專利名稱:微生物膽固醇酯酶制備工藝的制作方法
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種利用微生物發(fā)酵技術(shù)制備膽固醇酯酶的工藝。膽固醇酯酶能夠水解膽固醇酯為游離酯肪酸和膽固醇，分解得到的膽固醇進(jìn)一步經(jīng)膽固醇氧化酶、過氧化物酶催化的反應(yīng)，可測(cè)定血清中總膽固醇的含量，反應(yīng)過程如下
以上反應(yīng)原理已普遍應(yīng)用于臨床診斷，是測(cè)定人血清中總膽固醇含量的準(zhǔn)確、快速、靈敏的方法。在上述反應(yīng)中，于37℃每分鐘將1微克分子膽固醇酯分解成膽固醇和脂肪酸的酶量定為膽固醇酯酶的1個(gè)活力單位。1974年，Allain和Richmonds等人首先應(yīng)用牛胰膽固醇酯酶，微生物來源的膽固醇氧化酶，辣根過氧化物酶等三酶偶聯(lián)測(cè)定血清總膽固醇及游離膽固醇的含量，從而確立了酶法測(cè)定膽固醇含量的基礎(chǔ)。但是，用牛胰生產(chǎn)膽固醇酯酶有許多缺點(diǎn)(1)原料來源受限制，(2)牛胰破碎后成份復(fù)雜，且含有胰旦白酶等蛋白水解酶類，給分離、提取膽固醇酯酶帶來許多困難，(3)牛胰膽固醇酯酶的熱穩(wěn)定性差。能克服這些缺點(diǎn)而更適合于工業(yè)生產(chǎn)的是從微生物中獲得膽固醇酯酶。日本、西德、美國(guó)已先后從細(xì)菌、諾卡氏菌、鏈霉菌、霉菌中發(fā)酵得到此酶。日本學(xué)者曾經(jīng)從Pseudomonas菌屬中發(fā)酵得到膽固醇酯酶(日本公開特許公報(bào)，昭54-113493)，其在培養(yǎng)基中加入油酸、亞油酸及其膽固醇酯時(shí)，該菌株能同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，在一般的碳源中，只能生產(chǎn)膽固醇氧化酶，同時(shí)發(fā)明了分離膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的方法(日本公開特許公報(bào)，昭54-138188)，但未見將二酶配制成酶聯(lián)制劑的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是采用簡(jiǎn)便的制備工藝從微生物中獲得符合臨床分析要求的膽固醇酯酶。
本發(fā)明的任務(wù)是以如下方式完成的將經(jīng)過生理生化特征和形態(tài)培養(yǎng)特征鑒別為假單胞菌(Pseudomohas)的菌種(該菌種不管改用何種碳源或氮源只產(chǎn)生膽固醇酯酶，不產(chǎn)生膽固醇氧化酶)接種于以酵母膏，尿素為氮源;甘油為碳源;油酸、亞油酸及其膽固醇酯，或豆油、豆磷酯、卵磷酯、α-甘油磷酸等為誘導(dǎo)劑;以及各種無機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，在通氣，攪拌的條件下，提高發(fā)酵產(chǎn)酶單位，發(fā)酵液經(jīng)過分離、提取、鹽析、柱層等步驟，制得膽固醇酯酶。用此酶配制而成的酶聯(lián)試劑的穩(wěn)定性，澄明度均明顯優(yōu)于用胰臟膽固醇酯酶配得酶聯(lián)試劑。以此酶聯(lián)試劑測(cè)定血清中總膽固醇含量數(shù)據(jù)與用胰臟酯酶配得的酶聯(lián)試劑測(cè)定完全一致，且工藝簡(jiǎn)單，成本低。
實(shí)例一將冷凍管保存的Pseudomonas菌種接種在肉湯斜面培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，待菌體長(zhǎng)好后，接種于含有0.2～0.5%酵母膏，0.5～1.0%甘油，0.05～0.15%K2HPO4，0.1～0.3%尿素0.05%KCl，0.05～0.15%MgSO4，0.2～0.5%豆油，PH6.7～7.2，50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床230轉(zhuǎn)/min，30℃培養(yǎng)36～40小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束，用3500轉(zhuǎn)/min離心除去上清液，并用蒸餾水洗滌菌體，離心棄上清液，加入含表活性劑tritonX-100的tr;s-HCl緩沖液提取膽固醇酯酶，測(cè)得膽固醇酯酶發(fā)酵單位為0.2～0.4U/ml。
實(shí)例二用50L缶，將例一中的搖瓶種子接入裝有含0.5～1.5%酵母膏，0.5～1.5%甘油，0.2～0.3%尿素，0.05～0.15%K2HPO4，0.02～0.05%KCl，0.02～0.05%MgSO4，0.1～0.2%油酸，0.1～0.2%卵磷酯，PH值為6.7～7.2，并經(jīng)120℃，1.1Kg/cm2滅菌的30L培養(yǎng)基中，用1∶1V/V/min，30～33℃，培養(yǎng)30～40小時(shí)。
同實(shí)例一處理菌體得膽固醇酯酶提取液，測(cè)得膽固醇酯酶發(fā)酵單位200～400U/l。
提取液用40～60%飽和度的硫酸銨沉淀，沉淀溶解后所得粗酶用1MHAC溶液調(diào)PH至4.5，通入預(yù)先用PH4.5HAC緩沖液平衡好的甲基丙烯酸系弱酸性陽離子交換樹脂D-20柱中，膽固醇酯酶被吸附，用6倍量同樣的緩沖液洗滌柱，然后用PH5.2HAC緩沖液洗脫，膽固醇酯酶總收率67.5%，純度提高20倍。
實(shí)例三用50L缶，將例一中的搖瓶種子接入裝有含0.7～1.0%酵母膏，0.7～1.0%甘油，0.2%尿素，0.01%K2HPO4，0.05%KCl，0.05%MgSO4，0.2%油酸，0.2%卵磷酯，并經(jīng)120℃，1.1kg/cm2滅菌的30L培養(yǎng)基中，用1.1U/U/min，31℃，培養(yǎng)30～36小時(shí)，所得膽固醇酯酶發(fā)酵單位為300～400U/l。
(4)文件名稱 頁 行 補(bǔ)正前 補(bǔ)正后說明書 3 15 陽離子交換樹酯 陽離子交換樹脂(如D-20 SLPI-400)3 23 用1.1U/U 用1.1V/Vmin，min，31℃，通氣攪拌，31℃權(quán)利要求
書 1 6 在濕度30℃～ 在溫度30℃～33℃，33℃1 倒1 換樹酯吸附，換樹脂吸附，
權(quán)利要求
1.一種利用微生物發(fā)酵技術(shù)制備膽固醇酯酶的工藝。其特征是將假單胞菌(Pseudomonas)經(jīng)配方為0.5～1.5%酵母膏，0.5～1.5%甘油，0.2～0.3%尿素，0.05～0.15%K2HPO4，0.02～0.05%KCl，0.02～0.05%MgSO4及各種誘導(dǎo)劑0.2%～0.5%，PH6.7～7.2的發(fā)酵培養(yǎng)基，在濕度30℃～33℃，通氣攪拌培養(yǎng)30～40小時(shí)，通過分離，提取，鹽析、柱層獲得膽固醇酯酶。
2.按權(quán)利要求
1所述的那種利用微生物發(fā)酵技術(shù)制備膽固醇酯酶的工藝，其特征是誘導(dǎo)劑采用的酯類是豆磷酯，卵磷酯，膽固醇油酸酯，膽固醇亞油酸酯及α-甘油磷酸，采用的油類為油酸，亞油酸，豆油。
3.按權(quán)利要求
1所述的那種利用微生物發(fā)酵技術(shù)制備膽固醇酯酶的工藝，其特征是提取方法采用表面活性劑triton X-100，提取膽固醇酯酶。
4.按權(quán)利要求
1所述的那種利用微生物發(fā)酵技術(shù)制備膽固醇酯酶的工藝，其特征是層析方法采用甲基丙烯酸系弱酸性陽離子交換樹酯吸附，純化膽固醇酯酶。
專利摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。將假單胞菌(Pseudomonas)經(jīng)培養(yǎng)，發(fā)酵得到有膽固醇酯酶活性的菌體，通過分離，提取，精制制備膽固醇酯酶。
用此酶制得的酶聯(lián)試劑測(cè)定血清中總膽固醇含量，數(shù)據(jù)與用胰臟酯酶配制的酶聯(lián)試劑完全一致。該酶聯(lián)試劑質(zhì)量，穩(wěn)定性優(yōu)于胰臟酯酶配制的酶聯(lián)試劑，而且原材料易得到，工藝簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12N9/18GK86102532SQ86102532
公開日1988年4月20日 申請(qǐng)日期1986年10月10日
發(fā)明者楊光禮, 陳璧佩, 張一閔, 秦克亮, 熊振平 申請(qǐng)人:國(guó)家醫(yī)藥管理局上海醫(yī)藥工業(yè)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan