專利名稱:快速、簡便分離、篩選產(chǎn)L-多巴(L-Dopa)菌株的方法
本發(fā)明屬于從微生物的培養(yǎng)介質(zhì)中分離微生物的方法(國際專利分類號為C12N1/02)。
L-多巴(L-Dopa)是預(yù)防、治療帕金森氏病、震顫性麻痹綜合癥、一氧化碳中毒、錳中毒等病癥的有效藥物?，F(xiàn)在，可以從野生植物藜豆中提取、化學(xué)合成等途徑制取此藥。但這些方法原料來源有限、工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低、成本高。用微生物發(fā)酵催化L-酪氨酸合成L-多巴，其優(yōu)越性是工藝簡單，經(jīng)濟合算，適于工業(yè)化大生產(chǎn)，因此，必須獲得高產(chǎn)L-多巴的菌株，但用常規(guī)方法分離篩選產(chǎn)L-多巴菌株，不僅手續(xù)繁雜，時間長，而且很難得到產(chǎn)L-多巴的菌株。
本發(fā)明的目的是創(chuàng)造一種快速、簡便的方法，能分離、篩選到產(chǎn)L-多巴的菌株。
為達上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，采取十字花科植物的根系土壤，將所采土壤與適量的無菌生理鹽水混勻，然后再用無菌生理鹽水按10倍稀釋，取上述處理好的樣品涂布在選擇培養(yǎng)基上，在24℃～30℃溫度下培養(yǎng)3～7天，得到單個菌落。該選擇培養(yǎng)基的組成如下蛋白胨 10～20克NaCl 2～5克CaCl20.1～0.5克吐溫80(或吐溫60，或土溫20) 10～20毫升蔗糖 1～4克瓊脂 15克水 1，000毫升該選擇培養(yǎng)基的pH值為7.0，15磅20分鐘滅菌。選擇革蘭氏陰性，有沉淀環(huán)的單個黃色菌落，對所選菌落進行產(chǎn)L-多巴的檢測。首先進行定性檢測，然后再進行定量檢測。定性檢測和定量檢測的檢測方法是已知的。定性檢測將菌落用無菌生理鹽水稀釋，涂布在檢測培養(yǎng)基上(葡萄糖20克，蛋白胨10克，L-酪氨酸2克，(NH4)2SO45克，MgSO4·7H2O 0.2克，乳酸亞鐵0.5克，瓊脂15克，水1000毫升，pH6.5)，培養(yǎng)在28℃，5天，挑選出產(chǎn)黑色素的菌落。再進行這些菌產(chǎn)L-多巴的定量檢測。定量檢測將菌接入種子培養(yǎng)基(葡萄糖1.51.5克，NaCl15克，蛋白胨6克，牛肉膏6克，酵母膏3克，pH7.0)，30℃震蕩培養(yǎng)24小時，以1/20的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖15克，(NH4)2SO42.3克，K2HPO41克，MgSO4·7H2O 0.56克，CaCO33克，玉米漿20克，pH7.0)，28℃震蕩培養(yǎng)48小時，加入L-酪酸酸和抗壞血酸并調(diào)pH到5.5，L-酪氨酸和抗壞血酸可分多次加入，最后濃度分別為8.6克/升和5克/升，最后一次加入后，繼續(xù)培養(yǎng)15～20小時，將發(fā)酵液離心(5000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，然后測定上清液的L-多巴含量。具體方法是取1毫升待測液，加入1毫升0.5NHCl溶液混勻，再加入亞硝酸鹽-鉬酸鹽試劑(10克亞硝酸鈉和10克鉬酸鈉溶解于100毫升蒸餾水中)1毫升，再加入1毫升1N NaOH，顯出紅色則含有L-多巴，在530nm時，測定其0，D值與用同樣方法測蒸餾水(使成酸性)制成的L-多巴含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，則可查到發(fā)酵液所含L-多巴的量。
本發(fā)明完成一個工藝流程所需時間不超過16天，而常規(guī)分離、篩選方法要花一月左右的時間，還不一定能篩選到產(chǎn)L-多巴的菌株;本發(fā)明采樣位置準(zhǔn)確可靠，能篩選到產(chǎn)L-多巴菌株;本發(fā)明所設(shè)計的選擇培養(yǎng)基，所規(guī)定的選擇菌落的指標(biāo)以及對所選菌落相繼進行定性、定量檢測，為篩選到產(chǎn)L-多巴菌株提供了可靠的保證;本發(fā)明的工藝流程不僅簡便易行，比常規(guī)方法可靠，而且效果顯著，本發(fā)明人曾從10個樣品中篩選到8株轉(zhuǎn)化L-多巴的菌種，轉(zhuǎn)化率達60～97%，最好的一株株能將8.6克/升L-酪氨酸催化合成8.4克/升L-多巴，轉(zhuǎn)化率達97%。
下面是本發(fā)明的具體實施例用采樣器采取白菜的根系土壤，裝入無菌平皿，取其中10克土壤用90毫升無菌生理鹽水，在搗粹機(40，000轉(zhuǎn)/分鐘)中混勻一分鐘，然后再用無菌生理鹽水按10倍稀釋，取樣涂布在選擇培養(yǎng)基上，選擇培養(yǎng)基的最佳配方是蔗糖2克，蛋白胨12克，NaCl5克，CaCl20.2克，吐溫80，10毫升，瓊脂15克，水1，000毫升。該選擇培養(yǎng)基的pH值為7.0，15磅、20分鐘滅菌。培養(yǎng)在28℃，5天，選擇革蘭氏陰性，有沉淀環(huán)的單個黃色菌溶，進行產(chǎn)L-多巴的檢測。先進行定性檢測。再進行定量檢測，檢測方法如本發(fā)明的技術(shù)方案部分所述。從該樣品中分離篩選到一株產(chǎn)L-多巴的菌株，轉(zhuǎn)化8.6克/升L-酪氨酸成7.8克/升L-多巴，轉(zhuǎn)化率達90%。
權(quán)利要求
1.一種分離、篩選產(chǎn)L-多巴(L-Dopa)菌株的方法，其特征在于a、土壤樣品取自十字花科植物的根系土壤b、土壤樣品經(jīng)處理后采用選擇培養(yǎng)基分離菌種c、選擇菌落的指標(biāo)為革蘭氏陰性、有沉淀環(huán)的單個黃色菌落d、分離篩選工藝流程為取十字花科植物的根系土壤，將該土壤適量與一定量的無菌生理鹽水混勻，再用無菌生理鹽水按10倍稀釋，取上述處理好的樣品涂布在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～7天，培養(yǎng)溫度為24℃～30℃，選擇革蘭氏陰性、有沉淀環(huán)的單個黃色菌落，對所選菌落首先進行產(chǎn)L-多巴的定性檢測，然后進行產(chǎn)L-多巴的定量檢測。
2.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于選擇培養(yǎng)基的組成是CaCl20.1克～0.5克，蔗糖1～4克，吐溫80(或土溫60，或土溫20)10～20毫升，瓊脂15克，蛋白胨10～20克，NaCl2～6克水1000毫升。
專利摘要
本發(fā)明是創(chuàng)造了一種快速、簡便的方法，能分離、篩選到產(chǎn)L-多巴(L-Dopa)的菌株。L-多巴是一種預(yù)防、治療帕金森氏病，一氧化碳中毒等病癥的有效藥物，用本發(fā)明所要求分離、篩選的一類菌株生產(chǎn)它，工藝簡單適于工業(yè)化大生產(chǎn)。本發(fā)明是從土壤取樣，稀釋樣品，在選擇培養(yǎng)基上分離菌落，選擇革蘭氏陰性有沉淀環(huán)的黃色菌落，進行產(chǎn)L-多巴的定性和定量檢測。用該方法篩選到的轉(zhuǎn)化L-酪氨酸成L-多巴的菌株，轉(zhuǎn)化率達60～97％。
文檔編號C12P13/00GK86104727SQ86104727
公開日1987年2月11日 申請日期1986年7月19日
發(fā)明者彭珍榮 申請人:武漢大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan