專利名稱:一種5－氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，具體的說涉及一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法。
背景技術：
D-D4FC(β-D-2’，3’-雙脫氫雙脫氧-5氟胞嘧啶核苷)是一種新型抗HIV病毒的核苷類藥物。以1次/天或2次/天的劑量服用，可有效地抑制HIV原生菌，抗AZT(齊多呋啶，3’-脫氧-3’-疊氮胸苷)菌株和抗3TC(拉米呋啶，3’-硫代胞苷)菌株及抗其它NRTIs(核苷逆轉錄酶抑制劑)，NNRTIs(非核苷逆轉錄酶抑制劑)，PIs(蛋白酶抑制劑)類藥物的HIV變異菌株(AntimicrobAgents Chemother，2002，46(5)1394-1401.)。目前為止，在服用D-D4FC的病體內尚未發(fā)現(xiàn)新的HIV變異菌株。重要的是，D-D4FC與除DDI(2’，3’-雙去氧肌苷)的其它病毒抑制劑聯(lián)合用藥無相互抑制作用，且?guī)缀鯚o細胞毒性，是一種極具潛力的抗HIV藥物。目前，D-D4FC正在美國，法國和德國進行II期臨床，其III期臨床也正計劃啟動(CohenC，Katlama C，et al.3th IAS Conference，2005，Rio de Janeiro，Brazil.)。
到目前為止，D-D4FC多為有化學合成法的報道(J Org Chem，1992，57(14)3887；J MedChem，1999，42(5)859；Bioorg Med Chem Lett，1998，8(22)3245；J Med Chem，1999，42(5)859；Carbohydrate Res.1997，300(4)375；Tetrahedron Lett，2005，468099-8102.)，這些合成路線的收率都比較低，摩爾總收率都在10％左右；化學合成的條件比較苛刻，需在低溫下操作，工業(yè)化難度比較大；在化學合成的過程中需要用不可回收的重金屬催化劑，不僅對工人的身體有毒害，而且對環(huán)境也很不友好，不符合現(xiàn)在倡導的綠色友好化學的主題。
2006年，酶法合成D-D4FC的方法被報道，產率達到25％(Biocatal and Biotransform，2006，24(4)253-256.)。該方法可一步合成D-D4FC，產品光學純度高，副產物少，反應無污染。然而，此方法受到酶的催化平衡的影響，產率只能達到25％。

發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶合成方法，以解決現(xiàn)有化學方法及酶法合成中總體產率低于25％，耗時長，且不利于工業(yè)化大規(guī)模連續(xù)生產的不足。
本發(fā)明的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法，包括如下步驟
將反應式中結構式1的胸腺嘧啶核苷在整細胞存在的緩沖液中與5-氟胞嘧啶進行堿基交換反應，37℃-50℃反應10-40小時，得到結構式2的含氟核苷類似物即5-氟胞嘧啶核苷。
其中反應式為 所述的緩沖液為KH2PO4緩沖液、NaH2PO4緩沖液、Tris緩沖液中的一種或幾種的混合。反應過程中加入25 mmol/L D-D4T和50 mmol/L 5-FC，并加入含有N-脫氧核糖轉移酶的整細胞3g；所述的含有N-脫氧核糖轉移酶的整細胞是乳酸桿菌整細胞。
優(yōu)選的合成方法為1mL 50mmol//L pH＝6～10的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)及0.1～3g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在37～50℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應10～20h。反應結束，將反應體系凍存于-20℃終止。
本發(fā)明公開的方法使D-D4T到D-D4FC的轉化率達到49.4％，相比于化學合成法約10％和酶法約25％的產率，該法使D-D4FC的產率得到了很大提高；該法在20小時內即可達到49.4％轉化率，相比其它方法，時間大大縮短；并且該法中應用整細胞催化，回收方便，可連續(xù)應用，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產。
具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求
書所限定的范圍。
實施例11mL 50mmol//L pH＝8的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC 6.4mg(50mmol/L)，及1.2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應12.5h。反應結束，將反應體系凍存于-20℃終止。樣品解凍后以10000r/min，15min離心去除整細胞，所得清液過濾后，用于HPLC檢測。
實施例21mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 5.6 mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)，及2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應12.5h。反應結束，將反應體系凍存于-20℃終止。樣品解凍后以10000r/min，15min離心去除整細胞，所得清液過濾后，用于HPLC檢測。
實施例31mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)，及1.2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應100h。反應結束，將反應體系凍存于-20℃終止。樣品解凍后以10000r/min，15min離心去除整細胞，所得清液過濾后，用于HPLC檢測。
實施例41mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 11.2mg(50mmol/L)，5-FC12.8mg(100mmol/L)，及1.2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應12.5h。反應結束，將反應體系凍存于-20℃終止。樣品解凍后以10000r/min，15min離心去除整細胞，所得清液過濾后，用于HPLC檢測。
反應過程中定性分析采用TLC法二氯甲烷-甲醇-水(8∶2∶0.25，v/v)為展開劑，紫外顯色；反應混合物凍干后以甲醇萃取并減壓蒸干，所得固體混合物過硅膠層析柱(20％CH3OH/CH2Cl2，v/v)純化；反應混合物離心去除整細胞并過濾處理后，可用于HPLC定量檢測。
權利要求
1.一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法，包括步驟(1)1mL 50mmol緩沖液，加人25mmol/L胸腺嘧啶核苷，50-100mmol/L5-氟胞嘧啶，pH6～10進行堿基交換反應；(2)加人0.1～3g含有N-脫氧核糖轉移酶的整細胞，37℃-50℃，反應10-40小時，結束后將反應體系凍存于-20℃終止。
2.根據權利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法，其特征在于所述的緩沖液是KH2PO4緩沖液、NaH2PO4緩沖液或Tris緩沖液中的一種或幾種的混合。
3.根據權利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法，其特征在于所述的含有N-脫氧核糖轉移酶的整細胞是乳酸桿菌整細胞。
4.根據權利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法，其特征在于所述的1.2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口，在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應12.5h。
5.根據權利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法，其特征在于所述的50mmol/L5-氟胞嘧啶及2g乳酸桿菌。
6.根據權利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法，其特征在于所述的100mmol/L5-氟胞嘧啶及1.2g乳酸桿菌。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種5－氟胞嘧啶核苷的整細胞酶促合成方法，包括胸腺嘧啶核苷在整細胞(含有N－脫氧核糖轉移酶)存在的緩沖液中與5－氟胞嘧啶進行堿基交換反應，37℃－50℃反應10－20小時，得含氟核苷類似物即5－氟胞嘧啶核苷。該方法中5－氟胞嘧啶核苷產率在20小時內可達到49.4％，相比于其它合成方法，產率提高，時間縮短，并且該法應用整細胞催化，回收方便，可連續(xù)應用，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產。
文檔編號C12P19/00GK1995370SQ200610118924
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月30日
發(fā)明者朱利民, 戚娜 申請人:東華大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan