專利名稱:生物表面活性劑的制備方法
本發(fā)明是一種生物工程。
用微生物來生產(chǎn)表面活性劑是七十年代后期國(guó)際生物工程領(lǐng)域中發(fā)展起來的一個(gè)新課題。微生物在代謝過程中常分泌一些生化產(chǎn)物。其分子結(jié)構(gòu)具有親水和疏水兩種組分，如糖脂類，磷脂類及脂蛋白類等。生物表面活性劑具有乳化、破乳、潤(rùn)濕、增溶、發(fā)泡、消泡、抗靜電、抗腐蝕等功能，因此應(yīng)用范圍甚廣，可應(yīng)用于石油三次開采，消除石油污染及日化、食品和紡織工業(yè)等方面。
根據(jù)現(xiàn)在研究情況來看，糖脂是最主要的一類生物表面活性劑。日本花王石堿株式會(huì)社用球擬酵母(Torulopsis SP)生產(chǎn)槐糖脂(特許公報(bào)昭57-92785，92786)，日本S.Itoh實(shí)驗(yàn)室用假單孢菌(Pseudomonas SP)生產(chǎn)鼠李糖脂(J.Anti biotics 23，855，1971)，西德Wagner實(shí)驗(yàn)室用紅球菌(Rhod-ococcus erythropolis)生產(chǎn)海藻糖單脂及海藻糖二脂(Ger Pat DE-2646505，DE-2646506.DE-2646507)，其中海藻糖脂有良好的表面活性性能，可用于石油三次開采等方面。但上述專利中糖脂的產(chǎn)量?jī)H5-10克/升。
為了使糖脂達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平，必須改進(jìn)培養(yǎng)方法，提高產(chǎn)量，降低成本。
本發(fā)明是一種微生物生產(chǎn)海藻糖脂類表面活劑的方法，具體地說是一種用節(jié)桿菌(Arthrobacter Simplex)生產(chǎn)海藻糖單脂和海藻糖四脂的方法。該方法包括用節(jié)桿菌在最佳培養(yǎng)條件下，進(jìn)行代謝調(diào)節(jié)制備海藻糖脂類化合物或者用節(jié)桿菌休止細(xì)胞，制備海藻糖脂類化合物。
用本發(fā)明的節(jié)桿菌在培養(yǎng)條件下，進(jìn)行代謝調(diào)節(jié)制備海藻糖脂類化合物的方法，即在節(jié)桿菌存在下的培養(yǎng)物中加入酸或堿，調(diào)PH至4-8，以0.5-1.5(體積比)/分鐘的空氣或富含氧氣的空氣通入培養(yǎng)物，培養(yǎng)溫度為20°-40℃，最佳為25°-30℃。在培養(yǎng)液中含有銨鹽或硝酸鹽作為氮源以及其它為繁殖細(xì)胞所必需的無機(jī)鹽類和生長(zhǎng)因子。正烷烴、餾份油、原油、植物油和糖類可作為碳源。發(fā)酵終了，發(fā)酵液用1-3.5倍量的氯仿∶甲醇為1.5-3∶1(V/V)的溶劑或者用乙酸乙酯提取。
在上述方法中，本發(fā)明用節(jié)桿菌產(chǎn)糖脂的最佳培養(yǎng)條件是，可用玉米漿、旦白胨、牛肉汁、酵母膏作有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源，但用酵母膏最好。酵母膏用量控制在0.1-0.5%。另外該菌對(duì)微量元素也有特殊要求Zn++、Mn++、Ca++元素要控制一定量，培養(yǎng)液中含有ZnSO4·7H2O為0.001-0.005克/升。MnSO4·2H2O為0.01-0.05克/升。CaCl2·2H2O為0.01-0.05克/升。使菌體中蛋白質(zhì)合成控制在一定數(shù)量，體內(nèi)主要進(jìn)行脂肪代謝。培養(yǎng)液中要控制一定比例的碳、氮源，氮源不能太高?？刂铺荚春偷幢壤秊?0-40∶1發(fā)酵過程中維持PH4-8。不用氨水，而用KOH或NaOH來調(diào)節(jié)。
用本發(fā)明的節(jié)桿菌休止細(xì)胞，生產(chǎn)表面活性劑的方法。首先將節(jié)桿菌培養(yǎng)休止細(xì)胞，再用休止細(xì)胞直接生產(chǎn)海藻糖脂類化合物先找出利用何種廉價(jià)碳源能生產(chǎn)菌體，節(jié)桿菌能長(zhǎng)于葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糠、廢糖蜜、甘油、醋酸鹽等碳源，其中廢糖蜜和葡萄糖是較合適的碳源，菌體產(chǎn)量能達(dá)10克/升。將休止細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖液、生理鹽水、蒸餾水或自來水都能產(chǎn)生糖脂，而以磷酸緩沖液作培養(yǎng)液產(chǎn)糖脂最多。磷酸緩沖液濃度可為0.1-0.5M，PH為4-7培養(yǎng)溫度為20°-40℃，最佳溫度是25°-30℃。節(jié)桿菌休止細(xì)胞產(chǎn)糖脂可用各種糖類、正烷烴、餾份油或植物油作碳源，其中正烷烴轉(zhuǎn)化率能達(dá)0.4-0.6。
利用本發(fā)明的方法，節(jié)桿菌休止細(xì)胞在地下適當(dāng)條件下，如溫度15°-40℃，通空氣，PH控制在4-8，可直接用于石油的三次開采。采用本發(fā)明的方法，用節(jié)桿菌生產(chǎn)出的糖脂類化合物是海藻糖四脂和海藻糖單脂，二種糖脂間的比例也是隨著代謝調(diào)節(jié)改變的。當(dāng)?shù)捶窍拗婆囵B(yǎng)時(shí)，產(chǎn)物主要是海藻糖單脂，而當(dāng)?shù)聪拗茣r(shí)，產(chǎn)物則主要就是海藻糖四脂。用休止細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)物極大部分是海藻糖四脂。用本發(fā)明的方法生產(chǎn)所得的海藻糖脂可用石油三次開采及日化、紡織、食品等工業(yè)。
海藻糖四脂
海藻糖單脂
采用本發(fā)明代謝調(diào)節(jié)的方法，能使海藻糖脂類表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到25克/升左右，對(duì)碳源基質(zhì)的轉(zhuǎn)化率也能提高一倍。而采用休止細(xì)胞生產(chǎn)表面活性物的方法是一種廉價(jià)，簡(jiǎn)便的生產(chǎn)表面活性劑的方法。
本發(fā)明方法可用下面例子說明例一一個(gè)5升自控生物反應(yīng)器，裝2.0升營(yíng)養(yǎng)鹽溶液，成份為Na2HPO4·2H2O 1克，MgSO4·7H2O 0.5克，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1克，ZnSO4·7H2O 0.005克，KH2PO41克，(NH4)2SO42.5克，MnSO4·H2O 0.01克，CaCl2·2H2O 0.05克，酵母膏1克，溶于1升水中，加200毫升正烷烴，溫度30℃，接入節(jié)桿菌(Arthrobacter.SP)種子250毫升，轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)2.5立升/分，培養(yǎng)過程中自動(dòng)加入1N NaOH使PH值維持在6.50，發(fā)酵72小時(shí)，含表面活性物培養(yǎng)液2升，用二倍量三氯甲烷∶甲醇(V∶V＝2∶1)溶劑提取，得粗糖脂96克，經(jīng)硅膠柱層析得糖脂56克。
例二休止細(xì)胞生產(chǎn)糖脂1.休止細(xì)胞培養(yǎng)于把節(jié)桿菌培養(yǎng)下列培養(yǎng)液(5升三角瓶裝1升培養(yǎng)基)Na2HPO4·2H2O 1克/升，KH2PO41克/升，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.25克/升，MnSO4·2H2O 1克/升，KH2PO41克/升，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.25克/升，MnSO4·H2O 0.01克/升，CaCl2·2H2O 0.05克/升，葡萄糖30克/升，PH6.8，30℃，振蕩培養(yǎng)4天，離心菌體，用0.9% NaCl洗滌兩次，再放于0.1M磷酸緩沖液振蕩4小時(shí)，離心得休止細(xì)胞。
2.休止細(xì)胞在發(fā)酵罐中生產(chǎn)糖脂一個(gè)5升自控發(fā)酵罐，裝2.5升0.1M磷酸緩沖液(PH6.5)，接入相當(dāng)于25克干重的休止細(xì)胞，加入正烷烴200ml，轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)2.5立升/分，培養(yǎng)94小時(shí)，終了即用二倍量的二氯甲烷∶甲醇體積比(2∶1)提取，蒸干得粗脂122克。
權(quán)利要求
1.一種表面活性劑海藻糖脂類化合物的微生物制備方法，其特征在于用節(jié)桿菌作菌種，可以分別通過下列二種方法。(1).節(jié)桿菌在最佳培養(yǎng)條件下，進(jìn)行代謝調(diào)節(jié)制備海藻糖脂類化合物。(2).用節(jié)桿菌休止細(xì)胞制備海藻糖脂類化合物。
2.按權(quán)項(xiàng)1所述的方法中，其特征在于培養(yǎng)溫度為20°-40℃，最佳溫度是25°-30℃，PH＝4-8，以0.5-1.5(體積比)/分的空氣或富含氧氣的空氣通入培養(yǎng)物。
3.按權(quán)項(xiàng)1所述的方法中，其特征在于發(fā)酵后，發(fā)酵液用1-3.5倍量的甲醇-氯仿溶劑或乙酸乙酯提取，其中甲醇∶氯仿＝1∶1.5-3(V/V)。
4.按權(quán)項(xiàng)1、(1)所述的方法，其特征在于有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源可用玉米漿、蛋白胨、牛肉汁、酵母膏，最好用酵母膏，用量為0.1-0.5%。
5.按權(quán)項(xiàng)1、(1)所述的方法，其特征是培養(yǎng)液中含有ZnSO4·7H2O為0.001-0.005克/升，MnSO4·H2O為0.01-0.04克/升，CaCl2·2H2O為0.01-0.05克/升。
6.按權(quán)項(xiàng)1、(1)所述的方法，其特征是在發(fā)酵過程中用KOH或NaOH調(diào)節(jié)PH至4-8。
7.按權(quán)項(xiàng)1、(2)所述的方法，其特征是發(fā)酵碳源可以是葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、廢糖蜜、甘油或醋酸鹽，其中廢糖蜜、葡萄糖是合適的碳源。
8.按權(quán)項(xiàng)1、(2)所述的方法，其特征是休止細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖液、生理鹽水、蒸餾水或自來水中，但最好采用濃度為0.1-0.5M的PH4-7的磷酸緩沖溶液。
9.按權(quán)項(xiàng)1、(2)所述的方法，其特征是各種糖類、正烷烴、餾份油或植物油可作為碳源，但最好用正烷烴。
10.按權(quán)項(xiàng)1、(2)所述的方法，其特征是節(jié)桿菌休止細(xì)胞可直接用于石油三次開采。
專利摘要
一種生物表面活性劑的制備方法，該法將節(jié)桿菌培養(yǎng)在一種最佳培養(yǎng)條件下，并進(jìn)行代謝調(diào)節(jié)，控制適當(dāng)碳氮比例，能獲高產(chǎn)海藻糖脂；另采用節(jié)桿菌的休止細(xì)胞也能廉價(jià)簡(jiǎn)便地生產(chǎn)海藻糖脂。此海藻糖脂的主要成份是海藻糖四脂。
文檔編號(hào)C12P19/12GK85104026SQ85104026
公開日1986年11月19日 申請(qǐng)日期1985年5月21日
發(fā)明者李祖義 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan