專(zhuān)利名稱(chēng):測(cè)量酶濃度的方法和裝置的制作方法
本發(fā)明談的是測(cè)量酶或含酶種群，例如細(xì)菌、酵母等，活性成分濃度的方法和裝置。
一般人們用顯微技術(shù)或用更復(fù)雜的技術(shù)，如對(duì)含酶液體的光學(xué)濁度測(cè)量，來(lái)計(jì)算濃度的。在美國(guó)專(zhuān)利3506544中，那時(shí)我是個(gè)合伙發(fā)明人，曾介紹過(guò)一種用電化學(xué)上可逆的氧化還原劑測(cè)量酶催化反應(yīng)中某種成分濃度的技術(shù)。把酶，一種氧化還原劑，如亞甲蘭，一種基質(zhì)，如葡萄糖，和一種可配伍的導(dǎo)電性介質(zhì)，例如緩沖的水溶液在電解槽中混合，通過(guò)把電壓施加在電極兩端，使電流通過(guò)電解槽。一般電極是由貴金屬制的，酶的活性使氧化的氧化還原劑按酶的濃度相應(yīng)的比例還原。還原的氧化還原劑在槽的陽(yáng)極處再氧化，由此產(chǎn)生的槽電流與還原的氧化還原劑的濃度成正比。從而證明電流的增加速率與溶液中酶的濃度成正比。
先前測(cè)量酶或細(xì)菌濃度的各種技術(shù)都有某些缺點(diǎn)。有的技術(shù)在測(cè)量極低濃度時(shí)不太靈敏或者很慢，或者需要很多步驟才能測(cè)量好。有的相當(dāng)昂貴，特別是用貴金屬或類(lèi)似物做電極的。此外，還發(fā)現(xiàn)在分析個(gè)別試樣時(shí)，有時(shí)產(chǎn)生難以解釋的誤差。
在連續(xù)使用同一個(gè)裝置測(cè)量多種試樣時(shí)，先前的技術(shù)會(huì)出現(xiàn)另一個(gè)問(wèn)題。人們發(fā)現(xiàn)把電極從一種試樣移到另一種試樣中時(shí)，第二個(gè)槽或試樣會(huì)被電極所吸附的酶或其它成分污染。同時(shí)為了保證槽的填充達(dá)到與標(biāo)定深度相同的、非常精確的測(cè)量深度時(shí)則需要格外小心，目的是讓浸入電解液中的電極表面面積保持恒定。即使極其小心，但在測(cè)量時(shí)還是發(fā)生了難以解釋的誤差。
在試驗(yàn)前需要先使溶液脫氧，這是先前技術(shù)存在的另一個(gè)問(wèn)題。人們發(fā)現(xiàn)在某些環(huán)境中，由于脫氧會(huì)有大量的好氧細(xì)菌失去活性。另一方面如果溶液不脫氧，則殘留的氧會(huì)干擾測(cè)量精度，因?yàn)樗鼤?huì)對(duì)做為測(cè)量依據(jù)的陽(yáng)極處的反應(yīng)產(chǎn)生影響。
按本發(fā)明做，先前技術(shù)中的這樣、那樣的問(wèn)題會(huì)大大減少或消除。
本發(fā)明提出了一種測(cè)量溶液中酶試劑濃度的方法和裝置，在溶液中電流在對(duì)應(yīng)電極和一個(gè)低孔隙度，長(zhǎng)圓柱形、高密度的石墨電極之間通過(guò)。石墨電極在溶液中繞自己的縱軸旋轉(zhuǎn)，溶液中還含有氧化還原劑和基質(zhì)，依靠酶試劑的催化作用進(jìn)行反應(yīng)，把氧化還原劑從氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)變成另一狀態(tài)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)電極氧化狀態(tài)的變化影響電流的變化。這種變化與氧化還原劑的氧化狀態(tài)的變化速率有關(guān)，又與酶試劑的濃度有關(guān)。
除石墨電極的端面外，石墨電極的浸入部分的全部表面被絕緣保護(hù)層，如環(huán)氧樹(shù)脂、涂復(fù)過(guò)。這種絕緣層是不導(dǎo)電的、惰性的，溶液中的成分是不可滲透的。這樣可以達(dá)到測(cè)量精度高、再用性高的目的，使人們可以在連續(xù)測(cè)試中，通過(guò)簡(jiǎn)單地去掉電極的裸露端，在不同的溶液中用同一個(gè)電極對(duì)酶試劑做一系列的連續(xù)的濃度測(cè)量。
本方法也提出在測(cè)量電流之前對(duì)溶液脫氣去掉氧。對(duì)某些酶試劑而言，如需氧細(xì)菌，人們發(fā)現(xiàn)在脫氣之前把氧化還原劑和基質(zhì)放入溶液中大大提高了測(cè)量精度。
在最佳方案中，本發(fā)明提出用EDTA二鈉來(lái)提高分析精度。
圖1是本發(fā)明測(cè)量酶試劑濃度的設(shè)備。
圖2是通過(guò)傳感電路的電流與時(shí)間的圖例。
圖3是溶液測(cè)量時(shí)反應(yīng)速率與細(xì)菌濃度之間的關(guān)系圖。
圖4是沿著圖1的4-4線(xiàn)取下的石墨電極的橫斷面圖。
圖1是盛有溶液12的光化玻璃容器10，溶液中酶試劑的濃度是待測(cè)量的，該酶試劑含有一種酶本身，或一種酵母，但本發(fā)明是專(zhuān)門(mén)為含細(xì)菌的溶液設(shè)計(jì)的。
溶液12含有水，它是用適宜的緩沖劑，如磷酸二氫鉀(KH2PO4)和磷酸氫二鉀(K2HPO4)，緩沖到PH7.0的。最佳PH值取決于待測(cè)量的特定的酶試劑，但一般中性PH值7.0是適宜的。乙二胺四醋酸二鈉鹽(EDTA二鈉)的加入量要足夠使它在溶液12中的濃度達(dá)到大約0.01克分子濃度。人們發(fā)現(xiàn)它減少了金屬離子的干擾，這些金屬離子可能以雜質(zhì)出現(xiàn)在溶液中，它們會(huì)影響酶的活性或通過(guò)溶液12的電流，以至產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。人們認(rèn)為乙二胺四醋酸二鈉與金屬離子生成了絡(luò)合物，阻止了金屬離子在測(cè)試中的沉淀(沉淀會(huì)吸留細(xì)菌或待分析的其它酶試劑)。因此乙二胺四醋酸二鈉的最佳用量和作用取決于存在的金屬離子，這可以用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)量。
把基質(zhì)和氧化還原劑加入溶液中，基質(zhì)和氧化還原劑的類(lèi)型選擇應(yīng)使它們能受到來(lái)自被測(cè)的，特定酶試劑的催化作用。對(duì)大多數(shù)細(xì)菌，一般用含大約0.01克分子濃度的葡萄糖和大約0.0001克分子濃度的亞甲蘭的溶液12可達(dá)到最好的結(jié)果。
通過(guò)容器頸口14、16、18和20可以達(dá)到容器10的內(nèi)部。在放入所有成分后，一種惰性氣體，如氬，通過(guò)管道30和分配管32，從開(kāi)孔34以冒泡的形式吹出，向上穿過(guò)溶液12。一般用5分鐘的時(shí)間從溶液12中除去大多數(shù)的游離的氧。冒泡的氬和任何揮發(fā)性物質(zhì)，如氧，向上通過(guò)蒸汽空間35，并通過(guò)出口管36從容器10中除掉。入口管30和出口管36都密封地安裝在頸口14的同一個(gè)雙孔塞38上。
另一個(gè)含溶液13的玻璃容器通過(guò)鹽橋100電解連接到容器10的裝置上，鹽橋含有瓊脂和氯化鉀。溶液13含有適當(dāng)?shù)碾娊庖?，例?.1克分子的鐵(三價(jià))的EDTA溶液，或氯化鉀水溶液。
通過(guò)頸口15、17和19可以達(dá)到容器11的內(nèi)部。如果需要的話(huà)，溶液13也可以脫氧，方法是通過(guò)入口管31和分配管33從開(kāi)口37冒泡，注入惰性氣體，如氬，向上穿過(guò)溶液13，冒泡的氬和氧以及任何其它揮發(fā)性物質(zhì)向上通過(guò)蒸汽空間39，并通過(guò)出口管41從容器11中除掉。入口管31和出口管41密封地安裝在頸口15的同一個(gè)雙孔塞43上。
電池或直流電源40裝有電位計(jì)42，電位計(jì)帶有滑動(dòng)觸頭44和電阻器46?；瑒?dòng)觸頭44通過(guò)導(dǎo)體50與對(duì)應(yīng)電極52相連。對(duì)應(yīng)電極52是由一般電極材料制成的。在大多數(shù)情況下，人們發(fā)現(xiàn)用鐵電極是滿(mǎn)意的。對(duì)應(yīng)電極52通過(guò)塞子54密封地安裝在頸口17中。
把一個(gè)高密度、低孔隙度的石墨電極56，通過(guò)塞子57安裝在容器10的頸口20上，并通過(guò)安培表60和導(dǎo)體62，用導(dǎo)線(xiàn)58連接到電池40的正極上。
把一個(gè)參比電極70，如飽和的甘汞電極，安裝在容器的頸口18的塞子72中，并用導(dǎo)體74和76通過(guò)電壓表78連接到石墨電極的導(dǎo)體58上。
裝置在工作時(shí)，必須讓石墨電極56旋轉(zhuǎn)，以保證電極與溶液12的成分有效地接觸，以取代在電極表面被消耗的氧化還原劑，這是用驅(qū)動(dòng)器80和傳動(dòng)器82實(shí)現(xiàn)的，如圖1所示，可采用很多種轉(zhuǎn)速，但最好的大約100-2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度旋轉(zhuǎn)電極?？梢杂玫退伲俣忍蜁r(shí)，電極會(huì)對(duì)外部振動(dòng)更敏感，對(duì)低濃度細(xì)菌的測(cè)量不太靈敏。
試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，電位計(jì)滑動(dòng)觸頭44沿著電阻器46調(diào)整直到電壓表78的讀數(shù)是0.0為止。用氬去掉溶液12中溶解的氧之后或同時(shí)加入，例如足夠的亞鐵EDTA去除殘余的微量氧，使通過(guò)安培表60的測(cè)量電流降到0。
由安培表60測(cè)出的，通過(guò)測(cè)試電路的電流，如圖2所示(即在石墨電極56和對(duì)應(yīng)電極52之間的電流)。一般電流與時(shí)間的變化開(kāi)始是非線(xiàn)性的，短時(shí)間之后就成了線(xiàn)性關(guān)系了。直線(xiàn)部分的斜率(如圖2中切線(xiàn)所示)與電極56處的氧化還原劑的反應(yīng)速率成正比，原因是酶的催化作用。反應(yīng)速率和具有葡萄糖和亞甲蘭(與細(xì)菌量有關(guān))的飽和溶液中的細(xì)菌濃度的典型關(guān)系用圖3表示。
在容器10中用300毫升的洪水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用0.112克的EDTA二鈉把它配成0.001克分子的EDTA二鈉溶液，向溶液加入1.633克的磷酸二氫鉀和3.136克的磷酸氫二鉀，使溶液的磷酸鹽為0.1克分子。用0.5當(dāng)量濃度的NaOH和0.5克葡萄糖(0.01M)把PH值調(diào)到7，并向溶液中加入15毫升的0.01M亞甲蘭(5×10-4M)。然后讓溶液與電極接觸。旋轉(zhuǎn)電極是事先用細(xì)沙紙拋光清理過(guò)的，再在玻璃板上拋光過(guò)。石墨電極下端裸露面為0.30厘米2，并以1000轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)。
相對(duì)于飽和甘汞電極，把電壓調(diào)到使旋轉(zhuǎn)電極為0.00伏。把電流作為時(shí)間的函數(shù)測(cè)量。當(dāng)電流與時(shí)間的變化斜率恒定不變時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為基準(zhǔn)，計(jì)算所測(cè)定的斜率和細(xì)菌數(shù)目。在這個(gè)實(shí)例中，從圖2的切線(xiàn)斜率測(cè)量反應(yīng)速率，如圖3中的虛線(xiàn)所示，當(dāng)反應(yīng)速率為大約6.25×10-9時(shí)，溶液中的細(xì)菌濃度在106和107細(xì)胞/毫升之間。
在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件下，用標(biāo)準(zhǔn)濃度的細(xì)菌或其它酶，可以制備與圖3相類(lèi)似的圖。在制備了這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后，可以用它重復(fù)地測(cè)量含同樣或相似細(xì)菌或酶的溶液的不同試樣。
圖4是圖1所示的高密度、低孔隙度石墨電極56，沿4-4線(xiàn)取的橫斷面圖。電極56由石墨芯96組成，它是非常純的，不可滲透的圓柱體，直徑大約從0.1到10厘米，最好從0.3到1.0厘米。石墨的孔隙度要低于10%。為了最大限度地減少對(duì)溶液的吸附，這一點(diǎn)很重要。否則會(huì)把溶液帶到下一個(gè)待測(cè)量的試樣中。電極孔隙的吸附作用會(huì)引起與增加電極表面相似的電效應(yīng)，即增加了氧化還原劑的氧化速度，可能產(chǎn)生錯(cuò)誤的讀數(shù)，在電極低速旋轉(zhuǎn)時(shí)尤為如此。
圓柱形棒96的外表面的涂層98可以是任何適用的不可滲透性材料。最好用聚合材料(如環(huán)氧樹(shù)脂、聚氨基甲酸乙酯等)。由于石墨電極可以浸在這類(lèi)材料中，并且粘附層在比較短的時(shí)間內(nèi)固化成致密的、硬的保護(hù)層。涂層不必太厚，只要不滲透水并對(duì)石墨的導(dǎo)電性起到絕緣作用就行。一般環(huán)氧涂層的厚度大約是1毫米。
加上涂層98后，去掉端部的涂層，把電極端部設(shè)有涂復(fù)的石墨表面110(見(jiàn)圖1)裸露出來(lái)。表面110是石墨和溶液12的唯一接觸面。保護(hù)涂層98至少要高達(dá)容器10的蒸汽空間35處，最好把石墨電極全部覆蓋住。
應(yīng)該用很細(xì)的沙紙打磨端面110去掉刮痕，產(chǎn)生一個(gè)光滑的表面。最好再用光滑的硬紙?jiān)谟财矫嫔?，例如玻璃板上拋光，直到金屬光澤覆蓋全部表面110為止，在臨使用前用甲醇和蒸餾水沖洗電極去掉油或其它污物。
通過(guò)制備非常光滑的、不透水的、有光澤的表面110，在連續(xù)測(cè)量中可獲得高精度，原因是提供了具有精確裸露面積的石墨電極，高精度的、可再現(xiàn)的電路。
本發(fā)明涂復(fù)石墨電極的極為引人注目的特點(diǎn)是對(duì)不同試樣或溶液12的連續(xù)測(cè)量中的適用性。例如液體可以更換，電極可以從頸口20抽出，用于具有不同溶液的不同容器10中。在把石墨電極56插入新溶液之前，去掉石墨的下端(如用研磨法)，以保證徹底去掉從先前測(cè)試中帶來(lái)的極少量的吸附液。把電極底部磨掉四分之一英寸或更多一點(diǎn)，再用細(xì)沙紙打磨和拋光底表面，電極便可用了，而與新電極毫無(wú)差別。此外，與先前的電極，如貴金屬電極不同，電極外涂層98上的任何沉淀物或污染物都不影響測(cè)量精度。這樣在電極外表面被腐蝕或被外來(lái)試劑包復(fù)后，不必把電極扔掉。
本發(fā)明的很多其它用途和變化對(duì)內(nèi)行人是顯而易見(jiàn)的，介紹本發(fā)明的特定方案僅僅是為了說(shuō)明。因此要用后邊的權(quán)限部分限定本發(fā)明的權(quán)利范圍。
權(quán)利要求
1.在測(cè)量酶試劑濃度的方法中，第一個(gè)電極在第一種溶液中至少是部分浸入的，第二個(gè)電極在第二種溶液中也是部分浸入的，第二種溶液與第一種溶液是電解連接的，在第一和第二電極之間施加電壓，在兩電極之間產(chǎn)生的電流與第一種溶液中的酶試劑的濃度有關(guān)，改進(jìn)之處是采用了孔隙度極低的第一種石墨電極以防止對(duì)溶液的大量吸附，約有四分之一英寸的電極浸入液面之下。
2.在發(fā)明權(quán)利要求
1中，石墨電極的孔隙度低于10%。
3.在發(fā)明權(quán)利要求
1中，石墨電極是圓柱形的，并繞其縱軸旋轉(zhuǎn)，其轉(zhuǎn)速足以保證電極與第一種溶液成分的有效接觸。
4.在發(fā)明權(quán)利要求
3中，電極的旋轉(zhuǎn)速度大約在100-2000轉(zhuǎn)/分鐘之間。
5.在發(fā)明權(quán)利要求
4中，除浸入端面外，圓柱形電極的浸入部分的全部表面都用電絕緣層包復(fù)起來(lái)，它對(duì)第一種溶液是不可滲透的。
6.在發(fā)明權(quán)利要求
5中，該圓柱形電極的直徑大約在0.1-10厘米之間。
7.在發(fā)明權(quán)利要求
6中，該電極直徑大約在0.3-1.0厘米之間。
8.在發(fā)明權(quán)利要求
1中，該溶液含酶試劑、氧化還原劑和基質(zhì)，還含有足量的EDTA二鈉，以提高對(duì)酶試劑濃度的測(cè)量精度。
9.使電極部分地浸入溶液和對(duì)電流做精確測(cè)量的方法制備一個(gè)圓柱形石墨電極，其直徑大約從0.1-10厘米之間，其孔隙度要低于大約10%，用不滲透的聚合物涂復(fù)圓柱形電極的表面，把圓柱形電極的端面拋光，使之平滑并產(chǎn)生金屬光澤。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9制備的電極。
11.在含酶和溶解了氧的水溶液中測(cè)量酶濃度的方法在一個(gè)容器中置入上述溶液的試樣，緩沖上述溶液到中性PH值，向上述溶液中加入基質(zhì)和氧化還原劑，上述基質(zhì)和氧化還原劑在酶的催化作用下從一種氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)變成另一種狀態(tài)，在加入上述基質(zhì)和氧化還原劑后，要從水溶液中去掉溶解的氧，制備另一種電解溶液，使上述水溶液和電解液電解連接，使相對(duì)應(yīng)的電極至少要部分地浸入上述電解液中，把石墨電極部分地浸入上述水溶液中，上述石墨電極由圓柱形石墨導(dǎo)體組成，其直徑大約是0.1-10厘米，其孔隙度低于10%，在石墨電極表面涂有不可滲透的絕緣層，但上述圓柱體的端面沒(méi)有涂復(fù)絕緣層，它是平整光滑的，并拋出了金屬光澤。使石墨電極以大約100-2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度繞其縱軸旋轉(zhuǎn)，在上述石墨電極和對(duì)應(yīng)電極之間施加電壓，測(cè)量在對(duì)應(yīng)電極和石墨電極之間的電流，從電流的變化速率測(cè)量水溶液中酶試劑的濃度。
12.在發(fā)明權(quán)利要求
11中，對(duì)應(yīng)電極是由鐵制成的。
13.在發(fā)明權(quán)利要求
11中的酶由細(xì)菌組成，其基質(zhì)和氧化還原劑由葡萄糖和亞甲蘭組成。
14.在發(fā)明權(quán)利要求
13中，金屬離子是以雜質(zhì)出現(xiàn)在水溶液中的，它還包括加入足量EDTA二鈉步驟，以便最大限度地減少金屬離子對(duì)酶測(cè)量精度的干擾。
15.在發(fā)明權(quán)利要求
14中還包括在測(cè)量電流之后，至少要從石墨電極的浸入端去掉四分之一英寸左右，把石墨電極再拋光，弄平滑，產(chǎn)生有金屬光澤的新裸露的表面，石墨電極可重新使用。
16.在發(fā)明權(quán)利要求
11中，通過(guò)無(wú)氧惰性氣體的冒泡作用從上述水溶液中去除溶解的氧。
專(zhuān)利摘要
酶、細(xì)菌或其它有關(guān)種群濃度的測(cè)量方法是利用這些種群使氧化還原劑催化還原，再在電解槽中把還原的氧化還原劑氧化。電解槽使用了一個(gè)用不可滲透的絕緣層部分涂覆的，致密的石墨電極。使氧化還原劑再氧化所需要的電量與酶或其它活性種群的濃度有關(guān)。
文檔編號(hào)C12M1/34GK85101698SQ85101698
公開(kāi)日1987年1月10日 申請(qǐng)日期1985年4月1日
發(fā)明者西爾弗曼 申請(qǐng)人:洛爾貝克技術(shù)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan