.一種合成具有分子內(nèi)或分子間二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟在包含a)編碼至少一個(gè)目標(biāo)蛋白的至少一個(gè)模板核酸；b)包含多種具有特定存在量和純度的組分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成基本反應(yīng)試劑；c)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；和/或d)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)系統(tǒng)中，在改變c)催化氧化還原的酶的濃度和/或d)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑濃度的合成條件下，合成包含至少一種多肽的蛋白質(zhì)，其中所述多肽可通過至少一個(gè)二硫鍵形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，而且可根據(jù)這種交聯(lián)形式調(diào)節(jié)其活性；測(cè)定蛋白質(zhì)的活性；測(cè)定蛋白質(zhì)活性、催化氧化還原反應(yīng)的酶濃度和調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的試劑濃度之間的關(guān)系，由此確定可使目標(biāo)蛋白活性超過預(yù)期活性水平的c)和/或d)的濃度；(2)用包含以上a)、b)和c)和/或d)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)系統(tǒng)合成目標(biāo)蛋白，其中c)和/或d)的濃度已按上述確定的進(jìn)行了調(diào)節(jié)。
30.權(quán)利要求
29所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中蛋白合成反應(yīng)基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
31.權(quán)利要求
29所述的合成蛋白質(zhì)的方法，其中蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
32.一種包含以下a)、b)和/或c)的試劑盒a)包含具有特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、核苷三磷酸、氨基酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的、可在加入模板核酸后合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑；b)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
33.一種包含以下a)、b)和/或c)的試劑盒a)包含具有特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、核苷三磷酸、氨基酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的、可在加入模板核酸后合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑；b)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
34.一種包含以下a)、b)和/或c)的試劑盒a)包括特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、RNA聚合酶、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、核苷三磷酸、氨基酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的、可在加入模板核酸后合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑；b)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
35.一種包含以下a)、b)和/或c)的試劑盒a)包括特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、RNA聚合酶、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶、tRNAs、核苷三磷酸、氨基酸、10-甲?；?，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑，其量和純度已進(jìn)行指定，可在加入模板核酸后合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)；b)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定存在量和純度的調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的氧化還原試劑。
36.權(quán)利要求
32-35中任一項(xiàng)所述的試劑盒，包含編碼對(duì)照蛋白質(zhì)的模板核酸。
37.一種通過含以下a)和b)的反應(yīng)體系合成具有分子內(nèi)或分子間二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法a)至少一個(gè)編碼目標(biāo)蛋白的模板核酸；b)包含多種具有特定存在量和純度的組分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)基本試劑。
專利摘要
本發(fā)明的目的是提供一種用重構(gòu)的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)簡(jiǎn)便高效地合成含二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法。已知具有活性的蛋白質(zhì)可通過使用含有純化組分的重構(gòu)蛋白合成系統(tǒng)合成獲得，其中可影響氧化還原狀態(tài)的酶和底物被除去，并可對(duì)二硫化物和硫醇的氧化還原的平衡進(jìn)行人工調(diào)節(jié)。這種系統(tǒng)可代替含有多種維持還原狀態(tài)酶和底物，例如硫氧還蛋白還原酶[EC 1.6.4.5]和谷胱甘肽還原酶[EC 1.6.4.2]等的細(xì)胞提取物或粗組分的、難以調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1997739SQ200580022328
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年4月28日
發(fā)明者桑田英文 申請(qǐng)人:株式會(huì)社后基因組研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan