專利名稱:新的脫氧核糖核酸及其用途的制作方法
這項(xiàng)發(fā)明涉及含有從酵母菌得到的啟動(dòng)子的新的DNA及其在遺傳工程中的應(yīng)用。
隨著DNA重組技術(shù)的廣泛應(yīng)用，利用無核或真核生物生產(chǎn)有用的多肽現(xiàn)已成為可能。迄今為止，大腸桿菌被用于大規(guī)模生產(chǎn)多肽，然而，希望應(yīng)用真核生物來生產(chǎn)藥理學(xué)上特別重要的多肽。酵母菌是一類真核微生物，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有許多相似之處，因此用于哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)是有利的。而且酵母菌在它們細(xì)胞中確不含內(nèi)毒素，易于培養(yǎng)。酵母菌的培養(yǎng)過去一直在大的工業(yè)規(guī)模上進(jìn)行，它的安全性是肯定無疑的。此外，已經(jīng)進(jìn)行了許多研究，去闡明它們遺傳的生物學(xué)機(jī)制。圍繞酵母菌的上述情況，都已導(dǎo)致它們作為宿主生物用于遺傳工程中。
目前已知有幾種酵母菌基因克隆體。然而，對能有效地表達(dá)外源基因的酵母菌啟動(dòng)子還了解甚少。
已知在一株啤酒酵母的裂解物中，存在有兩種酸性磷酸酶和兩種堿性磷酸酶。發(fā)現(xiàn)酸性磷酸酶在細(xì)胞的表面。其中一種酸性磷酸酶的產(chǎn)生受無機(jī)磷酸鹽的抑制，而另一種酸性磷酸酶是通過結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生的。一種堿性磷酸酶是一種阻遏酶，無機(jī)磷酸鹽能抑制它的產(chǎn)生，而且有廣泛的底物特異性。另一種堿性磷酸酶是一種特殊的對硝基苯磷酸酶，它的底物僅是對硝基苯磷酸鹽，而且這個(gè)酶的產(chǎn)生是通過結(jié)構(gòu)改變的。分離到了缺乏可阻抑的酸性磷酸酶活性的突變體Pho5、Pho4、Pho2和Pho81。PHO5基因是可阻抑的酸性磷酸酶的一種結(jié)構(gòu)基因，而PHO4、PHO2和PHO81基因是產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因，這種蛋白質(zhì)能調(diào)節(jié)可阻抑的酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)基因PHO5的表達(dá)。進(jìn)而PHO4和PHO81基因用來調(diào)節(jié)類似于PHO5可阻抑的堿性磷酸酶結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
已經(jīng)知道了酵母菌進(jìn)行基因克隆的各種載體，現(xiàn)在都已可以應(yīng)用。為了有效地表達(dá)天然或內(nèi)源的基因，以及外來的或外源的基因，必須選擇一種適合于所用宿主菌的有效的酵母菌啟動(dòng)子。
圖1是含有PHO81基因的DNA片段插入質(zhì)粒PAC4的限制性內(nèi)切酶圖譜;
圖2是DNA片段及其根據(jù)本發(fā)明克隆的PHO81基因和PHO81啟動(dòng)子衍生物的限制性內(nèi)切酶圖譜及PHO81突變的互補(bǔ)能力的圖示說明;
圖3是PHO81轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定的說明;
圖4說明含有PHO81的克隆的DNA片段進(jìn)行堿基序列分析的策略;
圖5表示PHO81基因啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列;
圖6是構(gòu)建PAC430質(zhì)粒的圖解;
圖7是為了adr型肝炎B病毒表面抗原基因表達(dá)，構(gòu)建重組DNA的圖解;
圖8是構(gòu)建lacz表達(dá)質(zhì)粒的圖解;
圖9表明含有PHO81基因的DNA序列。
本發(fā)明注意到了PHO81基因的啟動(dòng)子(下文中稱為PHO81啟動(dòng)子)，PHO81基因是表達(dá)酵母菌可阻抑的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的一種調(diào)節(jié)基因。本發(fā)明者已經(jīng)克隆了PHO81基因，測定了克隆DNA的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜，并測定了它的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸順序。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子是一種新的DNA，并適于有效地表達(dá)外源的和天然的基因。在以前研究的基礎(chǔ)上作出了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種能調(diào)節(jié)磷酸酶產(chǎn)生的PHO81基因的啟動(dòng)子活性，并能從啤酒酵母得到的一種DNA;上述類型的一種重組合DNA;一種在PHO81啟動(dòng)子下游位置上帶有編碼產(chǎn)生可阻抑的磷酸酶的正調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)基因或其它結(jié)構(gòu)基因的DNA;含有調(diào)節(jié)磷酸酶產(chǎn)生的PHO81基因啟動(dòng)子活性的DNA，并能從啤酒酵母得到的一種轉(zhuǎn)化子;含有上述PHO81啟動(dòng)子和PHO81啟動(dòng)子下游的結(jié)構(gòu)基因DNA的轉(zhuǎn)化子;基因產(chǎn)物生產(chǎn)的過程，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有調(diào)節(jié)磷酸酶產(chǎn)生的PHO81基因啟動(dòng)子活性的DNA的轉(zhuǎn)化子步驟，這一DNA可從啤酒酵母得到，并且?guī)в形挥谠揚(yáng)HO81啟動(dòng)子下游的結(jié)構(gòu)基因，因而，轉(zhuǎn)化子生長伴隨有基因產(chǎn)物的積累而從培養(yǎng)液中可以回收基因產(chǎn)物。具有PHO81基因啟動(dòng)子活性的上述DNA，最好是用磷酸來調(diào)節(jié)它的轉(zhuǎn)錄。有PHO81基因啟動(dòng)子活性的上述DNA最好是具有圖9中位置Ⅰ和限制性內(nèi)切酶SmaⅠ(
)酶切位點(diǎn)之間的堿基順序的DNA。
依據(jù)本發(fā)明，含有PHO81啟動(dòng)子以及編碼產(chǎn)生可阻抑的磷酸酶的正調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)基因(PHO81結(jié)構(gòu)基因)的DNA，可以從酵母菌細(xì)胞中分離并收集到。
任何菌株的啤酒酵母可以用于這一目的。尤為適用的菌株是一株屬于酵母屬的菌株，如啤酒酵母。商業(yè)上可以得到的面包酵母菌和啤酒酵母菌是適用酵母特有的實(shí)例。
根據(jù)Methods in Cell Biology，12，13-14(1975)所述方法，從酵母菌中可有效地提取DNA。
所提取的DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理得到DNA片段。經(jīng)如上相同的限制性內(nèi)切酶處理或用能形成相同粘性末端的限制性內(nèi)切酶酶切過的質(zhì)粒或噬菌體，與這種DNA片段相連接，從而得到基因庫。這種質(zhì)?？梢允莗BR322或大腸桿菌-酵母菌穿梭載體YEP13〔Gene，8，121，(1979)〕。噬菌體可用Charon噬菌體〔J.Virol，29，555，(1979)〕。如若需要，可用大腸桿菌-酵母菌穿梭載體YEp6進(jìn)一步產(chǎn)生亞克隆(Gene，8，17，(1979)〕。
然后，用帶有如此克隆過的DNA的載體去轉(zhuǎn)化宿主菌株。宿主菌最好是酵母菌，特別是酵母屬的菌株，最好是啤酒酵母種的菌株，啤酒酵母NA95-4B菌株更好。不過最好還是選擇PHO81突變株作為宿主菌。
菌株NA95-4B可用常規(guī)的雜交方法得到〔Handbook of Genetics，366，Plenum Press，New York(1974)〕。即通過與菌株AL211-12B(MATa，PHO 3-1，PHO8，arg6)〔Mol.Cell.Biol.，2，127(1982)〕，菌株AH22(MATa，leu2，his4，can1)〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1(1983)〕，菌株D13-1A(MATa，trp1，his3，gal2，Suc2)〔Proc、Natl、Acad.Sci.USA，76，1035(1979)〕，菌株YAT228(MATa，leu2，lys10，Cyh，Kar1-1)〔J.Bact-eriol.，145，1421(1981)〕和菌株W755-1C(MATa，PHO81，leu2，his3，his4)雜交而可以得到菌株NA95-4B。
PHO81突變株用上述構(gòu)建的基因庫或亞克隆DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到一株質(zhì)粒，這株質(zhì)粒含有PHO81啟動(dòng)子和編碼產(chǎn)生可阻抑的磷酸酶調(diào)節(jié)因子的開放閱讀框架的PHO81結(jié)構(gòu)基因。
能以任何已知方法進(jìn)行這種轉(zhuǎn)化，例如按照在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978);Nature，275，104(1978);Cold Spring Harbor Symp.，Quant.Biol.，43，1305(1979)和Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035(1979)所述方法之一或其它類似方法進(jìn)行。
不管轉(zhuǎn)化子是否含有PHO81啟動(dòng)子和產(chǎn)生可阻抑的磷酸酶調(diào)節(jié)因子的PHO81基因的密碼區(qū)，都可用下面的方法測定。
轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在Rubin氏改進(jìn)培養(yǎng)基中(C.M.Rubin，低磷酸的完全培養(yǎng)基)〔Eur.J.Biochem.，41，197(1974)〕形成菌落。然后在培養(yǎng)基上鋪上一層含有α-磷酸萘酯和堅(jiān)牢藍(lán)鹽B的瓊脂層。
如果克隆的DNA含有PHO81啟動(dòng)子和可阻抑的磷酸酶調(diào)節(jié)因子PHO81蛋白質(zhì)密碼區(qū)，則菌落變成紅色，表示PHO81基因的存在。從含有PHO81基因的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，然后用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶解。再將酶解液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或丙烯酰胺凝膠電泳，將有插入基因的DNA片段分開。這一系列操作在技術(shù)上已為大家所熟知，并在Molecular Cloning(1982)Cold SpringHarbor Laboratory中有詳細(xì)的敘述。
含有PHO81基因的DNA核苷酸順序可用雙脫氧核苷酸合成鏈末端終止法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)〕和 Maxam-Gilbert法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，560(1970)〕等測定。
通過檢查缺失質(zhì)粒和PHO81突變體(圖2)的互補(bǔ)能力之間的關(guān)系可推測PHO81基因蛋白質(zhì)密碼區(qū)的位置。用帶有猜想的PHO81基因的質(zhì)粒(如圖2中后色空框所表示的部分)作探針可檢測PHO81的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。從轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小和PHO81基因的堿基順序就可估計(jì)出PHO81啟動(dòng)子的位置(圖3，5和9)。
然后測定認(rèn)為含PHO81啟動(dòng)子區(qū)域的堿基順序(圖5)。核苷酸順序測定指出開放閱讀框架的存在。因此預(yù)期啟動(dòng)子位于開放閱讀框架的上游。制備開放閱讀框架上游和有PHO81啟動(dòng)子活性〔產(chǎn)生可阻抑的磷酸酶調(diào)節(jié)因子的能力，(見表1)〕部份的DNA(圖7)。然后將PHO81啟動(dòng)子活性的部份和如果需要其下游的所要求的結(jié)構(gòu)基因插入載體來制備表達(dá)載體(圖8)。把表達(dá)載體導(dǎo)入一種適合的宿主微生物中，在培養(yǎng)后它能產(chǎn)生所預(yù)期的基因產(chǎn)物。
帶有PHO81啟動(dòng)子活性的DNA可部分地或全部地通過化學(xué)過程進(jìn)行合成，這種合成或半合成的DNA可用于本發(fā)明的目的。
插入PHO81啟動(dòng)子的載體可以是如前所述的穿梭載體YEp6，YEp13或質(zhì)粒PSH19〔Mol.Cell.Biol.，4，104(1984)〕?；騊JDB29〔Nature，275，104(1978)〕。
PHO81啟動(dòng)子下游被插入的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)基因的例證有編碼可阻抑的酸性磷酸酶表達(dá)調(diào)節(jié)因子(PHO81)的調(diào)節(jié)基因，adw-型或adr-型肝炎B病毒表面抗原基因(HBSAg)，人類α-干擾素基因，人類β-干擾素基因，人類γ-干擾素基因，人類溶菌酶基因，人類間白血球溶菌素(interleukin)-2基因。
用含有PHO81啟動(dòng)子的DNA轉(zhuǎn)化的宿主菌以酵母為好，特別是酵母屬的菌種，更可取的是啤酒酵母種的菌株，而更特殊的菌株如啤酒酵母AH22R-〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1(1983)〕或啤酒酵母NA95-4B(參看上文)。
由此得到的轉(zhuǎn)化子可以培養(yǎng)在任何已知的培養(yǎng)基中，如Burkholder基本培養(yǎng)基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4505(1980)〕。
可通過測定培養(yǎng)條件如溫度和時(shí)間，從而得到所期望的最大產(chǎn)量的基因產(chǎn)物。通常使用的培養(yǎng)溫度大約在15-40℃，在24-37℃更好，而培養(yǎng)時(shí)間約10-96小時(shí)，24-72小時(shí)更好。如必要，可采用通氣和攪拌培養(yǎng)。
培養(yǎng)液中積聚的基因產(chǎn)物可用任何已知的方法進(jìn)行提取，例如，用溶菌酶如查莫溶菌酶(Zymolyase)(Seikagaku Kogyo，Ltd、Japan)溶解或裂解細(xì)胞，或使用玻璃珠機(jī)械破碎的方法。去污劑如Tritom-X100和蛋白質(zhì)變性劑如鹽酸胍可用來有效地提取產(chǎn)物。然后提取物用常規(guī)方法進(jìn)行分離與純化處理，如使用沉淀劑的沉淀、透析、電泳、離子交換樹脂層析、凝膠過濾或用抗體柱等方法。
依據(jù)本發(fā)明，提供了從真核生物酵母菌中得到一種新的有效的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子對藥理學(xué)上重要的蛋白質(zhì)基因的有效表達(dá)非常有用。
下述各例將更進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
在例1中用作起始物的啤酒酵母P-28-24C以登記號(hào)IF-10153保存在日本大阪發(fā)酵研究所，并以登記號(hào)ATCC60202保存在美國American Type Culture Colle-ction(ATCC)，轉(zhuǎn)化子啤酒酵母P-28-24C永久保存在IFO和ATCC，任何需要者可免費(fèi)獲得。
例8所示的轉(zhuǎn)化子大腸桿菌DH1/PAC430以登記號(hào)IFO-14456保存在日本大阪發(fā)酵研究所，并自1958年8月9日起以登記號(hào)FERMP-8411保存在日本通產(chǎn)省，工業(yè)科學(xué)與技術(shù)廳，發(fā)酵研究所(FRI)，并根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)定保存號(hào)改為FERM BP-1089。
例12所示轉(zhuǎn)化子啤酒酵母AH22R-/PACZ403從1986年5月28日起以登記號(hào)IFO-10207保存在日本大阪發(fā)酵研究所，并從1986年6月25日起根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)定以登記號(hào)FERM BP-1090保存在FRI。
實(shí)例1PHO81基因的克隆(見圖1)以常規(guī)方法從啤酒酵母P-28-24C(MATa Pho 3-1)(IFO 10153，ATCC60202)獲得的染色體DNA用限制性內(nèi)切酶Sau 3AI進(jìn)行部份酶解。依據(jù)Nasmyth和Reed的方法〔K.A.Nasmyth和S.I.Reed，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，2119(1980)〕將Sau 3AI酶切片段插入到酵母-大腸桿菌穿梭載體YEP13的BamHⅠ位點(diǎn)〔J.R.Broach等，Gene，8，121(1979)〕，制備出一個(gè)酵母菌基因庫，它大約由2000個(gè)氨芐青霉素抗藥性(Ampr)和四環(huán)素敏感(TcS)表現(xiàn)型大腸桿菌的克隆組成。為了轉(zhuǎn)化，將酵母菌基因庫的質(zhì)粒導(dǎo)入啤酒酵母NA95-4B(MATα pho81 leu2 his3 trp1 can1)。以菌落染色法〔G.Dorn的改進(jìn)方法Genet.Res.，6(1965)〕，用含α-磷酸萘酯0.5毫克/ml，堅(jiān)牢藍(lán)鹽B5毫克/毫升和0.05摩爾醋酸緩沖液的1%瓊脂溶液，去篩選顯示出可阻抑的酸性磷酸酶活性(rACp+)的轉(zhuǎn)化子。從大約8×103個(gè)亮氨酸原養(yǎng)型(Leu+)的轉(zhuǎn)化子中得到5個(gè)rACP+轉(zhuǎn)化子。按照Cameron等的方法〔J.R.Cameron等，Nucleic Acids Res.4，1429(1977)〕從這五株rACP+轉(zhuǎn)化菌株中的一株制備質(zhì)粒DNA，并將這種質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JA221中。35個(gè)Ampr轉(zhuǎn)化子都是TCS，并具有相同分子量的質(zhì)粒。這一質(zhì)粒命名為pAC4，再將其導(dǎo)入啤酒酵母NA95-4B中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。測試了所得到的18個(gè)Leu+轉(zhuǎn)化子可阻抑的酸性磷酸酶產(chǎn)生的活性，它們都是rACp+。這表明了pAC4插入有一個(gè)含有PHO81基因的DNA片段。如果含有PHO81，那么依靠它的同源性可期望pAC4能整合到染色體的pho81座位點(diǎn)上。含有pAC4的一株啤酒酵母YAT408(leu2，lys10，can1，cir0)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了遺傳分析來測定PAC4的整合位點(diǎn)。這樣，含PAC4的轉(zhuǎn)化子與啤酒酵母YAT637(MATa pho81 leu2)菌株雜交，進(jìn)行了四分體分析。結(jié)果，四分體中Leu+Acp+和Leu-Acp-表現(xiàn)型的分離顯示為4∶0，3∶1和2∶2。表現(xiàn)為4∶0，3∶1和2∶2分離的四分體數(shù)目分別是0，2和21。用含PAC4的轉(zhuǎn)化子與啤酒酵母YAT61(MATaPHO81 LEu2)進(jìn)行第二次雜交。重組二倍體的四分體分析顯示出，亮氨酸表現(xiàn)型分離為4+∶0-，3+∶1-和2+∶2-，其在四分體中的比例為2∶33∶4。前述的遺傳資料可以得出結(jié)論，PAC4插入于PHO81基因位點(diǎn)上或其附近，即PHO81基因已被克隆到PAC4質(zhì)粒中。
實(shí)例2帶有PHO81基因的DNA片段的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜的制備PAC4 DNA(1-5微克)用Bam HⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，PstⅠ，SalⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶的一種(4-6單位)或幾種結(jié)合在TA緩沖液中(P.H.O′Farrel等，Molec.Gen.Genet.，179，421(1980)〕37℃酶解1小時(shí)。酶解產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠或7.5%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，從凝膠估計(jì)限制性內(nèi)切酶酶切片段的分子量，以確定限制作用類型。然后，如圖1所示，制備限制性內(nèi)切酶的酶切圖譜，其中以字母表示酶切位點(diǎn)如下EEcoRⅠ HHindⅢSaSal Ⅰ XXhoⅠPPst Ⅰ B BamHⅠ實(shí)例3在克隆的DNA片段上PHO81基因位置的測定(見圖2)為了測定PHO81基因在克隆的DNA片段上的位置，制備了PAC4的各種缺失衍生物。將PAC4(5微克)在含6單位BamHI的50微升TA緩沖液中37℃酶解1分鐘，然后再在65℃下酶解10分鐘得到部分酶解的產(chǎn)物。取25微升酶解混合液與50微升含有5毫摩爾MgCl2，10毫摩爾二硫代蘇糖醇、0.05毫摩爾ATP和3單位T4連接酶的T4連接酶反應(yīng)液混合，在4℃放置18小時(shí)以重新連接上述的部分酶解產(chǎn)物。用T4連接酶反應(yīng)液(10微升)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JA221。從這樣得到的Ampr轉(zhuǎn)化子中用Birnboim-Doly方法〔H.C.Birnboim和J.Doly，Nucleic Acids Res.，7，1513(1979)〕分離質(zhì)粒DNA，從而得到缺失質(zhì)粒PAC4-LB3。用上述相同方法，以SalⅠ和Xho Ⅰ酶代替BamHⅠ重復(fù)上述過程，分別得到缺失質(zhì)粒PAC4-LSI和PAC4-LX1。進(jìn)而，用上述方法以HindⅢ酶處理PAC4-LB3得到缺失質(zhì)粒PAC4-LB3H。獲得的每一種缺失質(zhì)粒DNA用來轉(zhuǎn)化啤酒酵母NA95-4B，并選擇Leu+轉(zhuǎn)化子。用10株這種轉(zhuǎn)化菌株試驗(yàn)了它們與可阻抑的酸性磷酸酶(rACP+1)有關(guān)的表現(xiàn)型。PHO81突變體同各缺失質(zhì)粒的互補(bǔ)測驗(yàn)結(jié)果在圖2中以+和-表示。
啤酒酵母NA95-4B用PAC4-LX1進(jìn)行轉(zhuǎn)化。重組合的Leu+轉(zhuǎn)化子產(chǎn)rACP的活性低于野生型菌株(這種活性在圖2中以+表示)。前述結(jié)果指出PHO81基因位于圖2中白色方框所示的位置上(大約3.0kb)。
實(shí)例4含有pAC4-LB3的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生酸性磷酸酯酶的活性例3中獲得含有PAC4-LB3的轉(zhuǎn)化子啤酒酵母NA95-4B/PAC-LB3，在5毫升Berkholder′s氏改進(jìn)的高濃度磷酸培養(yǎng)基和低濃度磷酸培養(yǎng)基中〔A.Toh-e等，J.Bacteriol，113，727(1973)〕，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。收集細(xì)胞，用Torriani的改進(jìn)方法〔A.Torriani，Biochim.Biophys.Acta，38，460(1960)〕測定酸性磷酸酶活性。結(jié)果如表1所示。
表1含有PAC4-LB3的轉(zhuǎn)化子酸性磷酸酶產(chǎn)生的活性
a)標(biāo)出只與磷酸酶有關(guān)的基因型＊)單位/毫升/OD600。
b)KH2PO4濃度為1.5毫克/毫升c)KH2PO4濃度為0.03毫克/毫升從表1可以知道，PAC4-LB3產(chǎn)生酸性磷酸酶受無機(jī)磷酸鹽的抑制。因此，認(rèn)為克隆的PHO81基因包含有編碼調(diào)節(jié)PHO5表達(dá)的蛋白質(zhì)(PHO81基因的產(chǎn)物)區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域。
實(shí)例5PHO81基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的鑒定PHO81的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用Northern雜交方法進(jìn)行鑒定。制備總的核糖核酸用Jansen方法〔R.Jensen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，3035.(1983)〕在完全培養(yǎng)基(+P)和低濃度磷酸培養(yǎng)基(-P)培養(yǎng)的啤酒酵母P-28-24C中進(jìn)行，接著用Schleif和Wensink方法〔P.F.Schleif和P.C.Wensink，Practical Methods in Molecular Biology，(1981)，Springer-Verlag〕的寡聚dT-纖維素親和柱層析，純化得到多聚(A+)-RNA。獲得的多聚(A+)-RNA樣品如文獻(xiàn)所描述的那樣〔Molecular Cloning，(1982)，Cold Spring Harbor Labo-ratory〕進(jìn)行甲醛凝膠電泳。接著用Thomas方法〔P.S.Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5201(1980)〕進(jìn)行吸印和雜交。使用柯達(dá)(Kodak)X-O-matRP膠片和柯達(dá)增感屏在-80℃完成放射自顯影。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定所用的DNA探針是由質(zhì)粒pAC450的制品翻譯〔P.W.J.Rigby等，J.Mol.Bol.，Vol.113，237(1977)〕制備的，質(zhì)粒PAC450是9.2kb左右克隆的酵母染色體DNA中BamHⅠ酶切點(diǎn)與YEp13的SalⅠ酶切點(diǎn)之間3.2kb左右的BamHⅠ-SalⅠ酶切片段，亞克隆到BamHⅠ-SalⅠ雙酶酶解的PBR322中得到的。
圖3列出了這些結(jié)果。PHO81轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為2.8kb。PHO81轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量遠(yuǎn)較編碼乳清酸核苷-5′磷酸脫羧酶的URA3基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量大〔酵母菌的分子生物學(xué)，life cycle and inheritance，Cold Spring Harbor Lab，731(1981)〕，這一事實(shí)推測了PHO81啟動(dòng)子有強(qiáng)的活性。由于PHO81的轉(zhuǎn)錄在高磷酸鹽環(huán)境中(+P)受到抑制，因此認(rèn)為PHO81啟動(dòng)子受磷酸抑制。
實(shí)例6帶有PHO81基因的3.0kb DNA片段的限制性內(nèi)切酶圖譜的制作BamHⅠ位點(diǎn)和Sau 3AI/BamHⅠ位點(diǎn)(圖2中以白色帶所示區(qū)域)之間含有PHO81基因的酶切片斷的限制內(nèi)切酶圖譜用14種酶(AluⅠ，BanⅡ，BstNⅠ，DdeⅠ，EcoRⅠ，HaeⅢ，HindⅢ，HpaⅠ，HpaⅡ，RsaⅠ，SalⅠ，Sau3AⅠ，Sau961和XhoⅠ)進(jìn)行制作，如圖4所示。用一種或兩種酶結(jié)合酶解這個(gè)片段。混合物在7.5%或12%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。從酶切模式測算酶切位點(diǎn)。PBR322的HaeⅢ或AluⅠ酶解產(chǎn)物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖4僅標(biāo)出已被肯定了的酶切位點(diǎn)。
實(shí)例7帶有PHO81基因的DNA堿基順序的測定位于BamHⅠ和BamHⅠ/Sau3A位點(diǎn)之間認(rèn)為帶有PHO81基因的3.0 kb DNA片段的堿基順序，依據(jù)Maxam-Gilberf法(參看上文)進(jìn)行測定，并示于圖5。在核苷酸順序中存在一個(gè)大約2.5 kb的轉(zhuǎn)譯區(qū)。從這一結(jié)構(gòu)中預(yù)期轉(zhuǎn)錄的方向是從BamHI位點(diǎn)到BamHI/Sau2A位點(diǎn)。轉(zhuǎn)譯起始密碼子“ATG”存在于BamHI位點(diǎn)下游約520堿基處。從“ATG”上游67 bp(堿基對)處，存在著認(rèn)為有TATA盒功能的TATTA序列。類似于帽子形成(Capping)位點(diǎn)的TCATCA序列存在于“ATG”上游的57 bp處。進(jìn)而在“ATG”上游的109 bp處有-CCAAT序列。這一序列是與CCAAT盒序列〔Nucleic Acids Res.，10，2625-2637(1982);同上刊，12，857-872(1984);同上刊，12，1137-1148(1984)〕相同的。圖5顯示了BamHⅠ切點(diǎn)下游的700堿基區(qū)域的堿基順序。PHO81基因5′-上游側(cè)的非轉(zhuǎn)譯區(qū)域和PHO81基因5′-末端區(qū)域被認(rèn)為包括在已闡明的區(qū)域中。
實(shí)例8質(zhì)粒PAC430的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化子的制備質(zhì)粒PAC-LB3(5微克)以例2所述方法用5單位的BamHⅠ和5單位SalⅠ酶解。酶解混合物在1%低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)了3.2kb的DNA片段。這個(gè)片段與經(jīng)5單位BamHⅠ和5單位SalI酶解過的PBR322(5微克)混合，混合物再以例2所述的相同方法用T4連接酶連接，獲得質(zhì)粒PAC430(見圖6)。質(zhì)粒PAC430引入大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化子大腸桿菌DH1/PAC430(IFO14456，F(xiàn)ERMBP-1089)。
實(shí)例9用PHO81啟動(dòng)子構(gòu)建adw-型肝炎B病毒表面抗壓P25基因表達(dá)質(zhì)粒以及這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌質(zhì)粒PAC430(0.5微克)用1單位酶AccⅡ(日本基因公司制造)在20微升反應(yīng)液〔6毫摩爾Tris-HCl(PH7.5)60毫摩爾NaCl，6毫摩爾MgCl2，6毫摩爾2-巰基乙醇〕中37℃酶解2小時(shí)，再用酚除去蛋白質(zhì)，DNA用冷乙醇沉淀。沉淀的DNA與50毫微克5′端磷酸化的SalI人工接頭〔5′-P-d(GGTCGACC)〕(New England Biolabs Inc制造)混合，混合物在含66毫摩爾Tris-HCl(PH7.6)，6.6毫摩爾MgCl2，10毫摩爾二硫代蘇糖醇，1毫摩爾ATP和2單位T4DNA連接酶(New England Biolabs Inc.公司制造)的20微升反應(yīng)液中14℃過夜，連接DNA。用上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1〔T.Maniatis等，Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Laboratory，254-255頁(1982)〕，選擇氨芐青霉素抗藥性轉(zhuǎn)化子。從選出的轉(zhuǎn)化子中得到SalI位點(diǎn)取代質(zhì)粒PAC430中ACCⅡ位點(diǎn)的質(zhì)粒PAC430-1(見圖7)。質(zhì)粒PAC430-1(10微克)用10單位BamHI和10單位SalI(日本基因公司制造)在50微升反應(yīng)液〔〔10毫摩爾Trs-HCl.(PH7.5)，7毫摩爾MgCl2，100毫摩爾NaCl，7毫摩爾2-巰基乙醇〕中，37℃酶解2小時(shí)。然后酶解物用1.2%平板瓊脂糖凝膠在緩沖液〔100毫摩爾Tris-HCl 100毫摩爾硼酸，2毫摩爾EDTA(PH8.3)〕中，140V電泳2小時(shí)。電泳后，將含0.5 kb DNA片段區(qū)域的凝膠放于透析袋，浸入上述電泳緩沖液中。用電洗提法從凝膠中提出DNA〔M.W.McDonell等，J.Mol.Bio.，110，119(1977)〕。透析袋中的液體用酚提取，再用乙醚提取。提取后的水相用氯化鈉調(diào)到0.2M。含PHO81啟動(dòng)子的DNA片段用2倍體積的冷乙醇沉淀。
adw-型肝炎B病毒表面抗原(HBs AgP25)基因表達(dá)質(zhì)粒pPHO17-58已公開于1984年9月13日申請的日本專利申請No59-193765說明書的實(shí)例中(這相當(dāng)于歐洲專利公開No175283)，取pPHO 17-58質(zhì)粒50微克，用50單位XhoI(日本基因公司制造)在100微升反應(yīng)液〔10毫摩爾Tris-HCl，(PH7.5)，7毫摩爾MgCl2，100毫摩爾NaCl，7毫摩爾2-巰基乙醇〕中37℃部分酶解20分鐘。用上述相同條件及板狀瓊脂糖凝膠，從酶解混合物中分離出9.1 kb DNA片段，這一片段僅在質(zhì)粒的兩個(gè)XhoI位點(diǎn)的一個(gè)位點(diǎn)上被酶解。
而后，所得的9.1kb DNA片段(4微克)用4單位BamHI在10微升的反應(yīng)液〔6毫摩爾Tris-HCl(PH7.9)，150毫摩爾NaCl，6毫摩爾MgCl2〕中，37℃酶解2小時(shí)，接著在上述相同條件下進(jìn)行電泳，從而分離出8.55kb DNA。
8.55kb DNA(200毫微克)與含PHO81啟動(dòng)子的0.5kb DNA(20毫微克)用T4 DNA進(jìn)行連接反應(yīng)。用這一重組合的混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1。從氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子中選出含質(zhì)粒pPHO81-P25的轉(zhuǎn)化子DH1/pPHO81-P25，在這pPHO81-P25質(zhì)粒中，啟動(dòng)子PHO81以有意義方向作為HBsAgP25基因插入在其中。然后，從轉(zhuǎn)化子分離出質(zhì)粒pPHO81-P25(見圖7)，并導(dǎo)入到啤酒酵母AH22R-菌株中，從而得到轉(zhuǎn)化子AH22R-/pPHO81-P25。
實(shí)例10應(yīng)用PHO81啟動(dòng)子構(gòu)建adr-型肝炎B病毒表面抗原P31的表達(dá)質(zhì)粒及此質(zhì)粒在酵母菌的轉(zhuǎn)化adr-型肝炎B病毒表面抗原(HBsAgP31)基因表達(dá)質(zhì)粒pPHO31-R公開于國際專利申請NoPCT/TP84/423的實(shí)例3中(國際申請日期1984年9月4日)(它與歐洲專利公開No171908相同)。取該質(zhì)粒(50微克)用50單位酶SalI在100微升反應(yīng)液中〔6毫摩爾Tris-HCl(PH7.9)，150毫摩爾NaCl，6毫摩爾MgCl2，6毫摩爾2-巰基乙醇〕，37℃酶解20分鐘。從酶解物中用上述方法中的平板瓊脂糖凝膠分出9.7kb DNA片段，它僅在質(zhì)粒的兩個(gè)SalI酶切位點(diǎn)的一個(gè)位點(diǎn)上被酶解。
這樣回收的9.7kb DNA片段(4微克)用4單位BamHI酶解，然后，在上述條件下電泳，從而分離出9.2kb的DNA。這9.2kb DNA(200毫微克)與含PHO81啟動(dòng)子的0.5kb DNA(20毫微克)用T4 DNA連接酶連接。得到的混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1。從氨芐青霉素抗藥性轉(zhuǎn)化子中選出含質(zhì)粒pPHO81-P31的轉(zhuǎn)化子DH1/pPHO81-P31，在這一質(zhì)粒中PHO81啟動(dòng)子作為HBsAgP31基因以正確的方向插入。然后從轉(zhuǎn)化子中分離出質(zhì)粒pPHO81-P31(見圖7)，并引入宿主，菌株啤酒酵母AH 22R-中，獲得轉(zhuǎn)化子AH22R-/pPHO81-P31。
實(shí)例11HBsAg基因在酵母菌中的表達(dá)含有HBsAg基因表達(dá)質(zhì)粒并能在例9和10中得到的轉(zhuǎn)化子，即啤酒酵母AH22R-/pPHO81-P25和AH22R-/pPHO81-P31，在Burkholder培養(yǎng)基及其低磷酸培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)2天。收集細(xì)胞，用生理鹽水洗滌。然后依據(jù)宮野原的方法〔A.Miyano-hara，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1(1983)〕用溶菌酶(Zymolyase)(日本Seikagaku Kogyo Co.Ltd.)處理細(xì)胞，形成球形體。為了加快HBsAg的提取，加入0.1%Triton X-100后，溶菌產(chǎn)物在室溫下以15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。用奧斯酶Ⅱ(OrthzymeⅡ)(Dynabot K.K.制造)試驗(yàn)上清液測試HBsAg的活性。
實(shí)例12用PHO81啟動(dòng)子表達(dá)LacZ基因限制性內(nèi)切酶ScaI和SmaI各10單位(日本Takara Shuzo Co.Ltd.制造)和10微克含PHO81基因(從圖2中白色部分到Y(jié)Ep13的SalI切點(diǎn)這一區(qū)域)的PAC430，在100微升反應(yīng)液〔33毫摩爾Tris-醋酸(PH7.9)，66毫摩爾KAc，10毫摩爾Mg(Ac)2，5毫摩爾二硫代蘇糖醇〕中，37℃酶解2小時(shí)。酶解液用4%聚丙烯酰胺凝膠在緩沖液中(89毫摩爾Tris89毫摩爾硼酸，2.5毫摩爾EDTA)150伏電泳3小時(shí)。電泳后，含2100堿基對DNA片段(ScaI-SmaI酶切片段)的凝膠部份放在一只Corax離心管中破壞凝膠，然后加入5毫升含0.5毫摩爾NH4Ac，10毫摩爾Mg(Ac)2，1毫摩爾EDTA，0.1%(W/V)十二烷基磺酸鈉的DNA提取液。生成的混合物可在37℃下放置過夜并過濾。加乙醇到濾液中沉淀DNA片段，進(jìn)行回收，以便用于下述的連接反應(yīng)。
質(zhì)粒pMC1587(1微克)用1單位SmaI(Takara Shuzo Co.Ltd.制造)在50微升反應(yīng)混合液(1毫摩爾Tris，10毫摩爾NaCl.0.6毫摩爾MgCl2)中37℃酶解2小時(shí)。DNA的酶切片段用乙醇沉淀，回收。PMC1587用SmaI酶切得到的上述DNA片段(0.1微克)與2100堿基對的Sca I-SmaI片段(5微克)用T4 DNA連接酶連接，產(chǎn)生質(zhì)粒PACZ403(圖8)。如此獲得的質(zhì)粒中，位于2100堿基對的ScaI-SmaI DNA片段中PHO81轉(zhuǎn)譯順序部分位于PMC1587中的lacZ轉(zhuǎn)譯順序，在SmaI連接位點(diǎn)上連接起來，而兩個(gè)基因的閱讀框架得到了調(diào)整。
由此獲得的質(zhì)粒PACZ403被引入啤酒酵母AH22R-中，得到轉(zhuǎn)化子啤酒酵母AH22R-/PACZ403(IFO-10207，F(xiàn)ERM BP-1090)。這一轉(zhuǎn)化子用實(shí)例11所述的同樣方法培養(yǎng)20小時(shí)，并用實(shí)例11中所述的相同方法處理細(xì)胞，得下列結(jié)果β-半乳糖苷酶的表達(dá)單位/升含高濃度磷酸的培養(yǎng)基 600(KH2PO4，1.5克/升)含低濃度磷酸的培養(yǎng)基 2600(KH2PO4，0.3克/升)實(shí)例13PHO81基因的序列測定含有PHO81基因的BamHⅠ-BanⅡ片段(大約2.6kb)的DNA序列，按照例7所述的Maxam-Gilbert法進(jìn)行測定，示于圖9。這一堿基序列中約在2330堿基對的區(qū)域存在一個(gè)“終止密碼子”。
勘誤表
勘誤表
勘誤表
權(quán)利要求
1.具有調(diào)節(jié)磷酸酶產(chǎn)生的PH081基因啟動(dòng)子活性的DNA，這種DNA可從啤酒酵母得到。
2.按照權(quán)利要求
1中所述的DNA，其中該P(yáng)HO81基因的轉(zhuǎn)錄受磷酸調(diào)節(jié)。
3.按照權(quán)利要求
1中所述的DNA和具有圖9中位置1和限制性內(nèi)切酶SmaⅠ酶切位點(diǎn)之間堿基順序的DNA。
4.按照權(quán)利要求
1、2或3中所述的DNA并是重組的DNA。
5.具有PHO81啟動(dòng)子下游結(jié)構(gòu)基因的權(quán)利要求
1、2、3或4中所述的DNA。
6.按照權(quán)利要求
5中所述的DNA，其中結(jié)構(gòu)基因與產(chǎn)生可阻抑的磷酸酶的正調(diào)節(jié)因子編碼的結(jié)構(gòu)基因不相同。
7.按照權(quán)利要求
6中所述的DNA，其中結(jié)構(gòu)基因是從adw-型肝炎B病毒表面抗原P25基因、adr-型肝炎B病毒表面抗原P31基因和lacZ基因組成的一組基因中選出的。
8.含有調(diào)節(jié)磷酸酶產(chǎn)生的PHO81基因啟動(dòng)子活性的DNA轉(zhuǎn)化子，并能從啤酒酵母得到。
9.按照權(quán)利要求
8中所述的轉(zhuǎn)化子，其中該P(yáng)HO81基因的轉(zhuǎn)錄是受磷酸所調(diào)節(jié)的。
10.按照權(quán)利要求
8中所述的轉(zhuǎn)化子，其中DNA具有圖9中位置1和SmaⅠ酶切位點(diǎn)之間的堿基順序。
11.按照權(quán)利要求
8、9或10中所述的轉(zhuǎn)化子，其中DNA具有PHO81啟動(dòng)子下游的結(jié)構(gòu)基因。
12.按照權(quán)利要求
8中所述的轉(zhuǎn)化子，是大腸桿菌DHI/PAC430(FERM BP-1089)。
13.按照權(quán)利要求
8中所述的轉(zhuǎn)化子，其中宿主菌是酵母。
14.按照權(quán)利要求
8中所述的轉(zhuǎn)化子，是啤酒酵母AH22R-/pPHO81-P25。
15.按照權(quán)利要求
8中所述的轉(zhuǎn)化子，是啤酒酵母AH22R+/pPHO81-P31。
16.按照權(quán)利要求
8中所述的轉(zhuǎn)化子，是啤酒酵母AH22R-/PACZ403(FERM BP-1090)。
17.一種基因產(chǎn)物產(chǎn)生的過程，包括步驟在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)化子，它含有調(diào)節(jié)磷酸酶產(chǎn)生的PHO81基因啟動(dòng)子活性的DNA，并是能從啤酒酵母獲得的，還含有位于該P(yáng)HO81啟動(dòng)子下游的結(jié)構(gòu)基因，結(jié)果轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生長，同時(shí)積累基因的產(chǎn)物;和從培養(yǎng)液中回收基因產(chǎn)物。
18.按照權(quán)利要求
17中所述的方法，其中該P(yáng)HO81基因的轉(zhuǎn)錄用磷酸來調(diào)節(jié)。
19.按照權(quán)利要求
17中陳述的方法，其DNA具有圖9中位置1和SmaⅠ酶切位點(diǎn)之間的堿基順序。
專利摘要
本發(fā)明涉及由調(diào)節(jié)磷酸酶產(chǎn)生的pH081基團(tuán)啟動(dòng)子活性的DNA，這種DNA是從啤酒酵母得到的。應(yīng)用從真核微生物酵母得到的上述新的和有效的啟動(dòng)子，可以有效地生產(chǎn)藥理學(xué)上重要的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/81GK86106291SQ86106291
公開日1987年5月27日 申請日期1986年8月20日
發(fā)明者大泰治 申請人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan