專利名稱:使用屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌產(chǎn)生芳香族l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，并具體涉及使用屬于嗜甲基菌屬(Methylophilus)的細(xì)菌產(chǎn)生芳香族L-氨基酸、特別是L-苯丙氨酸的方法，其中所述細(xì)菌已被修飾以增強(qiáng)編碼涉及芳香族L-氨基酸流出(efflux)的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。
背景技術(shù)：
使用屬于短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、青霉屬(Penicillium)、假絲酵母屬(Candida)等等的微生物通過(guò)發(fā)酵，來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)L-氨基酸，例如L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸。為了改善生產(chǎn)率，已使用了從天然分離的菌株或其人工突變體。已經(jīng)公開(kāi)了各種技術(shù)以通過(guò)使用重組DNA技術(shù)通過(guò)增強(qiáng)L-谷氨酸生物合成酶的活性來(lái)增加L-谷氨酸生產(chǎn)能力。
通過(guò)培育例如以上提到的那些微生物和改進(jìn)生產(chǎn)方法，已經(jīng)顯著地增加了L-氨基酸的產(chǎn)生。然而，為了滿足未來(lái)增加的需求，開(kāi)發(fā)以更低成本生產(chǎn)L-氨基酸的更為有效的方法仍是所期望的。
為了通過(guò)甲醇的發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸(甲醇是可以以低成本大量獲得的原料)，通常已知的方法包括使用屬于無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)或假單胞菌屬(Pseudomonas)(日本專利公告(Kokoku)No.45-25273/1970)、精朊桿菌屬(Protaminobacter)(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)49-125590/1974)、精朊桿菌屬(Protaminobacter)或甲烷單胞菌屬(Methanomonas)(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)50-25790/1975)、微環(huán)菌屬(Microcyclus)(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)52-18886/1977)、嗜甲基菌屬(Methylobacillus)(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)4-91793/1992)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)號(hào)3-505284/1991)等等的微生物。
已經(jīng)公開(kāi)了通過(guò)培養(yǎng)屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，所述細(xì)菌具有產(chǎn)生L-苯丙氨酸的能力并對(duì)苯丙氨酸類似物，例如DL-對(duì)-氟苯丙氨酸、間-氟苯丙氨酸和苯丙烯酸(cinnamic acid)有抗性(EP1134283B1)。
并且，已經(jīng)公開(kāi)了通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力的微生物，從而L-氨基酸積累在培養(yǎng)基中，并從培養(yǎng)基收集L-氨基酸，來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸，包括L-苯丙氨酸的方法，其中所述微生物是具有Entner-Doudoroff途徑的甲醇利用細(xì)菌，在所述途徑中6-磷酸葡糖酸脫水酶活性和/或2-酮基-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶活性增強(qiáng)(美國(guó)專利申請(qǐng)20040142435A1)。
還公開(kāi)了通過(guò)在含有甲醇作為主要碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)已被修飾從而使ybjE基因的表達(dá)增強(qiáng)的微生物，來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸，包括L-苯丙氨酸的方法(PCT申請(qǐng)WO05073390A2)。
已經(jīng)公開(kāi)了通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸或L-色氨酸的方法，所述細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)率已經(jīng)通過(guò)提高僅由yddG基因編碼的蛋白質(zhì)的活性來(lái)提高(PCT申請(qǐng)WO03044192A1)。
但是目前，還沒(méi)有為了使用屬于嗜甲基菌屬的甲醇利用細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸，而增強(qiáng)yddG、yddL、yddK和yddJ基因表達(dá)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的包括增強(qiáng)芳香族L-氨基酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力以及提供使用這些菌株生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的方法。
通過(guò)發(fā)現(xiàn)在屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌中、特別是食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)中增強(qiáng)來(lái)自大腸桿菌(E.coli)的yddG、yddL、yddK和yddJ基因的表達(dá)，可以提高芳香族L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸，優(yōu)選L-苯丙氨酸的生產(chǎn)而實(shí)現(xiàn)了上述目的。
本發(fā)明提供了具有提高的生產(chǎn)芳香族L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸，優(yōu)選L-苯丙氨酸的能力的屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明的目的是提供屬于嗜甲基菌屬的具有生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的能力的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)被修飾以增強(qiáng)編碼涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述基因是從屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌獲得的。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述基因包括yddG、yddL、yddK和yddJ。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述表達(dá)通過(guò)修飾控制所述基因表達(dá)的表達(dá)控制序列來(lái)增強(qiáng)。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述表達(dá)通過(guò)增加所述基因的拷貝數(shù)來(lái)增強(qiáng)。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述芳香族L-氨基酸選自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是食甲基嗜甲基菌。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的方法，其包括-在含有甲醇作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的細(xì)菌來(lái)產(chǎn)生和分泌所述芳香族L-氨基酸到培養(yǎng)基中，和-從培養(yǎng)基中收集所述L-氨基酸。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述芳香族L-氨基酸選自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
以下詳細(xì)描述本發(fā)明。
附圖1顯示了PCR擴(kuò)增的DNA片段的結(jié)構(gòu)，所述片段帶有RBSfmd和編碼用于全套苯丙氨酸流出泵(efflux pump)的來(lái)自大腸桿菌的yddG、yddL、yddK、yddJ基因。
附圖2顯示了帶有yddG基因的缺失衍生物的結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選的實(shí)施方式1.本發(fā)明的細(xì)菌本發(fā)明的細(xì)菌是屬于嗜甲基菌屬、具有生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的能力的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)被修飾以增強(qiáng)涉及芳香族L-氨基酸流出的基因的表達(dá)。
在本發(fā)明中，“具有生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的能力的細(xì)菌”是指一種細(xì)菌，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)菌時(shí)它具有產(chǎn)生和分泌L-氨基酸到培養(yǎng)基中的能力。在此使用的術(shù)語(yǔ)“具有生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的能力的細(xì)菌”還指一種細(xì)菌，其相比于食甲基嗜甲基菌(M.methylotrophus)的野生型或親本菌株，例如食甲基嗜甲基菌AS1，能夠以更大的量產(chǎn)生L-氨基酸并引起L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累，優(yōu)選的是指該微生物能夠以不低于0.05g/L、更優(yōu)選不低于0.1g/L目標(biāo)L-氨基酸的量在培養(yǎng)基中引起積累。術(shù)語(yǔ)“芳香族L-氨基酸”包括L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。L-苯丙氨酸是特別優(yōu)選的。
嗜甲基菌屬包括以下細(xì)菌Methylophilus freyburgensis、Methylophilusleisingeri、食甲基嗜甲基菌、Methylophilus quaylei等。具體地，可以使用和包括根據(jù)NCBI(國(guó)立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)中使用的分類學(xué)被分類為嗜甲基菌的那些。屬于食甲基嗜甲基菌菌種的細(xì)菌是優(yōu)選的。可用于本發(fā)明的嗜甲基菌屬細(xì)菌的具體實(shí)例包括食甲基嗜甲基菌菌株AS1(NCIMB10515)等等。食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)可以從國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏所(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，United Kingdom)獲得。
編碼涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白質(zhì)的基因包括編碼能將芳香族L-氨基酸從細(xì)菌細(xì)胞中泵出(pump out)的蛋白質(zhì)的基因。所述蛋白質(zhì)的活性提高賦予了細(xì)菌對(duì)芳香族L-氨基酸的抗性，并且當(dāng)這種細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)引起芳香族L-氨基酸在培養(yǎng)基中的積累增加。
用語(yǔ)“屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌”是指根據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類法被分類為埃希氏菌屬的細(xì)菌。如本發(fā)明中使用的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于，大腸桿菌(大腸桿菌)。
可用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌沒(méi)有特別的限制；然而，例如Neidhardt，F(xiàn).C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)描述的細(xì)菌被本發(fā)明包括。
用語(yǔ)“細(xì)菌已被修飾以增強(qiáng)基因的表達(dá)”是指細(xì)菌已經(jīng)通過(guò)這樣的方式被修飾，從而與未修飾的細(xì)菌相比，修飾的細(xì)菌含有的由所述基因編碼的蛋白質(zhì)的量增加。
用語(yǔ)“增強(qiáng)的基因表達(dá)”是指基因的表達(dá)水平比未修飾的菌株，例如野生型菌株更高。這種修飾的實(shí)例包括提高每個(gè)細(xì)胞表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)基因的拷貝數(shù)，和/或通過(guò)修飾基因的相鄰區(qū)域，包括控制基因表達(dá)的序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、衰減子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)，等等，提高一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)水平。
用語(yǔ)“編碼涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白質(zhì)的基因”是指，當(dāng)培養(yǎng)已被修飾以增強(qiáng)基因表達(dá)的微生物時(shí)，由所述微生物分泌到培養(yǎng)基中的L-氨基酸的量多于從未修飾的菌株，例如親本菌株或相應(yīng)的野生型菌株分泌的L-氨基酸的量。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)基中L-氨基酸濃度的增加來(lái)觀察L-氨基酸流出能力的增加。此外，也通過(guò)測(cè)定將該基因?qū)胛⑸镏泻驦-氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度的下降來(lái)觀察L-氨基酸流出能力的提高。與由未修飾的菌株輸出的L-氨基酸的量相比較，從本發(fā)明的微生物分泌的L-氨基酸的量?jī)?yōu)選地增加10％或更多，更優(yōu)選30％或更多，特別優(yōu)選50％或更多。此外，也根據(jù)將基因?qū)胛⑸镏泻驦-氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度的下降來(lái)觀察L-氨基酸流出能力的提高。例如，可以如下測(cè)量L-氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度向含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加具有1.07的比重的適量硅油，通過(guò)離心從培養(yǎng)基中收集細(xì)胞，優(yōu)選在12,000rpm離心2分鐘。然后用22％高氯酸處理細(xì)胞(Ishizaki，A.等，Biotech.Techniq.，9，6，409(1995))。使用這樣制備的細(xì)胞，可以測(cè)量L-氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度。此外，可以通過(guò)使用外翻的膜小泡(everted membranevesicle)測(cè)量放射性標(biāo)記的L-氨基酸的細(xì)胞攝取來(lái)間接地檢測(cè)“L-氨基酸流出能力”(Pittman，M.S.等，J.Biol.Chem.，277，51，49841-49849(2002))。例如，從其中導(dǎo)入了基因的細(xì)胞制備外翻的膜小泡。然后，向所述小泡添加提供驅(qū)動(dòng)能量的ATP或其他底物，并測(cè)量放射性標(biāo)記的L-氨基酸的細(xì)胞攝取?？蛇x擇地，通過(guò)測(cè)量活性細(xì)胞中非標(biāo)記氨基酸和標(biāo)記氨基酸之間的交換反應(yīng)速率來(lái)檢測(cè)“L-氨基酸輸出能力”。
來(lái)自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌、涉及芳香族L-氨基酸流出的基因的實(shí)例包括來(lái)自大腸桿菌的yddG、yddL、yddK和yddJ基因。
yddG基因編碼推定的跨膜YddG蛋白(同義詞-B1473)。yddG基因(與核苷酸位置1544312到1545193互補(bǔ)的核苷酸；GenBank登記號(hào)NC_000913.2；gi49175990；SEQ ID NO1)位于大腸桿菌K-12的染色體上yddL和fdnG基因之間。yddG基因的核苷酸序列和由yddG基因編碼的YddG蛋白的氨基酸序列分別在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中示出。
yddL基因(同義詞-B1472)編碼推定的外膜孔蛋白(outer membrane porin)YddL蛋白。yddL基因(與核苷酸位置1543762到1544052互補(bǔ)的核苷酸；GenBank登記號(hào)NC_000913.2；gi49175990；SEQ ID NO3)位于大腸桿菌K-12的染色體上yddG和yddK基因之間。yddL基因的核苷酸序列和由yddL基因編碼的YddL蛋白的氨基酸序列分別在SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中示出。
yddK基因(同義詞-B1471)編碼推定的糖蛋白YddK。yddK基因(與核苷酸位置1542782到1543738互補(bǔ)的核苷酸；GenBank登記號(hào)NC_000913.2；gi49175990；SEQ ID NO5)位于大腸桿菌K-12的染色體上yddJ和yddL基因之間。yddK基因的核苷酸序列和由yddK基因編碼的YddK蛋白的氨基酸序列分別在SEQ ID NO5和SEQ ID NO6中示出。
yddJ基因(同義詞-B1470)編碼YddJ蛋白，其功能是未知的。yddJ基因(與核苷酸位置1542408到1542743互補(bǔ)的核苷酸；GenBank登記號(hào)NC_000913.2；gi49175990；SEQ ID NO7)位于大腸桿菌K-12的染色體上narU和yddK基因之間。yddJ基因的核苷酸序列和由yddJ基因編碼的YddJ蛋白的氨基酸序列分別在SEQ ID NO7和SEQ ID NO8中示出。
由于在埃希氏菌屬菌株之間的DNA序列中可能有某些差異，將過(guò)量表達(dá)的上述基因不限于SEQ ID NO1、3、5和7中所示的核苷酸序列，還可包括與SEQ ID NO1、3、5和7中所示的那些類似的核苷酸序列。因此，由上述基因編碼的蛋白變體可能與SEQ ID NO2、4、6和8所示的完整氨基酸序列有不低于80％、優(yōu)選不低于90％、最優(yōu)選不低于95％的相似性，只要維持了蛋白引起芳香族L-氨基酸流出的能力。
此外，以上描述的基因可以由變體代表，所述變體在嚴(yán)格條件下可以與SEQ ID NO1、3、5和7所示的核苷酸序列、或與基于這些核苷酸序列制備的探針雜交，條件是它們編碼功能性蛋白。“嚴(yán)格條件”包括這樣的條件，在這些條件下形成特異性雜合體，而不形成非特異性雜合體。例如，通過(guò)用含有1×SSC和0.1％SDS，優(yōu)選的0.1×SSC和0.1％SDS的溶液在60℃洗滌一次，優(yōu)選兩次或三次作為嚴(yán)格條件的例子。取決于雜交條件，可以適當(dāng)?shù)剡x擇探針的長(zhǎng)度，并通常從100bp到1kbp變化。
基因表達(dá)的增強(qiáng)可以通過(guò)提高基因的拷貝數(shù)，和/或通過(guò)導(dǎo)入攜帶基因的載體來(lái)實(shí)現(xiàn)。嗜甲基菌細(xì)菌的載體，例如，是在嗜甲基菌細(xì)菌的細(xì)胞中可自主復(fù)制的質(zhì)粒。嗜甲基菌細(xì)菌的載體的具體實(shí)例包括RSF1010和其衍生物，例如pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))、pMFY42(Gene，44，53(1990))、pRP301和pTB70(Nature，287，396，(1980))。
通過(guò)例如同源重組、Mu整合等的方法，通過(guò)將基因的多個(gè)拷貝導(dǎo)入細(xì)菌染色體中，可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)。例如，通過(guò)限制性切割(restrict)染色體DNA隨后使用基于基因序列的探針進(jìn)行Southern印跡，通過(guò)熒光原位雜交(FISH)，等等，可以估計(jì)表達(dá)的基因的拷貝數(shù)。
基因表達(dá)的增強(qiáng)也可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述強(qiáng)啟動(dòng)子適合于在屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌中起作用。例如，lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、λ噬菌體的PR或PL啟動(dòng)子被稱為強(qiáng)啟動(dòng)子。強(qiáng)啟動(dòng)子的使用可以與基因拷貝的擴(kuò)增相結(jié)合。
可選擇地，例如，通過(guò)將突變導(dǎo)入啟動(dòng)子中以提高位于該啟動(dòng)子下游的基因的轉(zhuǎn)錄水平，可以增強(qiáng)啟動(dòng)子的效果。此外，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中的幾個(gè)核苷酸的取代，特別是緊靠起始密碼子上游的序列，可以深刻地影響mRNA可翻譯性。例如，取決于起始密碼子前三個(gè)核苷酸的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了表達(dá)水平方面20倍的變動(dòng)(Gold等.，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等.，EMBO J.，3，623-629，1984)。早先，顯示了rhtA23突變是在相對(duì)于ATG起始密碼子的-1位置處的A對(duì)G的取代(ABSTRACTS of 17thInternational Congress of Biochemistry and MolecularBiology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society forBiochemistry and Molecular Biology，San Francisco，California August 24-29，1997，abstract No.457)。因此，可以表明，rhtA23突變?cè)鰪?qiáng)了rhtA基因表達(dá)，而作為結(jié)果，提高了對(duì)蘇氨酸、高絲氨酸和一些其他轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的物質(zhì)的抗性。
通過(guò)使用各種公知的方法，包括Northern印跡、定量RT-PCR等等，測(cè)量從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量，可以估計(jì)基因表達(dá)水平。通過(guò)公知的方法，包括SDS-PAGE繼之以免疫印跡分析(Western印跡分析)等等，可以測(cè)量由基因編碼的蛋白質(zhì)的量。
制備質(zhì)粒DNA、消化和連接DNA、轉(zhuǎn)化、選擇寡核苷酸作為引物等等的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的普通方法。例如，在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，and Maniatis，T.，″Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition″，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述了這些方法。
L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌通過(guò)增強(qiáng)編碼細(xì)菌中涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)，可以獲得本發(fā)明的細(xì)菌，所述細(xì)菌固有地具有生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的能力?？蛇x擇地，通過(guò)給細(xì)菌賦予生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的能力，所述細(xì)菌已經(jīng)具有編碼涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白質(zhì)的基因的增強(qiáng)表達(dá)，可以獲得本發(fā)明的細(xì)菌。
生產(chǎn)芳香族氨基酸的能力可以是細(xì)菌的野生型菌株原本的能力，或是通過(guò)培育被賦予的能力。
在下文中，將說(shuō)明給如上所述的親本菌株賦予芳香族氨基酸生產(chǎn)能力的方法。
為了賦予芳香族氨基酸生產(chǎn)能力，可以使用通常用來(lái)培育屬于埃希氏菌屬或棒狀桿菌細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌的方法。例如，可以使用用于獲得具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph)突變菌株、類似物抗性菌株或代謝調(diào)控突變菌株的方法，和用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的L-氨基酸生物合成酶活性的重組菌株的方法(″Amino Acid Fermentation″，the Japan ScientificSocieties Press[Gakkai Shuppan Center]，1st Edition，published on May 30，1986，pp.77-100)。當(dāng)使用這些方法培育L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌時(shí)，可以賦予一種或多種性質(zhì)，包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型、類似物抗性和代謝調(diào)節(jié)突變。
當(dāng)產(chǎn)生重組菌株時(shí)，可以增強(qiáng)單個(gè)或多個(gè)L-氨基酸生物合成酶的活性。此外，賦予營(yíng)養(yǎng)缺陷型、類似物抗性和代謝調(diào)節(jié)突變性質(zhì)的方法可以與增強(qiáng)L-氨基酸生物合成酶活性的方法組合。
具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株、L-氨基酸類似物抗性菌株或代謝調(diào)控突變的菌株，可以通過(guò)使親本或野生型菌株經(jīng)過(guò)通常的誘變處理，例如X射線或紫外線照射、用例如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)的誘變?cè)噭┨幚韥?lái)獲得。然后，可以從突變的菌株中選擇具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株、類似物抗性菌株或代謝調(diào)控突變菌株。
通過(guò)增強(qiáng)3-脫氧-D-arabinoheptulosonate-7-磷酸合酶(DAHP合成酶，EC2.5.1.54)(由aroG基因編碼)、3-脫氫奎尼酸合酶(由aroB基因編碼)、莽草酸激酶(由aroL基因編碼)、分支酸變位酶(由aroA基因編碼)、分支酸合酶(由aroC基因編碼)的活性，可以獲得具有生產(chǎn)芳香族氨基酸的能力的細(xì)菌(PCT申請(qǐng)WO02/38777)。
2.本發(fā)明的方法本發(fā)明的方法是通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌以生產(chǎn)和分泌L-氨基酸到培養(yǎng)基中，并從所述培養(yǎng)基收集L-氨基酸來(lái)生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)、收集和從培養(yǎng)基純化L-氨基酸等等可以按照與使用細(xì)菌生產(chǎn)氨基酸的常規(guī)發(fā)酵方法類似的方式進(jìn)行。
用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是合成的或天然培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基包括碳源和氮源和礦物質(zhì)，和如有必要，細(xì)菌生長(zhǎng)所需的合適量的營(yíng)養(yǎng)物。用于屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌的碳源包括Cl化合物，例如甲醇。如果甲醇被用作主要碳源，可以以低成本生產(chǎn)芳香族L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸。當(dāng)甲醇被用作主要碳源時(shí)，它以0.001％到30％的量添加到培養(yǎng)基中。對(duì)于氮源，可以使用各種銨鹽例如氨和硫酸銨，其他氮化合物例如胺，天然的氮源例如蛋白胨、大豆水解產(chǎn)物和消化的發(fā)酵微生物。作為礦物質(zhì)，可以使用單磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈣等等。作為維生素，可以使用硫胺素、酵母提取物等等。
培養(yǎng)優(yōu)選在有氧條件，例如搖動(dòng)培養(yǎng)，和帶通氣的攪動(dòng)培養(yǎng)，在20到40℃、優(yōu)選的30到38℃溫度下進(jìn)行。培養(yǎng)物的pH值通常在5和9之間，優(yōu)選在6.5和7.2之間?？梢杂冒薄⑻妓徕}、各種酸、各種堿和緩沖液來(lái)調(diào)整培養(yǎng)物的pH值。通常，1到5天的培養(yǎng)導(dǎo)致目標(biāo)L-氨基酸在液體培養(yǎng)基中的積累。
培養(yǎng)之后，可以通過(guò)離心或膜過(guò)濾從液體培養(yǎng)基除去固體例如細(xì)胞，然后可以通過(guò)離子交換、濃縮和/或結(jié)晶方法收集L-氨基酸。
實(shí)施例以下將參考下述非限制性實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1.來(lái)自大腸桿菌的L-苯丙氨酸流出泵基因在食甲基嗜甲基菌菌株中的克隆、分析和應(yīng)用。
已經(jīng)報(bào)道了，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，增強(qiáng)由來(lái)自大腸桿菌的yddG基因編碼的蛋白質(zhì)的活性增加了L-氨基酸例如L-苯丙氨酸或L-色氨酸通過(guò)大腸桿菌細(xì)菌的產(chǎn)生(PCT申請(qǐng)WO03044192A1)。
因此，推測(cè)yddG基因編碼L-苯丙氨酸流出泵。
食甲基嗜甲基菌是用于L-苯丙氨酸流出基因的分析的很好的測(cè)試微生物，因?yàn)樗诤懈週-苯丙氨酸濃度(2.0-5.0g/L)的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。而且活性的L-苯丙氨酸流出泵賦予了食甲基嗜甲基菌細(xì)菌對(duì)苯丙氨酸的抗性。
首先，通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)自大腸桿菌的單個(gè)yddG基因。使用兩個(gè)合成引物P1(SEQ ID NO9)和P2(SEQ ID NO10)，用食甲基嗜甲基菌甲酰胺酶(fmd)基因的新的核糖體結(jié)合位點(diǎn)AGGAGA(Mills，J.等，Eur.J.Biochem.，251，p.45-53(1998))來(lái)擴(kuò)增它。引物P1含有SmaI限制性位點(diǎn)和食甲基嗜甲基菌甲酰胺酶基因的RBS。引物P2含有KpnI限制性位點(diǎn)。使用大腸桿菌MG1655菌株的染色體DNA作為模板。
用SmaI和KpnI限制酶處理得到的擴(kuò)增的DNA片段，并且連接到預(yù)先已用相同的限制酶處理的pTACTER2載體中Ptac啟動(dòng)子的控制下。得到的質(zhì)粒稱為pTYD6(pTACTER2-RBSfmd-yddGEco)。
通過(guò)導(dǎo)入Ptac啟動(dòng)子從pAYCTER3載體獲得pTACTER2載體。為此，用HindIII和BamHI限制酶處理商業(yè)上可獲得的Ptac啟動(dòng)子(Pharmacia，瑞典)，并連接到預(yù)先已用相同的限制酶處理的pAYCTER3載體中。
pAYCTER3載體是pAYC32的衍生物，pAYC32是一種在質(zhì)粒RSF1010的基礎(chǔ)上構(gòu)建的中等拷貝數(shù)并且非常穩(wěn)定的載體(Christoserdov A.Y.，Tsygankov Y.D，Broad-host range vectors derived from a RSF 1010 Tnl plasmid，Plasmid，1986，v.16，pp.161-167)。通過(guò)將來(lái)自pUC19質(zhì)粒的多接頭(polylinker)和強(qiáng)終止子rrnB引入pAYC32質(zhì)粒中替換它的天然終止子，來(lái)獲得pAYCTER3載體。在PCT申請(qǐng)WO03044192A1中描述了pAYCTER3載體的詳細(xì)構(gòu)建。
然后，將得到的pTYD6質(zhì)粒從大腸桿菌菌株S17-1(McPheat，W.L.，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，41，185-188(1987))移動(dòng)到食甲基嗜甲基菌菌株AS1中。食甲基嗜甲基菌AS1菌株可以從國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏所(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB98DG，英國(guó))獲得。
通過(guò)在含有2％甲醇的121培養(yǎng)基的試管中發(fā)酵來(lái)測(cè)試菌株AS1和得到的AS1/pTYD6(發(fā)酵的條件和測(cè)量L-苯丙氨酸濃度的方法參見(jiàn)以下的實(shí)施例2)。發(fā)酵數(shù)據(jù)在表1中示出?？梢钥闯?，當(dāng)僅有來(lái)自大腸桿菌的yddG基因在質(zhì)粒上擴(kuò)增時(shí)，野生型食甲基嗜甲基菌菌株AS1不產(chǎn)生苯丙氨酸。
據(jù)推測(cè)，來(lái)自大腸桿菌的單個(gè)yddG基因僅編碼內(nèi)膜蛋白，其在食甲基嗜甲基菌菌株中不足以起到跨越內(nèi)膜和外膜的輸出者(exporter)的作用。因而，為了在食甲基嗜甲基菌細(xì)菌中形成多組分的苯丙氨酸流出泵，必需找到和克隆除yddG基因以外的來(lái)自大腸桿菌的其他基因。
分析了大腸桿菌基因組中位于yddG基因周圍的基因，并發(fā)現(xiàn)幾個(gè)下游的基因編碼與其他細(xì)菌中的外膜蛋白(孔蛋白)同源的蛋白。這組大腸桿菌基因，yddG、yddL、yddK和yddJ(圖1)，通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，克隆到pTACTER2中Ptac啟動(dòng)子和甲酰胺酶(fmd)基因的RBS的控制下，并轉(zhuǎn)移到食甲基嗜甲基菌菌株AS1中。
為此，使用引物P1(SEQ ID NO9)和P3(SEQ ID NO11)通過(guò)PCR擴(kuò)增這組基因，yddG、yddL、yddK和yddJ的組。引物P3含有SmaI限制性位點(diǎn)。
用SmaI限制酶處理得到的擴(kuò)增的DNA片段，連接到預(yù)先已用相同的限制酶處理的pTACTER2載體中Ptac啟動(dòng)子和fmd基因的RBS的控制下。產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pTBG4(pAYCTER3-PtacEco-RBSfmd-yddGEco-yddLEco-yddKEco-yddJEco)。然后，將得到的pTBG4質(zhì)粒從大腸桿菌菌株S17-1(McPheat，W.L，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，41，185-188(1987))移動(dòng)到食甲基嗜甲基菌菌株AS1中。
野生型食甲基嗜甲基菌菌株AS1對(duì)高濃度的L-苯丙氨酸敏感，并在含有1g/L或更多L-苯丙氨酸的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。L-苯丙氨酸抑制單個(gè)的DAHP合酶。這個(gè)特征有助于闡明編碼在食甲基嗜甲基菌菌株中起作用的苯丙氨酸流出泵機(jī)制的整套蛋白的大腸桿菌基因?；钚缘拇竽c桿菌L-苯丙氨酸流出機(jī)制從食甲基嗜甲基菌輸出L-苯丙氨酸，降低L-苯丙氨酸的內(nèi)部濃度，并容許細(xì)菌在含有高濃度L-苯丙氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
測(cè)試了幾個(gè)菌株對(duì)L-苯丙氨酸的抗性。它們是食甲基嗜甲基菌菌株AS1/pTBG4(pAYCTER3-PtacEco-RBSfmd-yddGEco-yddLEco-yddKEco-yddJEco)(克隆No.7、No.8、No.9)；AS1/pTYD6(pAYCTER3-PtacEco-RBSfmd-yddGEco)；AS1/pAYCTER3。在標(biāo)準(zhǔn)方案下進(jìn)行苯丙氨酸敏感性/抗性實(shí)驗(yàn)。將所述菌株在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜，然后稀釋到105細(xì)胞/ml，并涂覆在含有1％甲醇、100mg/L氨芐青霉素和不同濃度的L-苯丙氨酸(g/L)的121-培養(yǎng)基瓊脂平板上。72小時(shí)后分析菌落生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)在表3中示出。
確定了只有帶有克隆的來(lái)自大腸桿菌的四個(gè)yddG-yddL-yddK-yddJ基因的食甲基嗜甲基菌AS1/pTBG4菌株可以在含有高濃度例如5g/L、2.5g/L或1.2g/L苯丙氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
與對(duì)照菌株AS1/pAYCTER3類似，攜帶單個(gè)yddG基因的食甲基嗜甲基菌AS1/pTYD6菌株在含有高濃度苯丙氨酸(1.2、2.5、5g/L)的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。
此外，食甲基嗜甲基菌AS1/pTBG4菌株的克隆No.8在無(wú)L-苯丙氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)很差(泄漏生長(zhǎng)(leaky growth))。這意味著活性的大腸桿菌苯丙氨酸流出系統(tǒng)(yddG-yddL-yddK-yddJ)實(shí)際地在食甲基嗜甲基菌菌株AS1中起作用，并且如果在沒(méi)有L-苯丙氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)就產(chǎn)生泄漏營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
通過(guò)在含有2％甲醇的121培養(yǎng)基的試管內(nèi)發(fā)酵，測(cè)試了菌株AS1和菌株AS1/pTBG4的三個(gè)克隆的L-苯丙氨酸產(chǎn)生(發(fā)酵條件和L-苯丙氨酸濃度的測(cè)量方法參見(jiàn)下文的參考實(shí)施例)。發(fā)酵的數(shù)據(jù)在表2中示出?？梢钥闯?，攜帶具有活性苯丙氨酸流出系統(tǒng)的質(zhì)粒的野生型食甲基嗜甲基菌菌株AS1將0.06-0.11g/L的L-苯丙氨酸分泌到培養(yǎng)基中。
為了支持所有四種大腸桿菌基因都是食甲基嗜甲基菌中苯丙氨酸流出系統(tǒng)發(fā)揮正常功能所必需的這一論述，使用適合的限制酶構(gòu)建了攜帶兩個(gè)和三個(gè)苯丙氨酸流出基因的兩種pTBG4缺失衍生物(圖2)，并測(cè)試了攜帶所述衍生物的菌株AS1對(duì)L-苯丙氨酸的抗性和通過(guò)所述菌株的L-苯丙氨酸生產(chǎn)。
pTBG4質(zhì)粒的HpaI-SmaI缺失衍生物，pBHPA2(pAYCTER3-Ptac-RBSfmd-yddGEco-yddLEco)僅具有兩個(gè)大腸桿菌基因，且不賦予對(duì)L-苯丙氨酸的抗性。攜帶該衍生物的菌株AS1在含有3g/L的L-苯丙氨酸的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，且不向培養(yǎng)基分泌任何L-苯丙氨酸。這意味著L-苯丙氨酸流出機(jī)制是不完整的。
pTBG4質(zhì)粒的HindIII缺失衍生物，pBHIN3(pAYCTER3-Ptac-RBSfmd-yddGEco-yddLEco-yddKEco)具有三個(gè)大腸桿菌基因。攜帶該衍生物的菌株AS1在含有3g/L L-苯丙氨酸的培養(yǎng)基中也不生長(zhǎng)，而且不向培養(yǎng)基分泌任何L-苯丙氨酸。這個(gè)結(jié)果意味著所有四種大腸桿菌基因，yddG、yddL、yddK和yddJ，都是從食甲基嗜甲基菌菌株分泌L-苯丙氨酸所必需的。
實(shí)施例2.食甲基嗜甲基菌菌株的發(fā)酵過(guò)程和L-苯丙氨酸濃度的測(cè)量。
1.試管和搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分和過(guò)程食甲基嗜甲基菌菌株的培養(yǎng)在30℃在含有2％甲醇和3％碳酸鈣的5ml121(Fe2，F(xiàn)e3)培養(yǎng)基中在試管(18mm直徑)內(nèi)，在搖動(dòng)器上以240rpm進(jìn)行48-72小時(shí)。
121(Fe2，F(xiàn)e3)培養(yǎng)基的成分(1升)K2HPO4×3H2O 1.57gKH2PO40.62g(NH4)2SO43gNaCl 0.1gMgSO4×7H2O 0.2gCaCl20.025gEDTA-Na25mgFeSO4×7H2O 3mgFeCl3×6H2O 10mgMnSO4×5H2O 0.01mgZnSO4×7H2O 0.07mgNa2MoO4×2H2O 0.01mgH3BO30.01mgCoCl2×6H2O 0.005mgCuSO4×5H2O 0.005mg甲醇 20ml(過(guò)濾器滅菌)CaCO330gpH 7.0。發(fā)酵試管中培養(yǎng)基的初始體積5ml。
種子培養(yǎng)物在5ml沒(méi)有CaCO3的相同液體培養(yǎng)基中在試管內(nèi)在搖動(dòng)器上以240rpm在30℃生長(zhǎng)24小時(shí)。接種量-10％。溫度維持在30℃。攪動(dòng)-搖動(dòng)器上240rpm。
2.L-苯丙氨酸濃度的測(cè)量。
L-苯丙氨酸濃度通過(guò)由例如McCaman，M.W.和Robins，E.描述的熒光測(cè)定法(J.Lab.Clin.Med.，59，No.5，885-890(1962))來(lái)測(cè)量。在存在銅離子的情況下苯丙氨酸與茚三酮(ninhydrin)反應(yīng)形成高度熒光復(fù)合物。通過(guò)在反應(yīng)混合物中包括L-Leu-L-Ala二肽，大大地增強(qiáng)熒光。在熒光計(jì)中測(cè)量的熒光強(qiáng)度與苯丙氨酸濃度成比例。
盡管已經(jīng)參考本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式詳細(xì)地描述了本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是可以進(jìn)行各種變化和采用同等物，而不背離本發(fā)明的范圍。所有在此引述的參考文獻(xiàn)通過(guò)引用來(lái)并入作為本申請(qǐng)的一部分。
表1.
表2
+/-是泄漏生長(zhǎng)微型菌落；+是正常生長(zhǎng)；++是良好生長(zhǎng)表3
序列表<110>味之素株式會(huì)社(Ajinomoto-Genetika Research Institute)<120>使用屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌產(chǎn)生芳香族L-氨基酸的方法<130>yddG-fmd<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>882<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(882)<223>
<400>1atg aca cga caa aaa gca acg ctc ata ggg ctg ata gcg atc gtc ctg 48Met Thr Arg Gln Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Ile Ala Ile Val Leu1 5 10 15tgg agc acg atg gta gga ttg att cgc ggt gtc agt gag ggg ctc ggc 96Trp Ser Thr Met Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu Gly Leu Gly20 25 30ccg gtc ggc ggc gca gct gct atc tat tca tta agc ggg ctg ctg tta 144Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Gly Leu Leu Leu35 40 45atc ttc acg gtt gga ttt ccg cgt att cgg caa atc ccg aaa ggc tat 192Ile Phe Thr Val Gly Phe Pro Arg Ile Arg Gln Ile Pro Lys Gly Tyr50 55 60tta ctc gcc ggg agt ctg tta ttc gtc agc tat gaa atc tgt ctg gcg 240Leu Leu Ala Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Ile Cys Leu Ala65 70 75 80ctt tcc tta ggg tat gcg gcg acc cat cat cag gcg att gaa gtg ggt 288Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Ala Thr His His Gln Ala Ile Glu Val Gly85 90 95atg gtg aac tat ctg tgg ccc agc ctg aca att ctc ttt gcc att ctg 336Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ser Leu Thr Ile Leu Phe Ala Ile Leu100 105 110ttt aat ggt cag aaa acc aac tgg ttg att gta cct gga tta tta tta 384Phe Asn Gly Gln Lys Thr Asn Trp Leu Ile Val Pro Gly Leu Leu Leu115 120 125gcc ctc gtc ggc gtc tgt tgg gtg tta ggc ggt gac aat ggg tta cat 432Ala Leu Val Gly Val Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Asn Gly Leu His130 135 140tat gat gaa atc atc aat aat atc acc acc agc cca ttg agt tat ttc 480Tyr Asp Glu Ile Ile Asn Asn Ile Thr Thr Ser Pro Leu Ser Tyr Phe145 150 155 160ctg gcg ttc att ggt gcg ttt atc tgg gca gcc tat tgc aca gta acg 528Leu Ala Phe Ile Gly Ala Phe Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr165 170 175
aat aaa tac gca cgc gga ttt aat gga att acc gtt ttt gtc ctg cta 576Asn Lys Tyr Ala Arg Gly Phe Asn Gly Ile Thr Val Phe Val Leu Leu180 185 190acg gga gca agt ctg tgg gtt tac tat ttt ctt acg cca caa cca gaa 624Thr Gly Ala Ser Leu Trp Val Tyr Tyr Phe Leu Thr Pro Gln Pro Glu195 200 205atg ata ttt agc acg ccc gtc atg att aaa ctc atc tct gcg gca ttt 672Met Ile Phe Ser Thr Pro Val Met Ile Lys Leu Ile Ser Ala Ala Phe210 215 220acc tta gga ttt gct tat gct gca tgg aat gtc ggt ata ttg cat ggc 720Thr Leu Gly Phe Ala Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly225 230 235 240aat gtc acc att atg gcg gta ggt tcg tat ttt acg cct gta ctt tcc 768Asn Val Thr Ile Met Ala Val Gly Ser Tyr Phe Thr Pro Val Leu Ser245 250 255tca gcg ctt gca gcc gtg ctg ctc agc gcc ccg ctg tcg ttc tcg ttc 816Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Leu Ser Ala Pro Leu Ser Phe Ser Phe260 265 270tgg caa ggc gcg ctg atg gtc tgc ggc ggt tcc ctg ctc tgc tgg ctg 864Trp Gln Gly Ala Leu Met Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Cys Trp Leu275 280 285gcg aca cgt cgt ggt taa 882Ala Thr Arg Arg Gly290<210>2<211>293<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Thr Arg Gln Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Ile Ala Ile Val Leu1 5 10 15Trp Ser Thr Met Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu Gly Leu Gly20 25 30Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Gly Leu Leu Leu35 40 45Ile Phe Thr Val Gly Phe Pro Arg Ile Arg Gln Ile Pro Lys Gly Tyr50 55 60Leu Leu Ala Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Ile Cys Leu Ala65 70 75 80Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Ala Thr His His Gln Ala Ile Glu Val Gly85 90 95Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ser Leu Thr Ile Leu Phe Ala Ile Leu100 105 110Phe Asn Gly Gln Lys Thr Asn Trp Leu Ile Val Pro Gly Leu Leu Leu115 120 125Ala Leu Val Gly Val Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Asn Gly Leu His130 135 140Tyr Asp Glu Ile Ile Asn Asn Ile Thr Thr Ser Pro Leu Ser Tyr Phe145 150 155 160Leu Ala Phe Ile Gly Ala Phe Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr165 170 175Asn Lys Tyr Ala Arg Gly Phe Asn Gly Ile Thr Val Phe Val Leu Leu180 185 190Thr Gly Ala Ser Leu Trp Val Tyr Tyr Phe Leu Thr Pro Gln Pro Glu195 200 205
Met Ile Phe Ser Thr Pro Val Met Ile Lys Leu Ile Ser Ala Ala Phe210 215 220Thr Leu Gly Phe Ala Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly225 230 235 240Asn Val Thr Ile Met Ala Val Gly Ser Tyr Phe Thr Pro Val Leu Ser245 250 255Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Leu Ser Ala Pro Leu Ser Phe Ser Phe260 265 270Trp Gln Gly Ala Leu Met Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Cys Trp Leu275 280 285Ala Thr Arg Arg Gly290<210>3<211>291<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(291)<223>
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權(quán)利要求
1.屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌，其具有生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的能力，其中所述細(xì)菌已經(jīng)被修飾以增強(qiáng)編碼一種或多種蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)，所述蛋白質(zhì)與芳香族L-氨基酸流出有關(guān)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述基因是從埃希氏菌屬細(xì)菌獲得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的細(xì)菌，其中所述基因包括yddG、yddL、yddK和yddJ。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述表達(dá)通過(guò)修飾控制所述基因表達(dá)的表達(dá)控制序列來(lái)增強(qiáng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述表達(dá)通過(guò)增加所述基因的拷貝數(shù)來(lái)增強(qiáng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述芳香族L-氨基酸選自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的細(xì)菌，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是食甲基嗜甲基菌。
9.生產(chǎn)芳香族L-氨基酸的方法，其包括-在含有甲醇作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求
1到8中任一項(xiàng)的細(xì)菌以產(chǎn)生和分泌所述芳香族L-氨基酸到培養(yǎng)基中，和-從培養(yǎng)基中收集所述L-氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9的方法，其中所述芳香族L-氨基酸選自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10的方法，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
專利摘要
本發(fā)明提供了使用屬于嗜甲基菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)芳香族L－氨基酸的方法，其中所述細(xì)菌被修飾以增強(qiáng)涉及芳香族L－氨基酸流出的基因，特別是來(lái)自大腸桿菌的yddG、yddL、yddK和yddJ基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12R1/185GK1990856SQ200610172126
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2006年12月27日
發(fā)明者伊里那·L·托克馬科瓦, 納塔爾亞·V·戈?duì)柺部仆? 埃琳娜·G·阿巴拉基納, 尤爾吉斯·A·V·約曼塔斯 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan