專利名稱:用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)10-羥基喜樹堿的方法
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物方法轉(zhuǎn)化的技術(shù)領(lǐng)域：
。
于1966年開始，Wall等報導從我國引種的喜樹(Camptotheca acuminata Denc)中分離得到抗癌有效成分喜樹堿Camptothecine(Ⅰ)，10-羥基喜樹堿10-Hydroxy Camptothecine(Ⅱ)和10-甲氧基喜樹堿10-Methoxy Camptothecine(Ⅲ)等。1971年Stork和Schultz等完成了喜樹堿的全合成工作，我國以1969年起，陸續(xù)從喜樹中也分離到喜樹堿和10-羥基喜樹堿等有關(guān)的化合物，1976年又完成了喜樹堿和10-羥基喜樹堿的全合成。
(Ⅰ)R＝H (Ⅱ)R＝OH (Ⅲ)R＝OCH310-羥基喜樹堿的化學結(jié)構(gòu)與喜樹堿相似，僅在10位上的氫由羥基取代，經(jīng)動物藥理和臨床試驗證明，在治療腫瘤方面比喜樹堿有較好治療效果和較低的毒付反應(yīng)。于1977年10-羥基喜樹堿作為腫瘤臨床的一只新藥，在國內(nèi)通過鑒定，並應(yīng)用于治療肝癌、胃癌、頭頸部腫瘤和白血病等。
過去10-羥基喜樹堿從喜樹中提取，得率甚低，約為生藥的十萬分之二，提取過程中需用大量有毒的氯仿和甲醇，以及接觸有毒的喜樹堿等本身物質(zhì)，致使10-羥基喜樹堿的生產(chǎn)發(fā)生困難，成本昂貴。制造10-羥基喜樹堿的全合成雖然獲得成功，由于步驟多;總收率較低，也無生產(chǎn)實際意義。
本發(fā)明的目的是為了解決10-羥基喜樹堿的生產(chǎn)問題。本發(fā)明采用生物轉(zhuǎn)化的方法，將喜樹中含量較高的喜樹堿(提取得量為萬分之七左右)，轉(zhuǎn)變?yōu)?0-羥基喜樹堿。作者曾于1978年在科學通報上簡單地報導了利用曲霉T-36菌株，可將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿。后又經(jīng)過菌種的誘變，菌體生長和轉(zhuǎn)化條件的改進?，F(xiàn)采用黃曲霉T-419菌株，使轉(zhuǎn)化率從20%提高到50%以上。特別又研究成功采用了隋性大孔樹脂分離提取10-羥基喜樹堿的新工藝，進一步降低了生產(chǎn)成本和解決了勞動保護問題，使10-羥基喜樹堿具備了實際生產(chǎn)的條件。
利用本發(fā)明生產(chǎn)10-羥基喜樹堿比原來從喜樹中提取10-羥基喜樹堿的方法有如下優(yōu)點。
1.擴大了生產(chǎn)10-羥基喜樹堿的來源，用原來從喜樹中提取的方法，只能得到十萬分之二的10-羥基喜樹堿，而另一產(chǎn)量較高的喜樹堿因臨床毒性較大，而成為無用物質(zhì)。通過本發(fā)明可將這部分喜樹堿轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床上有較好評價的10-羥基喜樹堿。
2.革除了大量氯仿和甲醇以及上硅膠柱分離的工藝，使操作人員免去接觸大量有毒氣體和喜樹堿類本身的粉末。
3.節(jié)約了大量溶劑和試劑，再利用了喜樹堿后致使10-羥基喜樹堿的生產(chǎn)量可大大增加等，使生產(chǎn)成本要比原方法低得多。
一、生物轉(zhuǎn)化的菌株鑒定我們共篩選了數(shù)百株真菌，其中T-36菌株通過對其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的理化分析證明，確具有轉(zhuǎn)化喜樹堿為10-羥基喜樹堿的能力，后又將T-36菌株的孢子經(jīng)過紫外光處理10分鐘后，所分離得到的變株T-419其形態(tài)和培養(yǎng)的基本特征與T-36菌株一致，僅在10-羥基喜樹堿的轉(zhuǎn)化率上比T-36菌株高6-10%，故以后的工藝試驗皆用黃曲霉菌株T-419，T-419菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征T-419菌株在Czapek′s固體培養(yǎng)基上菌落近園形，很快向四周蔓延，菌落表面帶黃綠色的分生孢子。菌絲無色，無可溶性色素分泌。菌絲有橫膈，為多細胞的菌絲體。分生孢子梗的頂端膨大成半球形的頂囊，在頂囊表面以輻射方式長出一層或雙層小梗，在小梗頂端形成一串分生孢子。這些都是典型的曲霉屬Aspergillus的形態(tài)特征，在電子顯微鏡下觀察其孢子表面光滑近球形。由于孢子呈黃綠色，故其種應(yīng)命名為黃曲霉菌株T-419。
二、轉(zhuǎn)化產(chǎn)品的鑒別喜樹堿通過黃曲霉菌株T-419轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液，菌絲用乙脂提取，濾液用乙酸乙脂提取，分別濃縮后合并，再甲醇迥流，上硅膠柱層析，用氯仿沖洗，除去喜樹堿成分，然后收集2-4%甲醇的氯仿的沖洗液，濃縮后得到固體粉末，再在氯仿∶甲醇(1∶1)混合溶劑中結(jié)晶數(shù)次，即能得到純的黃色柱狀結(jié)晶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。其熔點旋光、質(zhì)譜、紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)都與天然分離得到的10-羥基喜樹堿完全一致(表1)。采用隋性大孔樹脂分離獲得10-羥基喜樹堿經(jīng)質(zhì)譜、紅外、紫外、核磁光譜分析也與天然的10-羥基喜樹堿完全一致。
三、200公升罐內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化工藝實例
1.生物轉(zhuǎn)化的工藝流程孢子→30公升罐內(nèi)種子菌絲培養(yǎng)→200公升罐內(nèi)轉(zhuǎn)化菌絲培養(yǎng) (過濾)/() (洗滌)/() (菌絲懸浮于磷酸緩沖液中)/() 菌絲懸浮液 (加入喜樹堿轉(zhuǎn)化)/() 含10-羥基喜樹堿的轉(zhuǎn)化液。
2.孢子培養(yǎng)黃曲霉菌株T-419在Czapek′s斜面培養(yǎng)基上，于27℃生長7天，待表面長出一層黃綠色孢子后，貯于冰箱內(nèi)備用。Czapek′s斜面培養(yǎng)基成分葡萄糖5%;氯化銨0.1%;硫酸鎂0.05%;磷酸二氫鉀0.1%;瓊脂2%，消毒前PH調(diào)至6.0-6.5。
3.種子菌絲培養(yǎng)在30公升罐內(nèi)裝有15公升種子菌絲培養(yǎng)基，消毒冷卻后，以一個孢瓶的孢子接種于罐內(nèi)，在溫度27±1℃，通氣量1∶1V/Vm攪拌深層培養(yǎng)48小時。種子菌絲培養(yǎng)基成分為葡萄糖2.5%;黃豆并粉2.5%;淀粉1%;氯化鈉0.1%;硫酸鎂0.05%;磷酸氫二鉀0.38%;磷酸二氫鉀0.04%，消毒前自然PH。
4.轉(zhuǎn)化菌絲培養(yǎng)于200公升罐內(nèi)裝有120公升培養(yǎng)基，消毒冷卻后，以10%左右接種量的種子種入罐內(nèi)，在溫度27±1℃，通氣量在培養(yǎng)周期24小時前1∶0.3-0.5V/Vm。24小時后，1∶1V/Vm，攪拌深層培養(yǎng)44小時，轉(zhuǎn)化菌絲培養(yǎng)的培養(yǎng)基與種子菌絲培養(yǎng)的培養(yǎng)基相同。
5.生物轉(zhuǎn)化在200公升罐內(nèi)培養(yǎng)好的菌絲，經(jīng)過濾，水沖洗和空氣吹干后，取出稱量，再懸浮于包含磷酸氫二鉀0.36%，磷酸二氫鉀0.04%，PH7.2磷酸鹽緩沖液中，同時加入預先溶解的喜樹堿使?jié)舛葹?0-150微克/毫升(PH9-10)，在27±1℃通氣量1∶1V/Vm和攪拌條件下轉(zhuǎn)化40小時左右。
6.菌絲培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中各參數(shù)的變化在菌絲培養(yǎng)的開始階段，T-419菌株的菌絲生長很快，伴隨著培養(yǎng)基內(nèi)的糖和氮源消耗加快。待24小時后，菌體生長漸趨遲緩和停頓，此時糖和氮源的利用幾乎很低。在整個菌絲生長階段，PH一直很平穩(wěn)地維持在5.5左右。在轉(zhuǎn)化階段，開始的24小時內(nèi)，喜樹堿和10-羥基喜樹堿的消長很快，伴隨著PH有一定上升，由PH7.0上升到PH7.8，待轉(zhuǎn)化24小時以后，喜樹堿和10-羥基喜樹堿的消長趨緩慢，此時的PH變化也不大。
用紫外雙波長薄層掃描方法，測定三批在200公升罐內(nèi)10-羥基喜樹堿的轉(zhuǎn)化率為63，68和74%。
四、200公升規(guī)模用隋性大孔樹脂提取分離10-羥基喜樹堿的工藝實例。
由于喜樹堿等是一類較毒的物質(zhì)，老的提取和純化方法不僅要用大量有毒的氯仿和甲醇，而且上硅膠柱層析時，有大量有毒喜樹堿類粉子飛揚，這對操作人員的健康有嚴重危害。我們采用隋性大孔樹脂分離提純10-羥基喜樹堿，這不僅能解決勞動保護的問題，還能簡化操作步驟，節(jié)省大量溶劑。
隋性大孔樹脂分離提純10-羥基喜樹堿的工藝流程如下轉(zhuǎn)化濾液 (加NaCl至0.2%濃度)/(調(diào)PH至6.8-7.0) 隋性大孔樹脂吸附 (用0.5%NaCl蒸餾水溶液沖洗)/() (用PH9.5-10蒸餾水洗脫)/() 10-羥基喜樹堿洗脫液 (加NaCl至0.2%濃度)/(調(diào)PH至6.8-7.0) 第二次隋性大孔樹脂吸附 (用0.5%NaCl蒸餾水溶液沖洗)/() (用蒸餾水稍洗工業(yè)乙醇洗脫)/() 乙醇洗脫液 (濃縮至干)/() (乙酸乙酯∶甲醇(1∶0.2-1))/(迥流) (濃縮至小體積)/() (過濾)/() (少量甲醇洗)/() (石油醚)/() (干燥)/() 10-羥基喜樹堿粗品 (氯仿∶甲醇(1∶1))/(重結(jié)晶) 10-羥基喜樹堿精制品。
200公升罐內(nèi)所得到的三批轉(zhuǎn)化產(chǎn)品，進行了水份，喜樹堿和10-羥基喜樹堿的含量測定，得到結(jié)果與1977年鑒定會上所規(guī)定的天然10-羥基喜樹堿的質(zhì)量標準進行比較。
從表3中看出，通過隋性大孔樹脂分離純化工藝所得到的轉(zhuǎn)化的10-羥基喜樹堿產(chǎn)品質(zhì)量能達到規(guī)定的標準。
實施例黃曲霉菌株T-419在Czapek′s斜面培養(yǎng)基上，于27℃培養(yǎng)7天后，以一個孢瓶的孢子接種到滅過菌的15公升種子菌絲培養(yǎng)基內(nèi)，在溫度27±1℃通氣量1∶1V/Vm攪拌深層培養(yǎng)48小時。種子菌絲培養(yǎng)基成份葡萄糖2.5%;黃豆并粉2.5%;淀粉1%;氯化鈉0.1%;硫酸鎂0.05%;磷酸氫二鉀0.38%;磷酸二氫鉀0.04%，消前自然PH。
培養(yǎng)好的種子菌絲再接種到滅過菌的含有與種子菌絲培養(yǎng)基同樣成分的120公升培養(yǎng)基內(nèi)，在溫度27±1℃通氣量在培養(yǎng)周期24小時前1∶0.3-0.5V/Vm，24小時后1∶1V/Vm，攪拌深層培養(yǎng)44小時。然后培養(yǎng)液經(jīng)過濾，菌絲用水沖洗，空氣吹干取出菌絲17公斤，再懸浮于100公升磷酸鹽緩沖液中(磷酸氫二鉀0.36%;磷酸二氫鉀0.04%，PH7.2)，同時加入預先溶解的喜樹堿濃溶液10克/100公升(PH9.5)，在27±1℃，通氣量1∶1V/Vm，和攪拌條件下轉(zhuǎn)化40小時。用雙波長紫外薄層掃描法測得轉(zhuǎn)化液中每毫升含65微克的10-羥基喜樹堿。
轉(zhuǎn)化液再經(jīng)過濾，菌絲用少量PH9.5的蒸餾水淋洗，合并后共得濾液130公升，內(nèi)含10-羥基喜樹堿總量5.2克，濾液內(nèi)加入氯化鈉260克，用6NHCl調(diào)PH至6.8-7.0，通過內(nèi)含5公斤的隋性大孔樹脂吸附柱吸附后，用15公升0.5%氯化鈉溶液淋洗，然后用PH9.5蒸餾水洗脫，得洗脫液30公升，內(nèi)含10-羥基喜樹堿4.9克。洗脫液中加入氯化鈉60克，並用6NHCl調(diào)PH至6.8-7.0，再通過內(nèi)含2.5公升的隋性大孔樹脂吸附柱吸附，用10公升0.5%氯化鈉溶液淋洗，再用少量蒸餾水淋洗后，然后用工業(yè)乙醇洗脫，得乙醇洗脫液15公升，內(nèi)含10-羥基喜樹堿4.6克。乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮至干后，加乙酸乙脂∶甲醇＝1∶1混合溶劑2公升迥流，迥流液濃縮至小體積，過濾，固體用少量甲醇和石油醚洗過后干燥，得粗品4克。粗品用1.5公升氯仿∶甲醇＝1∶1混合溶劑溶解后過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮至有少量結(jié)晶析出，放入冰箱，隔天取出過濾，用少量氯仿∶甲醇＝1∶1混合溶劑淋洗晶體，真空干燥，得純結(jié)晶2.5克，含10-羥基喜樹堿99.53%，質(zhì)量符合藥檢規(guī)格。
《表1》轉(zhuǎn)化后獲得產(chǎn)物和天然的10-羥基喜樹堿的理化性質(zhì)測定數(shù)據(jù)的比較測定項目 轉(zhuǎn)化后獲得產(chǎn)物 天然的10-羥基喜樹堿熔點(分解) 266.5-268℃ 266-267℃旋光〔α〕20D-140°(C.0.4吡啶) -147°(C0.0674吡啶)質(zhì)譜M/e 364(M+) 364(M+)元素分析 C，62.44 H，4.54 N，7.21 C，62.97 H，4.41 N，7.17紅外光譜厘米-13180，1760，1655，1590 3180，1760，1655，1590紫外光譜 225(4.70)，267(4.45) 225(4.75)，267(4.50)λ甲醇max(logE) 332(4.09)，384(4.47) 332(4.16)，384((4.53)核磁共振譜 0.84(三，3H，J＝7) 0.88(三，3H，J＝7)溶劑DMSO 1.82(四，2H，J＝7) 1.86(四，2H，J＝7)5.14(單，2H) 5.18(單，2H)5.38(單，2H) 5.41(單，2H)6.40(單，1H，重水交換) 6.44(單，1H，重水交換)7.26(單，1H) 7.26(單，1H)7.16-7.48(多，2H) 7.20-7.52(多，2H)7.95(雙，1H，J＝8) 8.04(雙，1H，J＝8)8.30(單，1H) 8.42(單，1H)10.20(寬，1H，重水交換) 10.30(寬，1H，重水交換)
表2三批10-羥基喜樹堿的提取數(shù)據(jù)《表3》三批轉(zhuǎn)化的10-羥基喜樹堿的質(zhì)量數(shù)據(jù)測定項目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 標準含水量 ＜1 ＜1 ＜1 ＜3喜樹堿含量(%) ＜1 ＜1 ＜1 ＜110-羥基喜樹堿含量(%) 97.61 99.53 97.11 ＞93熒光雜質(zhì)斑點 ＜3 ＜3 ＜3 ＜權(quán)利要求
1.由生物轉(zhuǎn)化喜樹堿生產(chǎn)10-羥基喜樹堿的方法，以喜樹堿為原料，通過曲霉菌株T-36的生物轉(zhuǎn)化和溶媒提取方法制得10-羥基喜樹堿。本發(fā)明特征在于該方法由A，黃曲霉菌株T-419生物轉(zhuǎn)化。B.發(fā)酵液經(jīng)填充大孔樹脂提取。C.濃縮物由醋酸乙酯甲醇迥流所組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1A所述方法其特征在于黃曲霉菌株T-419的轉(zhuǎn)化菌絲培養(yǎng)基為葡萄糖2.5%;黃豆并粉2.5%;淀粉1%;氯化鈉0.1%;硫酸鎂0.05%;磷酸氫二鉀0.38%;磷酸二氫鉀0.04%;消前自然PH。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1A所述的方法其特征在于喜樹堿的轉(zhuǎn)化是在懸浮菌絲的磷酸緩沖液內(nèi)進行，磷酸緩沖液的組成為磷酸二氫鉀0.04%;磷酸氫二鉀0.36%。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1A所述的方法其特征在于轉(zhuǎn)化溫度為26-28℃;通氣量為1∶1V/Vm;轉(zhuǎn)化的喜樹堿濃度為50-150微克/毫升;攪拌情況下轉(zhuǎn)化40小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1B所述的方法其特征在于采用填充的大孔樹脂為隋性大孔樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1B所述的方法其特征在于含有10-羥基喜樹堿的發(fā)酵液通過隋性大孔樹脂的吸附是在調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH為6.6-7.2和使含有0.2%氯化鈉濃度下進行吸附。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1B所述的方法其特征在于洗脫液為PH9-10.5的蒸餾水。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1C所述的方法其特征在于采用醋酸乙酯∶甲醇＝1∶1的混合溶劑迥流。
專利摘要
本發(fā)明系用生物轉(zhuǎn)化的方法，采用無毒黃曲霉菌株T-419，可將在喜樹中含量較高的喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿，轉(zhuǎn)化率達50％以上。本發(fā)明并采用惰性大孔樹脂的分離提取新工藝，將轉(zhuǎn)化后的10-羥基喜樹堿在大孔樹脂上吸附和分配層析，最后可得到符合藥規(guī)的產(chǎn)品，提取收率為50％，采用本發(fā)明生產(chǎn)10-羥基喜樹堿比原方法優(yōu)點是藥源擴大，原材料節(jié)約。
文檔編號C07D498/00GK85100520SQ85100520
公開日1986年8月13日 申請日期1985年4月1日
發(fā)明者朱關(guān)平 申請人:中國科學院上海藥物研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan