專利名稱:重組日本七鰓鰻口腔腺分泌具抗炎功效l－251蛋白的制作方法
技術領域：
重組日本七鰓鰻口腔腺分泌PR-1蛋白L-251中性粒細胞抑制活性鑒定屬于生物技術領域：
，涉及日本七鰓鰻口腔腺分泌L-251蛋白cDNA的序列及克隆，與cDNA對應的氨基酸序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達，以及L-251蛋白作為CD11a和CD11b β2整合素的結合蛋白可以阻斷中性粒細胞特異表達的CD11b/CD18和CD11a/CD18整合素(CR3受體)，從而抑制中性粒細胞跨內皮細胞遷移，到達炎癥位點。提示七鰓鰻這種寄生性生物以此逃避宿主的炎癥反應，這是除了病毒，蠕蟲等物種之外，發(fā)現(xiàn)的具有逃逸宿主免疫監(jiān)測機制的新物種，也是潛在的治療和預防由炎癥反應造成的免疫病理損傷新藥。
背景技術：
中性粒細胞在外周血粒細胞中數(shù)量最多，約占外周血白細胞的60％-70％，在先天免疫中具有重要的作用，是機體抗細菌和真菌的主要免疫細胞。中性粒細胞在促炎細胞因子、趨化性物質、和趨化細胞因子的作用下可發(fā)生活化，穿過血管內皮單層，進入局部組織，發(fā)揮殺菌、細胞毒和致炎癥作用。
中性粒細胞穿越血管內皮實際上是中性粒細胞和內皮細胞表面一系列黏附分子及其配體之間相互作用的過程中性粒細胞的滾動和最初的黏附主要是選擇素家族P選擇素、E選擇素和L選擇素及其配體在起作用。選擇素家族分子與細胞表面的碳水化合物配體相互作用的特點是結合的親和力很低，從而保證細胞滾動得以進行。當炎癥發(fā)生時，趨化性細胞因子和趨化性物質可吸引中性粒細胞向感染或損傷部位募集，這時血管內皮細胞黏附分子(ICAM-1)的表達上調，同時中性粒細胞表面整合素β2LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)的表達增高，LFA-1與ICAM-1、Mac-1與iC3b以及Mac-1與ICAM-1之間的相互作用使中性粒細胞與活化內皮細胞發(fā)生高親和力結合。接下來，在趨化因子梯度作用下，中性粒細胞穿過內皮細胞單層和結締組織進入炎癥部位，在炎癥組織中，中性粒細胞與細胞外基質結合，定居在組織中發(fā)揮生物學作用。由此可以看出中性粒細胞表面β2整合素LFA-1和Mac-1在致炎癥過程中發(fā)揮重要作用。
炎癥反應一方面可以清除外來抗原或病原微生物，但另一方面可造成組織、細胞的損傷。中性粒細胞與多種疾病狀態(tài)下的病理損傷有關，如局部缺血再灌注損傷、呼吸窘迫綜合征、類風濕關節(jié)炎、肺氣腫等。例如局部缺血再灌注損傷通常伴隨著中性粒細胞的活化及向局部組織的浸潤。在急性細菌感染患者和成人呼吸窘迫綜合征患者體內均發(fā)現(xiàn)了呼吸爆發(fā)能力增強的中性粒細胞亞群，提示這些中性粒細胞亞群的大量浸潤造成了肺部組織的損傷。因此，阻斷白細胞與血管內皮細胞的黏附和白細胞的滲出有可能成為預防和治療炎癥性疾病的一種新的手段，并能改善在疾病狀態(tài)下，由中性粒細胞造成的病理損傷。
本項研究涉及重組日本七鰓鰻(Lampetra japonica)口腔腺分泌的致病相關蛋白(PR-1)家族成員—L-251中性粒細胞抑制活性，表明L-251蛋白具有潛在的抗炎藥用價值。
日本七鰓鰻，屬圓口綱，七鰓鰻科。七鰓鰻為典型的洄游性、肉食性動物。既營獨立生活，又營寄生生活，經常用吸盤附在其它魚體上，用吸盤內和舌上的角質齒銼破魚體，吸食其血與肉，有時被吸食之魚最后只剩骨架。營獨立生活時，則以浮游動物為食。仔鰻期以腐植碎片和絲狀藻類為食。生殖時期的成魚停止攝食。
1994年美國科學家首次從狗鉤蟲(Ancylostoma caninum)分離并克隆了中性粒細胞抑制因子(Neutrophilinhibitory factor NIF)。NIF以nmol濃度就可以抑制中性粒細胞與內皮細胞的黏附以及黏附依賴的H2O2的產生。在一個豬肺模型體內實驗中，可以看到NIF灌注可以防止中性粒細胞介導的肺血管損傷。此外，NIF在轉基因鼠中釋放，可以防止脂多糖誘導的中性粒細胞向肺內浸潤而導致的肺血管損傷。在對局部大腦缺血鼠模型研究中顯示，NIF可以阻斷中性粒細胞滲入缺血的腦組織。1999年，SIU K.LO等人的研究結果顯示，NIF是通過拮抗CD11a/CD18和CD11b/CD18 β2整合素而阻斷中性粒細胞與內皮細胞的黏附。
通過對七鰓鰻口腔腺發(fā)現(xiàn)的L-251蛋白進行大量的同源序列比對和結構分析，發(fā)現(xiàn)L-251蛋白與NIF同屬PR-1蛋白亞家族成員，有著相似的α-β-α三明治立體結構，在C末端是一個半胱氨酸豐富區(qū)。它們共同擁有PR-1蛋白家族高度保守的GHF(Y)TQI(V/M)VW序列，和共同的兩個組氨酸、兩個谷氨酸殘基，Glu109，His69，His129，Glu96，這是所有PR-1蛋白如蛇毒ablomin、人腸道寄生蟲分泌蛋白Na-ASP-2、狗鉤蟲分泌蛋白NIF、煙草NtPR-a、番茄致病相關蛋白P14a共同的特征性保守殘基，這些保守殘基形成網絡，成簇環(huán)繞成一個電負性腔隙，這個腔隙對L-251蛋白結合CD11b/CD18β2整合素起著關鍵作用。
我們從七鰓鰻口腔腺分泌物釣取L-251蛋白cDNA，在大腸桿菌中進行克隆和表達，通過組氨酸親和層析得到L-251蛋白純品，進行了L-251蛋白抑制人外周血中性粒細胞趨化活性檢測，結果顯示，L-251蛋白可以抑制人外周血由fMLP活化的中性粒細胞跨3.0μM微孔纖維素濾膜遷移，說明L-251蛋白具有中性粒細胞抑制活性，這是首次在七鰓鰻這一物種中發(fā)現(xiàn)具有中性粒細胞抑制活性的L-251蛋白，也是繼NIF后，發(fā)現(xiàn)的第二個外在的具有潛在抗炎藥用價值的中性粒細胞抑制劑。

發(fā)明內容本項發(fā)明在日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)L-251蛋白的開放閱讀框，經對其mRNA全長的進行釣取、測序及cDNA克隆，其重組蛋白在大腸桿菌中進行高效表達。L-251重組蛋白生物學活性涉及作為CD11a和CD11b β2整合素的結合蛋白，它可以拮抗中性粒細胞特異表達的CD11b和CD11a β2整合素(CR3受體)與ICAM-1結合，從而阻斷中性粒細胞與內皮細胞的黏附和跨血管內皮細胞遷移、浸潤到達炎癥位點，具有抗炎功效。
本發(fā)明涉及日本七鰓鰻口腔腺分泌L-251蛋白的cDNA序列及克隆、與之對應的蛋白質序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達，及其抑制中性粒細胞與內皮細胞的黏附和跨血管內皮細胞遷移、浸潤到達炎癥位點的生物學活性。
本發(fā)明從日本七鰓鰻口腔腺中分離提取mRNA，利用前期構建的cDNA文庫、EST文庫中獲得的生物學信息及mRNA全長釣取的測序結果選取開放閱讀框設計引物，采用RT-PCR方法獲得了L-251蛋白的cDNA及其序列，本發(fā)明還提供了L-251在大腸桿菌BL21中成功表達的蛋白及其序列，L-251蛋白具有抑制中性粒細胞遷移的生物學活性，可作為抗炎藥物進行開發(fā)。
L-251蛋白cDNA序列推導的蛋白質氨基酸序列如下L-251蛋白cDNA序列738bp，其蛋白質由246個氨基酸組成，蛋白分子量為27,948kDa。
其cDNA序列推導的蛋白質氨基酸序列如下atg gcg agc gtc gtg gcg gcg aca tcc gtc naa cga ctg gaa gct cct gga cac gaa gct 60Met Ala Ser Val Val Ala Ala Thr Ser Val Xaa Arg Leu Glu Ala Pro Gly His Glu Alagtc ggc gaa ccg gaa ggt cat ncg tgg acg ttc aca acg agc tgc ggc gcg gcg tgg tgc 120Val Gly Glu Pro Glu Gly His Xaa Trp Thr Phe Thr Thr Ser Cys Gly Ala Ala Trp Cyscca ccg cca gca nac atg ctc aag atg gcg tac aac gaa cag gca gca gag acc agc cgc 180Pro Pro Pro Ala Xaa Met Leu Lys Met Ala Tyr Asn Glu Gln Ala Ala Glu Thr Ser Argttg ntg ggc cgc cgc ctg cag ctt ctc gca cag ccc cag caa cac gcg cac ctg nga aga 240Leu Xaa Gly Arg Arg Leu Gln Leu Leu Ala Gln Pro Gln Gln His Ala His Leu Xaa Argcgc cgc aag cag agt ggg act gcg gag aga acc tct tca tgt cca ngc aac cca cgg tcg 300Arg Arg Lys Gln Ser Gly Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Cys Pro Xaa Asn Pro Arg Sertgg gac gag gca gtg cgc agc tgg tac gac gag gtc nac ctc ccc cgg ctt cca gta cgg 360Trp Asp Glu Ala Vla Arg Ser Trp Tyr Asp Glu Val Xaa Leu Pro Arg Leu Pro Val Argcac ggg ggc tgt ggg gcc cgg ggc cgt ngg gac act aca ctc agg tgg tgt ggt aca aag 420His Gly Gly Cys Gly Ala Arg Gly Arg Xaa Asp Thr Thr Leu Arg Trp Cys Gly Thr Lystcc cac cag gtg ggc tgc gcc gtc asc tac tgc ccc aac cac ccc ggc gcc ctc aag ttc 480Ser His Gln Val Gly Cys Ala Val Asn Tyr Cys Pro Asn His Pro Gly Ala Leu Lys Phectc tac gtg tgc cac tac tgc ccc gca ggg aac ctg gtc acc agg atc aac aaa ccc tac 540Leu Tyr Val Cys His Tyr Cys Pro Ala Gly Asn Leu Val Thr Thr Ile Asn Lys Pro Tyr
gac ctg ggg act ccg tgc cag gcc tgc ccc cat agc tgc gac aac aac ctg tgc acc aac 600Asp Leu Gly Thr Pro Cys Gln Ala Cys Pro His Ser Cys Asp Asn Asn Leu Cys Thr Asnccg tgc ccc tac gtg gac cag ttc agc aac tgc ccg cag ctg ttc agc gcc cac ggc tgc 660Pro Cys Pro Tyr Val Asp Gln Phe Set Asn Cys Pro Gln Leu Phe Ser Ala His Gly Cysgcg aac gac ggc gcg ggg gga acc ttc gtg cag aca aac tgc cct gcc acg tgc agc tgc 720Ala Asn Asp Gly Ala Gly Gly Thr Phe Val Gln Thr Asn Cys Pro Ala Thr Cys Ser Cysacg acg gat gtg cag tgaThr Thr Asp Val Gln 738L-251蛋白中性粒細胞抑制生物學活性如下本發(fā)明采用Boyden chamber檢測技術，用德國ORPEGEN Pharma公司出品的中性粒細胞趨化性定量檢測試劑盒(Migratest chemotaxis)定量檢測中性粒細胞趨化性。本實驗取健康人外周肝素化全血，用試劑盒中的培養(yǎng)基分離出白細胞，放入3.0μM微孔纖維素濾膜包被的細胞培養(yǎng)插件中，用帶有抗LECAM抗體的熒光染料染色，在24孔板底部加入趨化性三肽fMLP(N-formyl-Met-Leu-Phe)，使中性細胞沿fMLP濃度梯度遷移，通過流式細胞儀分析488nm氬離子激光激發(fā)的熒光信號，確定中性粒細胞趨化性，實驗結果顯示，L-251蛋白在70nmol/L濃度可抑制50％中性粒細胞遷移，在119nmol/L濃度可抑制75％中性粒細胞遷移，表明L-251蛋白是中性粒細胞抑制劑，具有潛在的抗炎藥用價值。
圖1、本發(fā)明實驗流程圖圖2、pET23b質粒圖譜圖3、重組pET23b-L251雙酶切鑒定圖4L-251蛋白SDS-PAGE圖5、流式細胞儀中性粒細胞趨化性檢測結果圖6、流式細胞儀檢測原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計表圖7、L-251中性粒細胞抑制圖表具體實施方式
1.總RNA的提取采用GIBCO BRL的Trizol試劑。具體如下(1)取日本七鰓鰻口腔腺迅速置于液氮中研磨；(2)稱取0.2g腺體組織和分泌物，加1ml TRIZOL試劑制備勻漿，4℃孵育5min；(3)加0.2ml氯仿，蓋緊蓋后用力振搖15second，然后置于冰上5min；(4)4℃，12000g，離心15min；
(5)將上層水相移入另一離心管，加0.5ml異丙醇，并在冰上孵育10min；(6)4℃，12000g，離心15min；(7)棄上清，在沉淀(含RNA)中加1ml 75％乙醇洗滌，旋渦混勻；(8)4℃，10000g離心5min，得到RNA沉淀；(9)空氣干燥后，用適量TE或無RNase水溶解備用。
2.以自行設計的引物進行RT-PCR擴增，以獲得日本七鰓鰻口腔腺L-251蛋白的cDNA；按以下條件進行反轉錄反應42℃20min，99℃5min，5℃5min引物序列如下P15’-XXcatatggcgagcgtcgtggcggcgaca-3’P25’-XXaagcttctgcacatccgtcgtgcagct-3’3.將獲取的目的cDNA與pET23b載體相連接，轉化入克隆菌DH5a后進行陽性轉化子的篩選鑒定；為產生帶有組氨酸標簽的融合蛋白，選擇pET-23b(+)做為基因克隆的載體，克隆具體操作如下(1)目的基因的回收與測序目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit進行；對回收DNA進行測序，此項工作由大連寶生物工程有限公司完成。
(2)質粒的提取采用寶生物的質粒提取試劑盒進行。
(3)目的基因DNA片段與載體pET23b的連接由于所設計的引物分別帶有Nde I和Hind III酶切位點，而這兩個酶切位點也是pET23b的多克隆位點，這使得將目的基因DNA片段與載體pET23b的連接成為可能。
(4)將連接產物CaCl2法轉化至克隆菌E.coli BL21中。
(5)陽性轉化子的篩選鑒定利用T7通用引物法和雙酶切法進行陽性轉化子的篩選鑒定。
4.對陽性重組子進行終濃度為1mmol/L的IPTG誘導表達。誘導表達條件為37℃，5h。
5.對表達的重組蛋白進行變性條件下的組氨酸親和層析純化。
(1)10000g離心10min收獲菌體，棄上清，并使殘液盡量流出。以每100ml的原培養(yǎng)液加40ml冰冷的1×Binding buffer的比例重懸細胞。
(2)將上述樣品置于冰上超聲裂解細胞。
(3)5000g離心15min棄上清，每100ml的原培養(yǎng)液加20ml含1KU/ml溶菌酶的1×Bindingbuffer重懸細胞。
(4)再次破碎，以釋放更多的目的蛋白。
(5)重復上述操作直至菌體充分裂解。
(6)將破碎完全的菌體沉淀按每100原液加入5ml含6mol尿素的1×Bindingbuffer重懸細胞。
(7)冰上1h，使蛋白充分融解。
(8)16000g離心30min，取上清以0.45μm的濾膜過濾。
(9)吸去His.Bind Column上室的貯液，并打開下面管口；(10)用10ml的1×Binding Buffer對柱子進行平衡；(11)將過濾好的上清液上樣；用10ml的1×Binding Buffer洗柱；(12)用10ml的1×Wash Buffer洗柱；(13)用5ml的1×Elute Buffer洗脫目的蛋白；(14)透析緩慢除去變性劑。
6.分離白細胞用無菌技術收集5ml健康人外周肝素化全血，不要用EDTA或枸櫞酸抗凝。
(1)小心將1ml肝素化全血鋪在白細胞分離培養(yǎng)基上；(2)室溫下放置40mim，不要搖動，40mim后自動分層，上層是白細胞豐富血漿，含有白細胞和血小板，下層是紅細胞。如果用陳舊的血，紅細胞沉淀反應需要的時間長；(3)吸出500ul上層白細胞豐富血漿，在1h內用于中性粒細胞趨化活性檢測。
7.中性粒細胞趨化活性檢測(1)將incubation buffer或fMLP加入24孔板的孔中，陰性對照加350ul inbubation buffer，陽性對照加350ul fMLP工作液；(2)將細胞培養(yǎng)插件(預先用3.0μM微孔纖維素濾膜包被)插入每一個孔中，并在兩個對照和三個實驗插件上分別加入100ul白細胞豐富血漿，再在三個實驗孔分別加入20ul，30ul，40ul L-251蛋白；(3)將板放入37℃，水浴30mim，不要搖晃；(4)將細胞培養(yǎng)插件取出，吸出底部細胞懸液，放于冰上，同時在未刺激的培養(yǎng)插件中取出20ul細胞懸液于350ul incubation buffer中，作為LECAM-1對照；(5)在每一個孔中加入20ul熒光染料/計數(shù)試劑，旋渦混勻，冰浴10mim，閉光；(6)每孔加20ul 1×DNA染料，冰浴5mim，閉光。
在120mim內進行流式細胞儀檢測。
8.流式細胞儀檢測通過藍-綠激發(fā)光(488nm氬離子激光)在流式細胞儀進行細胞分析。數(shù)據(jù)的獲取是通過在FL3c通道觸發(fā)熒光。首先以白細胞和記數(shù)珠設A門，再以記數(shù)珠設B門，最后以中性粒細胞設C門。
9.流式細胞儀檢測結果分析
權利要求
重組日本七鰓鰻(Lampetra japonica)口腔腺分泌具抗炎功效L-251蛋白1.一條來源于日本七鰓鰻口腔腺分泌物致病相關蛋白PR-1亞家族新成員的cDNA序列及其蛋白質的氨基酸序列，特將此蛋白命名為L-251，其cDNA序列及由其推導的蛋白質氨基酸序列如下L-251蛋白cDNA序列738bp，其蛋白質由246個氨基酸組成，蛋白分子量為27.948kDa。其cDNA序列推導的蛋白質氨基酸序列如下M A S V V A A T S V X R L E A P G H E AV G E P E G H X W T F T T S C G A A W CP P P A X M L K M A Y N E Q A A E T S RL X G R R L Q L L A Q P Q Q H A H L X RR R K Q S G T A E R T S S C P X N P R SW D E A V R S W Y D E V X L P R L P V RH G G C G A R G R X D T T L R W C G T KS H Q V G C A V N Y C P N H P G A L K FL Y V C H Y C P A G N L V T R I N K P YD L G T P C Q A C P H S C D N N L C T NP C P Y V D Q F S N C P Q L F S A H G CA N D G A G G T F V Q T N C P A T C S CT T D V Q *
2.編碼根據(jù)權利要求
1所述的日本七鰓鰻口腔腺L-251蛋白的基因。
3.根據(jù)權利要求
2所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如下1 atggcgagcgtcgtggcggcgacatccgtcnaacgactggaagct46 cctggacacgaagctgtcggcgaaccggaaggtcatncgtggacg91 ttcacaacgagctgcggcgcggcgtggtgcccaccgccagcanac136 atgctcaagatggcgtacaacgaacaggcagcagagaccagccgc181 ttgntgggccgccgcctgcagcttctcgcacagccccagcaacac226 gcgcacctgngaagacgccgcaagcagagtgggactgcggagaga271 acctcttcatgtccangcaacccacggtcgtgggacgaggcagtg316 cgcagctggtacgacgaggtcnacctcccccggcttccagtacgg361 cacgggggctgtggggcccggggccgtngggacactacactcagg406 tggtgtggtacaaagtcccaccaggtgggctgcgccgtcaactac451 tgccccaaccaccccggcgccctcaagttcctctacgtgtgccac496 tactgccccgcagggaacctggtcaccaggatcaacaaaccctac541 gacctggggactccgtgccaggcctgcccccatagctgcgacaac586 aacctgtgcaccaacccgtgcccctacgtggaccagttcagcaac631 tgcccgcagctgttcagcgcccacggctgcgcgaacgacggcgcg676 gggggaaccttcgtgcagacaaactgccctgccacgtgcagctgc721 acgacggatgtgcagtga 738
4.一種重組質粒，其特征在于它含有權利要求
2或3的基因。
5.根據(jù)權利要求
4所述的重組質粒，其特征在于所述基因連接于pET23b載體上。
6.一種基因工程菌，其特征在于它被根據(jù)權利要求
4或5所述的重組質粒轉化。
7.根據(jù)權利要求
6所述的基因工程菌，其特征在于其宿主細胞為E.coli BL21。
8.根據(jù)權利要求
L所述的日本七鰓鰻口腔腺L-251蛋白在治療和預防由炎癥反應造成的免疫病理損傷藥物上的應用。
9.根據(jù)權利要求
8所述的應用，其中所述用于抑制免疫病理損傷的藥物為抗炎的藥物。
專利摘要
重組日本七鰓鰻口腔腺分泌PR－1蛋白L－251中性粒細胞抑制活性鑒定屬于生物技術領域：
，涉及日本七鰓鰻口腔腺分泌L－251蛋白cDNA的序列及克隆，與cDNA對應的氨基酸序列及其在工程菌中的表達，以及L－251蛋白作為CD11a和CD11b β2整合素的結合蛋白可以阻斷中性粒細胞特異表達的CD11b/CD18和CD11a/CD18整合素(CR3受體)，從而抑制中性粒細胞跨內皮細胞遷移、浸潤到達炎癥位點。提示七鰓鰻這種寄生性生物以此逃避宿主的炎癥反應，這是除了病毒，蠕蟲等物種之外，發(fā)現(xiàn)的具有逃逸宿主免疫監(jiān)測機制的新物種，L－251蛋白具有潛在的治療和預防由炎癥反應造成的免疫病理損傷的藥用價值。
文檔編號C07K14/435GK1995345SQ200610047596
公開日2007年7月11日 申請日期2006年8月31日
發(fā)明者李慶偉, 吳毓, 白潔, 王繼紅 申請人:遼寧師范大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan