專利名稱:用解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株表達(dá)和分泌異源蛋白質(zhì)的制作方法
本發(fā)明涉及酵母蛋白的分泌技術(shù)，尤其涉及重組解脂亞羅威阿酵母(Yarrowia lipolytica)克隆載體，包括為哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)(例如凝乳酶原)和其他多肽的表達(dá)和分泌的異源DNA編碼;涉及表達(dá)載體，包括解脂亞羅威阿酵母基因啟動(dòng)子(例如XPR2或LEU2)、堿性蛋白酶信號(hào)(或前順序、前區(qū)域、XPR2終止密碼子區(qū)域，以及由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性或使用其它解脂亞羅威阿酵母基因成分產(chǎn)生的變異體及其功能相同者。此外，本發(fā)明還涉及攜帶所述表達(dá)載體和分泌載體的酵母轉(zhuǎn)化株，他們被用于產(chǎn)生天然功能狀態(tài)的異源蛋白質(zhì);以及完成上述的各項(xiàng)方法。
穩(wěn)定而又充分地提供對(duì)工業(yè)(例如凝乳酶原、牛生長(zhǎng)激素)或醫(yī)用(例如尿抑胃激素、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、人體過(guò)敏毒素C5a)有著重要價(jià)值的各種蛋白質(zhì)或多肽，特別是提供可以作為易于獲得的有作用的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的原料，這種經(jīng)濟(jì)上的誘惑力，導(dǎo)致許多發(fā)明者把DNA重組體技術(shù)應(yīng)用于作為生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)“工廠”的微生物。
由于從重組體宿主細(xì)胞的胞內(nèi)積累中特別是從大腸桿菌中重新獲得具有生物活性的外源的或異源的(外來(lái)的)蛋白質(zhì)存在著有可能解決困難的方法，所以進(jìn)一步的研究集中在蛋白質(zhì)的分泌上。在大腸桿菌中，異源蛋白質(zhì)往往是以可折射光的包涵體的狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的。該蛋白質(zhì)通常水溶性很低，而且很少有或者沒(méi)有生物活性。從可折射光的包涵體中提取該蛋白質(zhì)通常包括苛刻的化學(xué)處理，這種處理可能花費(fèi)昂貴而重新獲得所需的天然的有生物活性的蛋白質(zhì)都是微乎其微或者一無(wú)所獲。此外，該蛋白質(zhì)帶有由大腸桿菌產(chǎn)生的不希望要的物質(zhì)，為了釋放可折射光的包涵體，需要破壞細(xì)胞，因而污染的可能性也隨之劇烈增加。除了大腸桿菌外，其它微生物也能產(chǎn)生不溶性胞內(nèi)狀態(tài)的異源蛋白質(zhì)，例如1982年7月28日公布的英國(guó)專利2，091，271號(hào)，公開(kāi)了用DNA重組體技術(shù)表達(dá)牛犢凝乳酶的啤酒酵母(S.cerevisiae)的遺傳修飾，凝乳酶的兩個(gè)英文術(shù)語(yǔ)rennin和Chmosin可以交換使用。鑒于這些困難，從宿主微生物分泌該種蛋白質(zhì)已轉(zhuǎn)向力圖產(chǎn)生具有天然活性構(gòu)型的蛋白質(zhì)。
一種特殊的蛋白質(zhì)，包括異源蛋白質(zhì)或多肽是否可由特定的微生物分泌，看來(lái)似乎決定于蛋白質(zhì)。在大多數(shù)真核細(xì)胞中，有的蛋白質(zhì)合成裝置是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和在初生多肽鏈的氨基端附近的氨基酸順序(稱為“信號(hào)順序”)有關(guān)，該鏈的作用是操縱蛋白穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。接著在提供具有活性的成熟的蛋白質(zhì)的分泌過(guò)程中，用水解蛋白質(zhì)切開(kāi)信號(hào)順序。已經(jīng)做出的某些嘗試，目的是為了包括枯草桿菌、啤酒酵母和培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，用微生物中的信號(hào)順序，發(fā)展分泌異源蛋白質(zhì)的方法。然而所述的這些微生物尚未證明是合乎理想的。
枯草桿菌的固有特性，例如分泌許多蛋白質(zhì)，包括趨于會(huì)分解已被分泌的異源蛋白質(zhì)的許多蛋白酶;已被轉(zhuǎn)化的菌株由于失去異源DNA而造成不穩(wěn)定性也阻礙了它的產(chǎn)生。
從遺傳學(xué)角度已經(jīng)成功地完成了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)和分離異源蛋白質(zhì)，但是，這些系統(tǒng)都有技術(shù)上的要求，并且費(fèi)用很高，要把大多數(shù)蛋白質(zhì)作為產(chǎn)品進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)仍然是不切實(shí)際的。
雖然啤酒酵母作為蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)有其某些固有的局限性，但另一方面，蛋白質(zhì)分泌研究在啤酒酵母上取得的成功都超過(guò)枯草桿菌。1984年10月31日公布的歐州專利申請(qǐng)0123544號(hào)，介紹了啤酒酵母α因子基因的分離，并且將啟動(dòng)子和/或其信號(hào)肽部分與編碼異源蛋白質(zhì)的DNA相結(jié)合，應(yīng)用到酵母的質(zhì)粒上，使酵母細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生成熟的單一蛋白質(zhì)。1983年9月14日公布的歐洲專利申請(qǐng)0088632號(hào)，介紹了表達(dá)和分泌啤酒酵母異源蛋白質(zhì)的方法?？墒瞧【平湍敢赃@些或另一些分泌系統(tǒng)進(jìn)行有效分泌的這些蛋白質(zhì)的大小看來(lái)似乎限于20，000道爾頓左右?？朔【平湍缸鳛榉置谖⑸锏倪@種普遍性的低效率正如Smith等所介紹的，要求多重突變體(Science 229;1219～1224(1985))。對(duì)這種趨向的一個(gè)例外就是研究大于20000道爾頓的曲霉屬(Aspergillus)酶類，看來(lái)這類酶可以用啤酒酵母分泌，但是被其強(qiáng)烈糖基化，這可能影響分泌的效率。
特殊的興趣是對(duì)解脂亞羅威阿酵母，一種用來(lái)產(chǎn)生檸檬酸和單細(xì)胞蛋白質(zhì)的工業(yè)上重要的酵母菌種，也可用于產(chǎn)生赤鮮糖醇、甘露糖醇和異丙基蘋果酸與啤酒酵母相反，解脂亞羅威阿酵母由于能夠有效地把高分子量蛋白質(zhì)(堿性蛋白酶，酸性蛋白酶和核糖核酸酶)分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，由此有可能回收天然狀態(tài)的異源蛋白質(zhì)而無(wú)需破壞產(chǎn)生的細(xì)胞，所以特別令人感到興趣并具有特殊的意義。此外，解脂亞羅威阿酵母還能分泌很少量的幾種蛋白質(zhì)，因而有可能在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生所需要的占優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)種類的異源蛋白質(zhì)，并且簡(jiǎn)化回收所述的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
解脂亞羅威阿酵母產(chǎn)生高水平的胞外蛋白酶，這是由解脂亞羅威阿酵母分泌的占優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)。特殊的蛋白酶(堿性的酸性的或中性的)取決于所用的解脂亞羅威阿酵母菌株(Ogrydziak等，J.Gen.Micro-biol.(1982)128，1225～1234)。堿性胞外蛋白酶的N-末端氨基酸順序的部分順序分析Ogrydziak等人已作了報(bào)導(dǎo)(loc.cit)。
1984年7月25日提交的共同未決定專利申請(qǐng)634，505號(hào)，介紹了通過(guò)突變互補(bǔ)作用轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母和克隆解脂亞羅威阿酵母基因的方法，公開(kāi)了通過(guò)解脂亞羅威阿酵母的XPr2突變的互補(bǔ)作用，克隆被分泌堿性蛋白酶編碼的XPR2基因。該方法包括通過(guò)載體PLD40用BglⅡ部分消化解脂亞羅威阿酵母基因庫(kù)來(lái)轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母的宿主菌株，已在1985年4月24日分布的歐洲專利申請(qǐng)0138508號(hào)即類似于上述已被鑒定的美國(guó)專利申請(qǐng)中作了介紹。
本發(fā)明提供制備載體的方法，這類載體在被引入解脂亞羅威阿酵母宿主時(shí)，使宿主能夠把產(chǎn)生分泌由異源DNA編碼的特殊蛋白質(zhì)于培養(yǎng)基中，這類異源DNA可以來(lái)自任何來(lái)源，但特別是來(lái)自真核生物的DNA和人工合成DNA;提供重組體解脂亞羅威阿酵母克隆載體，包括編碼表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)和其他多肽的異源DNA，其中也有適合解脂亞羅威阿酵母宿主轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒;特別提供整合表達(dá)載體，包括LEU2基因啟動(dòng)子，XPR2基因啟動(dòng)子，堿性蛋白酶早期前區(qū)域和XPR2終止密碼子;表達(dá)具有異源編碼順序的質(zhì)粒，這種密碼順序帶有LEU2啟動(dòng)子的XPR2分泌信號(hào)下游該信號(hào)能表達(dá)和分泌以轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿酵母中的異源蛋白質(zhì)。
本發(fā)明用圖解說(shuō)明成熟異源蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌，特別是從遺傳學(xué)上已經(jīng)改變的解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞培養(yǎng)的凝乳酶原和人體過(guò)敏毒素C5a的表達(dá)和分泌。精確鑒定解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞外堿性蛋白酶氨基酸順序和DNA順序的發(fā)現(xiàn)就有可能確定，異源蛋白質(zhì)可以通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)表達(dá)和分泌，以供細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)。就凝乳酶原而言，可以用成熟的酶原(凝乳酶的前體)來(lái)表達(dá)和分泌。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)解脂亞羅威阿酵母通過(guò)重組DNA技術(shù)可以從遺傳上進(jìn)行改變，使產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株能夠表達(dá)和分泌天然狀態(tài)的異源蛋白質(zhì)。這種改變可通過(guò)構(gòu)建攜帶XPR2基因信號(hào)或信號(hào)和第一順序(prol)或兩個(gè)順序(pro1+pro2)的載體來(lái)完成，XPR2基因是與需要分泌的異源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因順序相連接的。
通過(guò)在DNA載體的XPR2位點(diǎn)上的整合產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株，包括失去調(diào)節(jié)的XPR2基因或不再產(chǎn)生堿性蛋白酶的基因兩端的結(jié)構(gòu)成分的片段，和不僅為異源蛋白質(zhì)的分泌所希望要的而且也能用于篩選假定存在的轉(zhuǎn)化株的特征。
此外，攜帶XPR2啟動(dòng)子和堿性蛋白酶分泌信號(hào)順序的順序的載體能夠在已經(jīng)轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)分泌成熟的異源蛋白質(zhì)。這種類型的有些重組DNA載體能夠?qū)崿F(xiàn)表達(dá)/分泌，而與酵母基因組的整合部位無(wú)關(guān)。一般說(shuō)來(lái)，含有足夠的5′和3′兩側(cè)的DNA的載體能夠表達(dá)與整合部位無(wú)關(guān)的產(chǎn)物。
此外還令人驚奇和出乎意料地發(fā)現(xiàn)，將pBR322衍生質(zhì)粒整合到解脂亞羅威阿酵母染色體DNA提供了能夠進(jìn)一步促進(jìn)目標(biāo)部位整合轉(zhuǎn)化的同系區(qū)，因此pBR322的整合樣板可以作為進(jìn)入轉(zhuǎn)化的DNA的“連接臺(tái)”(“docking platform”)將pBR322的駐留樣板整合到解脂亞羅威阿酵母染色體DNA，盡管pBR322不是天然的解脂亞羅威阿酵母DNA，然而為整合提供了一個(gè)已知的靶。解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化的受體包括這樣一個(gè)部位，它在兩個(gè)主要方面能夠超過(guò)不含這樣部位的受體，即存在一個(gè)具有已知順序和已知限制圖可作為目標(biāo)部位整合的靶區(qū);如果插入的質(zhì)粒含有完整的功能單位或者含有僅與希望得到的基因部分相反的基因，則需要具有用pBR322作為整合靶進(jìn)行測(cè)定的條件。例如，僅含有XPR2基因的一個(gè)3′的片段就能轉(zhuǎn)化XPR2-1002受體，如果它含有野生型密碼子并在XPR2位點(diǎn)上整合的話。然而，如果XPR2-1002宿主被整合到pBR322，同一個(gè)質(zhì)粒也許不能把它轉(zhuǎn)化為蛋白酶完全的表現(xiàn)型，因?yàn)樗鄙偻暾墓δ軉挝弧?br>因此，在解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株中包括一個(gè)與DNA異源載體相一致的同系區(qū)，所述同系區(qū)包括該解脂亞羅威阿酵母整合轉(zhuǎn)化期間作為受體部位的外源DNA。除了pBR322及其衍生物外，還有Cosmids、像M13和入一類的噬菌體、人工合成的衍生DNA和像pUC13一類的普通質(zhì)粒都可用于產(chǎn)生具有“連接臺(tái)”的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株。
“LEU2”啟動(dòng)子順序指的是ATG未被翻譯區(qū)上游，ATG含有表達(dá)所要求的大多數(shù)即使不是全部)的特征。
“XPR2”啟動(dòng)子順序指的是在表達(dá)所需要的信號(hào)順序(或前順序)前面的未被翻譯區(qū)的上游。此外，有或沒(méi)有啟動(dòng)順序的XPR2基因的信號(hào)，在表達(dá)操縱解脂亞羅威阿酵母啟動(dòng)子而不是XPR2基因操縱的條件下，都可用于分泌蛋白質(zhì)。因此，攜帶LEU2啟動(dòng)子和堿性蛋白酶分泌信號(hào)順序的載體，在已經(jīng)轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞中能成功地分離成熟的異源蛋白質(zhì)。
人體過(guò)敏毒素C5a也是一種已知的補(bǔ)體蛋白質(zhì)C5a(人體C5a)，它是體內(nèi)作為補(bǔ)體激活作用的結(jié)果產(chǎn)生的具有生物的多肽片段。它在調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的某些方面起著免疫調(diào)節(jié)劑的作用，其一級(jí)結(jié)構(gòu)和其它過(guò)敏毒素的一級(jí)結(jié)構(gòu)都已清楚。它的生物學(xué)和理化特征在由H.J.Muller-Eberhard和P.A.Miescher合編的《補(bǔ)體》(Complement)一書中，已由Hugli作了概述(紐約Springer出版社出版，1985年73～99頁(yè))。
熟悉本領(lǐng)域的人都會(huì)理解，在本發(fā)明中可以準(zhǔn)用實(shí)際上任何已知的氨基酸順序進(jìn)行異源DNA編碼。這里所公開(kāi)的方法也可以準(zhǔn)用來(lái)產(chǎn)生和分泌任何已知的異源蛋白質(zhì)，其中有代表性的介紹在1985年7月30日公布的美國(guó)專利4，532，207號(hào)中已一一列舉。此外，任何其他解脂亞羅威阿酵母分泌蛋白質(zhì)基因，如核糖核酸酶和酸性蛋白酶這兩種基因可以用來(lái)代替XPR2基因，也可以用來(lái)代替由所述的2個(gè)或更多的基因相連的片段所組成的雜種基因，例如XPR2基因的信號(hào)順序和核糖核酸酶基因的啟動(dòng)子順序。
包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有功能相當(dāng)于這里所述的DNA順序或核苷酸順序的等同物。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性容許由其他的密碼子代替某些密碼子，前者是針對(duì)特定相同的氨基酸，因此產(chǎn)生相同的蛋白質(zhì)。事實(shí)上，由于DNA或核苷酸順序在很大程度上是可以改變的，除了蛋氨酸和色氨酸外，已知的各種氨基酸可以由一個(gè)以上的密碼子進(jìn)行編碼。因此，部分或全部XPR2基因都可以人工合成，給出與圖3的DNA順序具有明顯差別的DNA順序。因此，其編碼的氨基酸順序可以保持。給定的DNA或核苷酸順序這種功能上的更替提供的條件，可以加速用被融合的外來(lái)DNA順序分泌和/或處理被編碼的異源蛋白質(zhì)。因此凡是可用遺傳密碼的XPR2基因和片段的核苷酸順序的所有變化都包括在本發(fā)明內(nèi)。此外，也可能除去一些密碼子或由除了簡(jiǎn)并密碼子外的密碼子取代一個(gè)或更多的密碼子，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上改變的多肽，但與由未改變的DNA分子產(chǎn)生的多肽相比，在實(shí)用性和活性方面基本上是相同的。所述這兩種多肽的功能都是相同的，如同兩種DNA分子產(chǎn)生兩種多肽，盡管所述的兩種DNA分子之間差別與遺傳密碼的簡(jiǎn)并性無(wú)關(guān)。其最簡(jiǎn)單的例子就是凝乳酶原A和凝乳酶原B，凝乳酶原的兩種等位基因的形狀，其區(qū)別僅在于，天冬氨酸殘基是在凝乳酶原A的286位置上，而在凝乳酶原B的那個(gè)位置上都是甘氨酸殘基。
利用這個(gè)方法，通過(guò)用表達(dá)和分泌解脂亞羅威阿酵母XPR2和/或LEU2中的兩種基因的信號(hào)，表達(dá)和分泌哺乳動(dòng)物的異源蛋白質(zhì)凝乳酶原和人體過(guò)敏毒素C5a已經(jīng)在解脂亞羅威阿酵母中取得成功。凝乳酶原和人體過(guò)敏毒素C5a的DNA順序通過(guò)合成寡核苷酸與在假設(shè)的部位上的XPR2基因順序相連接，以此為堿性蛋白酶信號(hào)肽或蛋白酶前體加工部位進(jìn)行編碼(此處稱為pro1和pro2)，并用來(lái)產(chǎn)生基因結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)整合轉(zhuǎn)化將基因結(jié)構(gòu)插入解脂亞羅威阿酵母。重組體培養(yǎng)物被表達(dá)并被輸出到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的具有凝乳酶原和人體過(guò)敏毒素C5a的分子量和免疫反應(yīng)活性的異源蛋白質(zhì)。如此產(chǎn)生的凝乳酶原可以認(rèn)為是包含在天然的構(gòu)型中，由于緊接著除去前肽，它具有完全的酶的活性。
此處所用的“重組體DNA材料”一語(yǔ)包括含有至少下列材料之一的任何材料解脂亞羅威阿酵母的XPR2基因、信號(hào)(或前信號(hào))、por1-和pro2-(共有一個(gè)啟動(dòng)區(qū))，啟動(dòng)子或其終止順序LEU2啟動(dòng)子;以及由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，功能盡管可能與上述順序相同的順序。所述重組體DNA材料中具有代表性的材料為DNA片段、質(zhì)?；蜉d體，或含有上述順序中任一個(gè)或者全部順序的轉(zhuǎn)化株。
材料New England Biolabs供給的限制性核酸內(nèi)切酶和T4連接酶，Beth esda Research Laboratories供給的細(xì)菌堿性磷酸酶，PL-Biochemi-cals供給的T4多核苷酸激酶，和New England Nuclear供給的〔r-P〕三磷酸腺苷。所有的酶都是在提供者所推薦的條件下使用的。
培養(yǎng)基GPP培養(yǎng)基-(甘油/
-蛋白胨培養(yǎng)基)，(每升)含有6.7克甘油，1.6克Difco
-蛋白胨，1.7克不含氨基酸和硫酸銨的Difco酵母含氮堿基化合物，30毫克尿嘧啶，和0.5毫升/升克分子量為2000(Polysciences)的聚丙二醇溶于40毫克分子濃度的磷酸緩沖液(pH6.8)。(聚丙二醇在作生長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)省略不用，在進(jìn)行凝乳酶分析時(shí)使用)。在磷酸緩沖液中，
-蛋白胨單獨(dú)進(jìn)行高壓滅菌。YEPD(酵母提取物/蛋白胨/右旋糖)培養(yǎng)基，(每升)含有5克酵母提取物，10克蛋白胨和20克右旋糖。
大腸桿菌生長(zhǎng)在37℃的LB培養(yǎng)基中。LB培養(yǎng)基(每升)含有10克細(xì)菌胰蛋白酶水解產(chǎn)生的胨(Bactotryptone)，10克細(xì)菌酵母提取物，10克氯化鈉;用氫氧化鈉將pH調(diào)至7.5。
DNA順序分析這里所描述的各種質(zhì)粒的DNA片段都是在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離并用Maxam等人的方法(Methods in Enzymology，65，499(1980)排列順序。
連接方法DNA片段，包括被切割的載體質(zhì)粒，都是用T4DNA連接酶通過(guò)混合所需要的組分進(jìn)行連接(帶有適合構(gòu)建末端的DNA片段以提供正確的配對(duì))。將微克量的載體和插入片段需加約10單位的連接酶。最后得到連接反應(yīng)被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12菌珠MM294(ATCC-33625)或HB101(ATCC-33694)的反應(yīng)潛能細(xì)胞中。
化學(xué)合成DNA的制備為構(gòu)建用于表達(dá)和分泌凝乳酶的雜種基因，用改進(jìn)的Phosphoramidite方法(Sinha等，Tetrahedron Letters24，5843(1983)ona Genetic Design 6500(Watertown，WA)和DNA自動(dòng)合成器合成8個(gè)寡核苷酸，并且從6M尿素-20%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行純化。將互補(bǔ)寡核苷酸的整分部分在4℃條件下互相混合和退火，在TE(10個(gè)毫克分子濃度的三羥甲基氨基甲烷緩沖劑一鹽酸，pH8.0，1毫克分子濃度的NaEDTA)中過(guò)夜。雙股寡核苷核的整分部分(約2微克)在37℃條件下用T4多核苷酸激酶在反應(yīng)混合物中進(jìn)行磷酸化，該反應(yīng)混合物含有70毫克分子濃度的三羥甲基氨基甲烷緩沖劑(pH7.6)，10毫克分子濃度氯化鎂，5毫克分子濃度二硫蘇糖醇，5毫克分子濃度三磷酸腺苷。
DNA質(zhì)粒制備DNA質(zhì)粒的大量制備采用Holmes等人的方法(Anal Biochem.，114，195～197(1981))，然后用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓-氯化銫浮力密度梯度離心。質(zhì)粒DNA的小量制備采用Birnboim等人的堿性SDS方法(NAR1，1513(1979))。
凝乳酶原的表達(dá)載體和分泌載體的構(gòu)建進(jìn)行一系列不同的構(gòu)建是為了獲得末端表達(dá)載體。所有各個(gè)步驟都在附圖中予以說(shuō)明。一般說(shuō)來(lái)，DNA片段是用凝膠電泳分離并與另一些片段連接，或者切割DNA質(zhì)粒，溶于4℃的20微升50毫克分子濃度的三羥甲基氨基甲烷緩沖劑一鹽酸(pH7.5).10毫克分子濃度氯化鎂，20毫克分子濃度二硫蘇糖醇，1毫克分子濃度三磷酸腺苷，和200單位的T4連接酶。如果需要用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行DNA的部分消化，則需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳的切割時(shí)間。
培養(yǎng)液中凝乳酶原的鑒定含有表達(dá)載體的酵母轉(zhuǎn)化株在GPP培養(yǎng)基(配方同上)中生長(zhǎng)過(guò)夜。離心后去除酵母細(xì)胞，將1毫升的50%TCA加到5毫升為一個(gè)整分部分的培養(yǎng)液，在4℃條件下保持60分鐘。用離心得到小片，再用2毫升冷凍丙酮洗兩次。將沉淀的蛋白質(zhì)溶于100微升的SDS樣品緩沖液，整分部分在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳(Laemmli，U.K.，(1970)Nature227，680)。凝膠溶解蛋白質(zhì)通過(guò)電泳轉(zhuǎn)化為硝化纖維(Schleicher和Schuell，0.22微米)，用膠塊凝膠免疫斑漬(immuno-blot)分析法(Hawkes，R.等，(1982)Anal.Bioo-hem.119，142)進(jìn)行鑒別。濾紙涂上家兔抗凝乳酶原抗體，然后用結(jié)合山羊抗兔免疫球蛋白G抗體的過(guò)氧化酶保溫(Cappel，Malvern，Pa)。結(jié)合抗體用4-氯-1-萘酚和過(guò)氧化氫染色測(cè)定。
培養(yǎng)液中凝乳酶原的凝乳活性各種解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)液按照Ernstrom的改進(jìn)方法(J.Dairy Sci.41，1664(1958))測(cè)定凝乳活性。簡(jiǎn)言之，測(cè)定包括測(cè)量凝乳酶活化培養(yǎng)液的上清液凝結(jié)緩沖過(guò)的脫脂乳所需的時(shí)間長(zhǎng)度以及有關(guān)純化凝乳酶標(biāo)準(zhǔn)的這些數(shù)值。酵母培養(yǎng)物(25毫升)在GPP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。離心后去除細(xì)胞，將5毫升培養(yǎng)上清液的整分部分在真空條件下冷凍干燥。把每份經(jīng)冷凍干燥的上清液再懸浮于300微升蒸餾水中。還要制備一組純化的牛犢凝乳酶原稀釋液作為對(duì)照參考標(biāo)準(zhǔn)。在適中濃縮和控制條件下的凝乳酶原的活化是通過(guò)加入大約5～10微升的濃鹽酸，使pH值達(dá)到大約2左右，在22℃下保溫1小時(shí)。脫脂乳的制備是將60克干燥的脫脂奶粉(DifCo)加到500毫升的41.5毫克分子濃度醋酸鈉(pH6.3)和13.6毫克分子濃度氯化鈣中，在4℃條件下攪拌20分鐘。制備后即將底物進(jìn)行測(cè)定。將每個(gè)制備的酶以60微升為一等分(相等于1毫升的培養(yǎng)上清液)在37℃條件下，加到1毫升等分的脫脂乳中，記錄凝結(jié)時(shí)間。
用于C5a基因的合成寡核苷酸的制備用于C5a結(jié)構(gòu)基因合成的寡脫氧核苷酸的化學(xué)制備是采用改進(jìn)的Phosphoramidite方法(Sinha等，loc.cit)和在一個(gè)DNA自動(dòng)合成器的遺傳裝置6500(Watertown，MA)上的可控制多孔玻璃載體。用3%(重量/體積)二氯乙酸的二氯甲烷溶液進(jìn)行脫三苯甲基作用，用飽和四唑的乙腈溶液加以Phosphoramidites線性激活，以di-ethoxyphosphine tetrazolide封端，用含水碘/四氫葉酸氧化(Matteucci等，1981，J.Amer.Chem.Soc.105，3183)。每個(gè)加成周期的總的時(shí)間是14分鐘。得到圖9中的10個(gè)47-聚體A-J片段，每個(gè)步驟的平均得率為98.8%(用三苯甲基分析)，用Matteucci等人(loc.cit.)的方法解封，從0.3克分子濃度的醋酸鈉中折出乙醇并在退火前先在10%聚丙烯酰胺-尿素變性凝膠上用預(yù)制的凝膠電泳進(jìn)行分離。
人體C5a基因的測(cè)定、克隆和順序排列圖9表示期望得到的蛋白質(zhì)的氨基酸順序和編碼人體C5a蛋白質(zhì)基因所需的人工合成寡核苷酸的排列。除A和F外的所有低聚物，都是在他們的5′末端用T4多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化?；虻臏y(cè)定包括退火和連接兩個(gè)主要反應(yīng)，兩個(gè)反應(yīng)含有低聚物A、B、I和J，以及低聚物C、D、E、F、G和H。最終得到的94堿基對(duì)和141堿基對(duì)雙股DNA片段都是在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳后進(jìn)行分離，相互共同連接，他們的235堿基對(duì)產(chǎn)物用凝膠電泳分離。含有編碼C5a結(jié)構(gòu)基因的235堿基對(duì)DNA片段插在pBR322DNA載體的EcoRⅠ和HindⅢ兩個(gè)部位之間并轉(zhuǎn)化為大腸桿菌K-12菌珠HB101的反應(yīng)潛能細(xì)胞。從6個(gè)轉(zhuǎn)化株分離得到的DNA質(zhì)粒的有限性分析表明6個(gè)克隆中有5個(gè)含有大小合適的EcoRⅠ/HindⅢ片段。這些質(zhì)粒中每個(gè)質(zhì)粒的C5a基因區(qū)的核苷酸順序都用Maxam等人的方法(Methods Enzymol.65，499(1980))測(cè)定。
用于大腸桿菌的C5a表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)件和特性鑒定DNA片段分離的方法和連接反應(yīng)的條件采用1982年Maniatis等發(fā)展的方法(Molecular/CloningA Laboratory Manual，CoLd Spring Harbor)。大腸桿菌trp啟動(dòng)子-操縱基因，開(kāi)始是從ptrpL1得到的(Edman等，(1981)Nature291，503)含有用于C5a表達(dá)質(zhì)粒(pC5a-48)的trp啟動(dòng)子-操縱基因順序的360堿基對(duì)EcoRI片段是由凝乳酶原表達(dá)質(zhì)粒pPFZ-R2中分離得到的，關(guān)于這一點(diǎn)在1985年7月3日分布的歐洲專利申請(qǐng)0147178號(hào)中已作了介紹。
解脂亞羅威阿酵母培養(yǎng)液中C5a的鑒定除了山羊抗C5a和家兔抗山羊免疫球蛋白G(Cappel)用于免疫斑點(diǎn)外，采用如上介紹的鑒定凝乳酶原方法。山羊抗人體C5a抗體的制備采用Manderino等人的方法(J.Immunol.Methods53，41-50(1982))。
載體pLD40，已在1985年4月24日公布的歐洲專利申請(qǐng)0138508號(hào)中作了介紹。
微生物名稱ATCC 20774 解脂亞羅威阿酵母 PC30869ATCC 20781 解脂亞羅威阿酵母 DL112-PC-30869，帶XPR2的轉(zhuǎn)化株//ATCC 20776 解脂亞羅威阿酵母 DL-148。
解脂亞羅威阿酵母 ATCC20688的轉(zhuǎn)化株，帶由SnaBⅠ消化的pLS-3ATCC 20775 解脂亞羅威阿酵母 DL-144解脂亞羅威阿酵母 ATCC 20688的轉(zhuǎn)化株，帶未切割的pLS-3ATCC 20777 解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株帶由SnaBI切割的pC5aX-3ATCC 20778 解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶由SnaBI的pXX-11ATCC 20779 解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶由SnaBI切割的pXX-22ATCC 20780 解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶由
SnaBI切割的pXX-33ATCC 20794 解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶pLD56ATCC 20795 解脂亞羅威阿酵母ATCC 20794的轉(zhuǎn)化株，帶由NruI切割的pLX-34上述載體根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)定的規(guī)定都保藏在美國(guó)馬里蘭州洛克維爾美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，這是一個(gè)公認(rèn)的承擔(dān)永久性保存樣品的保藏機(jī)構(gòu)。如果本申請(qǐng)被授予專利，該中心將隨時(shí)準(zhǔn)備接待公眾。在本申請(qǐng)未決期間，這些樣品可以提供給美國(guó)專利和商標(biāo)局授權(quán)去那里的官員進(jìn)行測(cè)定，項(xiàng)目編號(hào)為37CFR1.14和35USC122;根據(jù)外國(guó)專利法，在向這些國(guó)家提交過(guò)本申請(qǐng)副本或其成果的，也可以使用這些樣品。由于授于了專利，對(duì)于公眾利用所保藏的微生物的全部限制措施將不可避免地予以撤消。
解脂亞羅威阿酵母ATCC20774(Pfizer公司培養(yǎng)物保藏所鑒定編號(hào)為PC30869)的分類學(xué)研究是由J.R.DeZeeuw博士負(fù)責(zé)的，他提供了下述說(shuō)明。所用的方法是由J.L.Eodder在《酵母菌》(第二版)(N.HollandPublishingCo，Amsterdam，1970)一書中推薦的那些方法。
CBS599是解脂假絲酵母(Candida lipolytica)典型培養(yǎng)菌(《酵母菌》)，第二版，N.HollandPublishingCo.，Amstedam，1970)，CBS6124在《酵母菌》(第三版)一書中是解脂復(fù)膜孢子酵母(Sacchaomcop-sislypolytica)的典型培養(yǎng)菌，對(duì)兩者進(jìn)行了比較。較早還可參考解脂抑內(nèi)孢毒(Endomycopsislypolytica)。其完整的狀態(tài)是解脂假絲酵母。確定這個(gè)種在分類學(xué)上的位置的是van der walt和vonArx，Antonie van Leeuwenhoek，46，517～521(1980)。現(xiàn)時(shí)較佳的名稱為解脂亞羅威阿酵母。
菌株P(guān)C-30869的培養(yǎng)，形態(tài)和生理特征與由Kreger-van Rij編號(hào)的《酵母菌》(第三版，第406～408頁(yè)，Elsevier Science Publi-shersB.V.，Amsterdam，1984)一書中所列的解脂復(fù)膜孢子酵母的規(guī)范介紹是一致的。
表1解脂亞羅威阿酵母菌珠的比較Pfizer公司 資料來(lái)源 基因型登記號(hào)PC-30265 NRRL YB-423(即CBS 6124)， 野生型，二倍體《酵母菌》(第三版)中的典型培養(yǎng)菌PC-30286 CBS 599，《酵母菌》 MATA野生型，單倍(第二版)中的典型 體，培養(yǎng)菌PC-30869 參閱下面的介紹 MATB bio-6，leu2-40，xpr2-1002PC-30869是由遺傳上適于重組的解脂亞羅威阿酵母PC-22208的突變體構(gòu)建的，解脂亞羅威阿酵母PC-22208是由Pfizer公司從土壤中分離的解脂亞羅威阿酵母PC-30026則是NRRL Y-1094的次代培養(yǎng)菌。PC-30869在表型上與其野生型親代的差異在于①不產(chǎn)生具有活性的胞外堿性蛋白酶;②生長(zhǎng)所需的生物素;和③要求L-亮氨酸作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。
PC-30869在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YEPD)培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期間，芽細(xì)胞呈卵圓形，平均大小為2.6×5.5微米。在YEPD瓊脂上，真假菌絲體都突起，有胚泡孢子，兩側(cè)大多數(shù)為單個(gè)的。沒(méi)有明顯的類胡蘿卜素色素。該培養(yǎng)菌是作為“B”交配型單倍體與測(cè)定微生物種的有權(quán)堿性的測(cè)交品系進(jìn)行雜交(表5)。典型的子囊孢子的形成是V8瓊脂上進(jìn)行觀察的。碳同化的模式見(jiàn)附表2。沒(méi)有進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。銨離子和尿素(無(wú)硝酸鹽)是可以被利用的唯一氮源(表3)。菌珠PC-30869要求維生素B1和D-生物素(表4)。只有維生素B1是該培養(yǎng)菌的野生型親本所需要的。在37℃條件下未看到生長(zhǎng)。
表2碳同化作用＊碳源 參考表列介紹＊＊ 培養(yǎng)菌30265 30286 308691.L阿拉伯糖 - - - -1.纖維素二糖 - - - -3.赤鮮醇 + +++ +++ +++4.D半乳糖 - - - -5.D葡萄糖 + +++ +++ +++6.肌醇 - - - -7.乳糖 - - - -8.麥芽糖 - - - -9.D甘露糖醇 + +++ +++ +++10.棉子糖 - - - -11.核糖醇 - - - -12.D核糖 -(+) - - ++13.L鼠李糖 - - - -14.可溶性淀粉 - - - -15.蔗糖 - - - -16.海藻糖 - - - -17.D木糖 - - - -18.琥珀酸 + +++ +++ +++19.檸檬酸 + +++ +++ +++＊基礎(chǔ)培養(yǎng)基是細(xì)菌酵母氮基質(zhì)補(bǔ)加10微克/升的D生物素和149毫克/升的L亮氨酸乙酯.鹽酸，以提供100毫克/升的L亮氨酸。
＊＊Kreger-vanRij.(loc.cit.)。
表3氮同化作用＊氮源 參考列表介紹＊＊ 培養(yǎng)菌30265 30286 308691.(NH4)2SO4+ +++ +++ +++2.KNO3- - - -3.尿素 + +++ +++ +++＊基礎(chǔ)培養(yǎng)基是細(xì)菌酵母、碳基質(zhì)補(bǔ)加116毫克/升的酮異己酸鈉，以提供對(duì)應(yīng)的100毫克/升的L亮氨酸，再補(bǔ)加10微克/升的D生物素。
＊＊Kreger-vanRij.(Loc.cit.)。
表4需要的維生素＊補(bǔ)加內(nèi)容＊＊＊ 參考結(jié)論＊＊ 培養(yǎng)菌30265 30286 308691.缺 - 極微 極微 -2.維生素Bl.Hcl + +++ +++ -3.Ds生物素 - 極微 極微 極微4.維生素Bl + +++ +++ ++++生物素＊基礎(chǔ)培養(yǎng)基是無(wú)細(xì)菌維生素、酵母、基質(zhì)加149毫克/升的L亮氨酸乙酯、鹽酸，以提供100毫克/升的L亮氨酸。
＊＊Kreger van Rij.(loc.cit.)。
＊＊＊如所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基再補(bǔ)加200微克/升維生素Bl，Hcl和/或10微克/升的D生物素。
表5子囊孢子的形成測(cè)交品系 交配培養(yǎng)菌
30265 30286 30869缺號(hào)自交配培養(yǎng)菌) ++ - -30264(A交配型) ++ - +++30267(B交配型) ++ +++ -①培養(yǎng)菌30264和30267是由L.J.WICKERHAM博士特意提供的異性交配型單倍體菌株，已在Science(167，141(1970))上作了正式介紹。
②30264是Wickerham的解脂亞羅威阿酵母YB-421③30267是Wickerham的解脂亞羅威阿酵母YB-423-12表6其他特征參考數(shù)據(jù)＊ 培養(yǎng)菌30265 30286 30869細(xì)胞形狀 卵圓形 卵圓形 卵圓形 卵圓形細(xì)胞的平均體積(微米)(2～4.5)×(4～22) 3.3×9.1 3.0×8.2 2.6×5.5營(yíng)養(yǎng)繁殖 芽殖 芽殖 芽殖 芽殖發(fā)酵 缺 缺 缺 缺37℃時(shí)生長(zhǎng) 不長(zhǎng) 不長(zhǎng) 不長(zhǎng) 不長(zhǎng)菌落生長(zhǎng) 三個(gè)培養(yǎng)菌生長(zhǎng)相似并與文獻(xiàn)介紹一致。真假菌絲體都突起，有胚孢子，兩側(cè)大多數(shù)是單個(gè)的。沒(méi)有明顯的類胡蘿卜素色素。
＊Kreger van Rij.(loc.cit.)。
PC-30689不同于專利文獻(xiàn)所介紹的解脂亞羅威阿酵母的其他品系，而與他們的表型相比則是明顯的(表7和8)。
ATCC20228(Nubel等，美國(guó)專利4，155，811)的特征在于具有像這個(gè)種的典型品系CBS599和CBS6124的野生型營(yíng)養(yǎng)。尤其是它不需要尿嘧啶、亮氨酸或?yàn)樯L(zhǎng)用的生物素，以及使明膠液化。
ATCC 20628(Dezeeuw)等，美國(guó)專利4，407，953)不像ATCC20228需要補(bǔ)加生長(zhǎng)用的亮氨酸。像ATCC20228一樣，它也不需要尿嘧啶或生物素。它也液化明膠。
ATCC20688(歐洲專利申請(qǐng)0138508)即使培養(yǎng)基中補(bǔ)加了尿嘧啶和亮氨酸，也只是僅僅能夠生長(zhǎng)。這種對(duì)尿嘧啶的需要就使ATCC20688跟ATCC20228和ATCC20628得以區(qū)別。ATCC20688不需要生物素，而能使明膠液化。
培養(yǎng)菌PC-30689不同于上述所有菌株，它需要生物素和亮氨酸，但不需要生長(zhǎng)用的尿嘧啶，它也不能使明膠液化。
表7營(yíng)養(yǎng)要求(略去所列培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物)培養(yǎng)菌 缺 亮氨酸 尿嘧啶 生物素CBS599 +++ +++ +++ +++CBS6124 +++ +++ +++ +++ATCC20228 +++ +++ +++ +++ATCC20628 +++ - +++ +++ATCC20688 +++ - - +++PC-30869 +++ - +++ -完全的培養(yǎng)基含有16.7克/升的無(wú)細(xì)菌維生素、酵母基質(zhì)加100毫克/升的尿嘧啶、100毫克/升的L亮氨酸、10微克/升的D生物素，和200微克/升的維生素Bl.鹽酸。
表8對(duì)明膠的液化作用培養(yǎng)菌 液化作用CBS599 +CBS6124 +ATCC20228 +ATCC20628 +
ATCC20688 +PC-30869 -培養(yǎng)基含有120克/升的明膠、16.7克/升的無(wú)細(xì)菌維生素、酵母基質(zhì)加100毫克/升的尿嘧啶、100毫克/升的L亮氨酸、10微克/升的D生物素和200微克/升的維生素Bl.鹽酸。
附圖簡(jiǎn)介圖1由解脂亞羅威阿酵母菌株DL112分離得到的重疊質(zhì)粒pLD57、pLD58和pLD62的部分線性限制圖＊。
圖2為XPR2基因合成的寡核苷酸探針。從已經(jīng)公布的成熟蛋白酶的前25個(gè)氨基酸殘基中大多數(shù)殘基的順序(Ogsydziak等，loc.cit)，標(biāo)有Ⅰ和Ⅱ的兩個(gè)區(qū)為構(gòu)建帶32倍或很少產(chǎn)生簡(jiǎn)并的14-聚體寡核苷酸試樣提供了可能性。兩個(gè)區(qū)分別開(kāi)始在氨基酸7和18的位置上。為每個(gè)區(qū)制備了4個(gè)不同的8倍的簡(jiǎn)并混合探針并分配給圖中所示的170～186之間。在所示核苷酸中，“X”表示4個(gè)堿基，U表示2個(gè)嘌呤，Y表示2個(gè)嘧啶。
圖3XPR2基因的核苷酸順序啟動(dòng)子，pre(-157～-136)，pro1(-135～-98)，pro2(-97～-1)，堿性細(xì)胞外蛋白酶和終止密碼子順序。
圖4構(gòu)建終止密碼子載體pterm4的順序。
圖5構(gòu)建質(zhì)粒pLS-3的順序和限制性圖。
圖6構(gòu)建質(zhì)粒PXX-33的順序和限制性圖。
圖7構(gòu)建質(zhì)粒PXX-22的順序和限制性圖。
圖8構(gòu)建質(zhì)粒PXX-11的順序和限制性圖。
圖9人體過(guò)敏毒素C5a氨基酸順序。
圖10質(zhì)粒pC5a-48的限制性圖。
圖11構(gòu)建質(zhì)粒pC5aX-3的順序和限制性圖。
圖12a-圖12cLEU2基因的核苷酸順序。
圖13構(gòu)建質(zhì)粒pLX-34的順序和限制圖。
XPR2基因的順序分析無(wú)性系XPR2基因的DNA順序分析是用化學(xué)降解法(Maxam等，1980，methods Enzymol.65，499)在由質(zhì)粒pLD57、pLD58，pLD62(圖1)和pLD84、pLD86(參閱下面所述)制備的重疊限制性片段上完成的。結(jié)果表明無(wú)性系酵母基因組的DNA實(shí)際上含有胞外堿性蛋白酶的基因。XPR2基因的核苷酸順序和帶有由核苷順序得到的信號(hào)順序的堿性蛋白酶前體的氨基酸順序在圖3中給出。大部分胞外蛋白酶的氨基酸順序過(guò)去都是未知的(OGRYDZIAK等，loc.cit.)這里是第一次提出。此外，需要表達(dá)和分泌的胞外蛋白酶的順序這里也是第一次予以介紹。編碼堿性蛋白酶、它的前體和信號(hào)順序的DNA順序由1362堿基對(duì)組成(圖3)。這些多肽鏈的初級(jí)結(jié)構(gòu)是由核苷酸順序推斷得到的，共有454個(gè)氨基酸殘基。堿性蛋白酶是以前體的形狀在細(xì)胞內(nèi)合成的，這種前體形狀經(jīng)過(guò)蛋白水解形成被分泌的狀態(tài)或成熟狀態(tài)。分析由核苷酸順序推斷得到的氨基末端氨基酸順序表明假定的信號(hào)肽存在于前體分子中。所述信號(hào)肽含有22個(gè)氨基酸殘基，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)類似于較高級(jí)的真核生物和原核生物信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)(Perlman等，1983，J.Mol.Biol.167，391)。通常與已知的25個(gè)成熟堿性蛋白酶(Ogrydziak等，1982，J.Gen.Microbiol.128，1225)的氨基末端氨基酸相一致的預(yù)示氨基酸順序中的一個(gè)區(qū)之前是含有信號(hào)肽和2個(gè)胰蛋白酸型的切割部位(LYS-Arg)的157個(gè)氨基酸殘基。所述切割部位是把pro區(qū)分為pro1(-135～-98)和pro2(-97～-1)。參見(jiàn)圖3。成熟堿性蛋白酶有由核苷酸相似推斷出的297個(gè)氨基酸。預(yù)示來(lái)自核苷酸順序的各種蛋白酶形狀的氨基酸順序是與純化的酶的形狀的大小排列次序一致的。除了堿性蛋白酶前體結(jié)構(gòu)順序外，還測(cè)定了5′端順序片段大約700堿基對(duì)和3′端順序的600堿基對(duì)。這些區(qū)的分析，說(shuō)明他們含有類似于其他真核生物的啟動(dòng)子和終止密碼子的順序，而且對(duì)堿性蛋白酶的表達(dá)來(lái)說(shuō)多半是不可缺少的。
如上所述，通過(guò)突變的互補(bǔ)作用，轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母和克隆解脂亞羅威阿酵母基因，包括通過(guò)XPr2突變的互補(bǔ)作用克隆到分泌堿性蛋白酶編碼的XPR2基因，已在歐洲專利0138508中作了報(bào)導(dǎo)。該報(bào)導(dǎo)中所述方法包括通過(guò)載體pLD40用解脂亞羅威阿酵母基因庫(kù)的BglⅡ的部分消化轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母宿主菌株，所述載體的特征是它聚藏著含有解脂亞羅威阿酵母的LEU2區(qū)分的很小片段和3EcoRⅠ、4EcoRV、6AvaⅠ、1BglⅡ、1NcoⅠ、1ApaⅠ、2XhoⅠ和1BstXⅠ核酸內(nèi)切酶的限制性部位。解脂亞羅威阿酵母XPR2轉(zhuǎn)化株中的一個(gè)轉(zhuǎn)化株用來(lái)回收解脂亞羅威阿酵母NRRLY-1049中的野生型基因(pLD84和pLD86)，解脂亞羅威阿酵母NRRLY-1094如實(shí)施例-所述的供表達(dá)/分泌載體構(gòu)建時(shí)用。
LEU2基因的順序分析pLD25(歐洲專利0138508)中無(wú)性繁殖LEU2基因的DNA順序分析是在重疊限制性片段上用化學(xué)降解法(Maxam等，1980，Methods Enzymol.65，499)測(cè)定的。為了確定β-異丙基蘋果酸(ⅠPM)脫氫酶密碼區(qū)和正確的譯讀碼，利用預(yù)示氨基酸順序?yàn)槠【平湍傅腖EU2基因進(jìn)行預(yù)先測(cè)定(Andreadis等，1984，J.Biol.Chem.259，8059)。鑒別解脂亞羅威阿酵母基因組順序區(qū)，該基因組順序編碼同源于啤酒酵母蛋白質(zhì)順序區(qū)的氨基酸順序。2.8仟堿基LEU2基因的核苷酸順序和由該核苷酸順序推斷得到的β-ⅠPM脫氫酶氨基酸順序在圖12中給出。此外，需要表達(dá)解脂亞羅威阿酵母β-ⅠPM脫氫酶的順序這里是第一次予以介紹。編碼這405個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)的DNA順序是由1215堿基對(duì)組成的(圖12)。除了β-ⅠPM脫氫酶密碼順序外，大約測(cè)定了5′端順序的798堿基對(duì)和3′端順序的797堿基對(duì)(包括TAA轉(zhuǎn)譯終止密碼子)。這些區(qū)的分析表明他們所包括的順序類似于其他真核生物的啟動(dòng)子和終止密碼子，而且是表達(dá)時(shí)必不可少的。
解脂亞羅威阿酵母LEU2基因的5′上游區(qū)在轉(zhuǎn)譯開(kāi)始前含有TATATATA順序78堿基對(duì)和在mRNA準(zhǔn)備開(kāi)始前的30堿基對(duì)。對(duì)于真核生物中轉(zhuǎn)錄開(kāi)始具有重要意義的第2順序是CAAT部分，在LEU2基因中，這部分在假定的轉(zhuǎn)錄開(kāi)始部位前確定為74堿基對(duì)，假定的轉(zhuǎn)錄開(kāi)始部位自ATG為-48堿基對(duì)(圖12)。
Zaret等(Cell 28，563(1982)認(rèn)為在啤酒酵母中作為重要的轉(zhuǎn)錄終止是，3′下游區(qū)在對(duì)應(yīng)于5′-TAG…TA(T)GT…TTT-3′順序的終止密碼子后面，在72至120核苷酸上有一個(gè)順序。
實(shí)施例一所用宿主菌種是ATCC 20774(MATB leu2-40 bio-6 Xpr 2-1002)。XPR2轉(zhuǎn)化株-解脂亞羅威阿酵母ATCC 0781是在脫脂乳指示平板上形成區(qū)帶的一個(gè)菌落，然后從缺亮氨酸平板上進(jìn)行平板影印培養(yǎng)。用歐洲專利申請(qǐng)0138508中的方法從轉(zhuǎn)化株中制備染色體DNA并用來(lái)回收被分泌的蛋白酶的基因。染色體DNA用BglⅡ酶進(jìn)行部分消化，并把含有大腸桿菌復(fù)制子和來(lái)自載體的抗氨芐菁霉素基因的片段連接成圓形，用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌。染色體DNA也用SalⅠ酸酶消化并用于指示轉(zhuǎn)化株正常LEU2區(qū)未曾受到干擾的南部1實(shí)驗(yàn)中。(520堿基對(duì)SalⅠ對(duì)著LEU2區(qū)的EcoRⅠ片段正好是5′對(duì)著pLD40中所含LEU2片段被用作探針)。為此，由于把質(zhì)粒庫(kù)整合到解脂亞羅威阿酵母必須是同源的，所以XPR2區(qū)必須是整合部位。三個(gè)重疊但不同的質(zhì)粒pLD57、pLD58和plD62開(kāi)始是從解脂亞羅威阿酵母ATCC 20781回收的。他們?cè)趫D1中給出。把據(jù)成熟的被分泌的蛋白酶蛋白(圖2和3)的前25個(gè)氨基酸殘基的已知順序，與用于XPR2基因的人工合成寡核苷酸探針雜交表明被分泌的蛋白酶的基因已被無(wú)性繁殖。為了測(cè)定無(wú)論是代表野生型樣板的回收的基因還是突變樣板，用PLD58轉(zhuǎn)化感受體解脂亞羅威阿酵母菌株。由于沒(méi)有從任何依賴于亮氨酸的轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生蛋白酶陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株，所以結(jié)論是pLD58含有該基因的突變等位基因。
存在于野生型菌株NRRL Y-1094中的XPR2基因的形狀是通過(guò)大腸桿菌菌落的雜交試驗(yàn)得到的。探針用的是2仟堿基PVUⅠ對(duì)應(yīng)于由含有完整構(gòu)基因的數(shù)據(jù)的排列順序所預(yù)示的EcoRⅠ片段。正如歐洲專利申請(qǐng)0138508所介紹的，從pLD40中NRRL Y-1094 DNA的Sau 3A部分消化的片段的原始庫(kù)中，獲得與本探針雜交的一些菌落。其中兩個(gè)菌落含有非常相似于被pLD84和pLD86消化過(guò)的質(zhì)粒，他們被用來(lái)提高表達(dá)載體。兩種質(zhì)粒含有相同的XPR2密碼子的5′末端和Sau3A部位(被結(jié)合重新產(chǎn)生載體的BamHⅠ部位)，圖3中的順序就是從此開(kāi)始的。每個(gè)都含有蛋白酶的全部結(jié)構(gòu)基因和假定的轉(zhuǎn)錄終止密碼子，并且包括來(lái)自NRRL Y-1094菌株的XPR2密碼子大約4至5仟堿基的整個(gè)插入物。在pLD86中的插入物含有3′端以外的幾百堿基對(duì)。由于為了構(gòu)建表達(dá)載體，我們用的3′擴(kuò)展到BglⅡ部位(堿基對(duì)2655)，所以兩個(gè)質(zhì)粒供應(yīng)了相同的DNA，其作用是與圖3的順序相等的。
表達(dá)載體和分泌載體的構(gòu)建為了實(shí)現(xiàn)表達(dá)和分泌解脂亞羅威阿酵母中的凝乳酶原而設(shè)計(jì)的一個(gè)計(jì)劃采用在整合無(wú)性繁殖載體中各種雜交基因的構(gòu)建。這樣一個(gè)途徑創(chuàng)造出參與DNA共同順序的廣泛密碼子段的質(zhì)粒。事實(shí)上，模式結(jié)構(gòu)圖是用于把帶有插入3′的凝乳酶原基因的載體集中到預(yù)示XPR2信號(hào)肽處理部位(假定的pro1-處理部位)和已知能產(chǎn)生成熟堿性蛋白酶的切斷部位。一般說(shuō)來(lái)對(duì)異源基因而言，理想的是插在酵母啟動(dòng)子和表達(dá)的終止順序之間。考慮到雜交基因順序的氨基末端順序部分隨著不同的質(zhì)粒構(gòu)建而變化，但是凝乳酶原結(jié)構(gòu)基因順序、XPR2終止密碼子順序和往返運(yùn)動(dòng)的載體DNA在各個(gè)表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中則是相同的。于是計(jì)劃把相同的凝乳酶原結(jié)構(gòu)基因片段和終止密碼子/載體質(zhì)粒用于如下所述的各個(gè)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中。在下游附近的密碼子段里，不同的凝乳酶原表達(dá)/分離質(zhì)粒的構(gòu)建在先于凝乳酶原基因順序的氨基末端堿性蛋白酶前體的順序的長(zhǎng)度方面不同于XPR2基因啟動(dòng)子順序。為此，在XPR2凝乳酶原接合密碼子內(nèi)，把各個(gè)表達(dá)質(zhì)粒的啟動(dòng)子片段的組分設(shè)計(jì)成可變的順序。所有表達(dá)/分離載體都用類似于含有三個(gè)組成片段的連接反應(yīng)集中在一起。
用于構(gòu)建終止密碼子載體pterm4的實(shí)現(xiàn)步驟見(jiàn)圖4所示。首先將人工合成連接子與含有xpr2基因的的3′末端的片段連接，包括轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸信號(hào)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用核酸內(nèi)切酶KpnⅠ切割質(zhì)粒pLD84，再用人工合成的連接子DNA雙股鏈連接(圖4)。用核酸內(nèi)切酶HindⅢ和BglⅡ切割連接產(chǎn)物并將一個(gè)760堿基對(duì)片段插入與相同的兩個(gè)核酸內(nèi)切酶形成直線的質(zhì)粒pLD41中，得到pterm4。質(zhì)粒pterm4用它的限制性圖來(lái)鑒定。對(duì)用EcoRV、EcoRⅠ、KpnⅠ、BglⅡ-HindⅢ和BglⅡ-BclⅠ-系列限制性核酸內(nèi)切酶消化的結(jié)果進(jìn)行分析。消化提供了有用的片段，如歐洲專利0138508所述，證明存在著人工合成連接子和在往返運(yùn)動(dòng)的質(zhì)粒pLD41中XPR2基因的“完整”的3′末端。圖4給出了這個(gè)7.3仟堿基終止密碼子載體的部分圖。
表達(dá)/分離質(zhì)粒pLS-3的構(gòu)建圖5概述了用于分泌解脂亞羅威阿酵母中凝乳酶原的起始質(zhì)粒的構(gòu)建。其限制性圖在圖5中給出。凝乳酶原分泌質(zhì)粒的構(gòu)建是從制備含有大多數(shù)凝乳酶原結(jié)構(gòu)基因順序的片段著手的。從大腸桿菌凝乳酶原表達(dá)質(zhì)粒pPFZ-84A中分離出含有6至365個(gè)凝乳酶原的殘基密碼順序的1080堿基對(duì)BclⅠ-BamHⅠ(部分)DNA片段。(質(zhì)粒pPFZ-84A是凝乳酶原表達(dá)質(zhì)粒pPFZ-R2的衍生物，它的構(gòu)建在1985年7月3日公布的歐洲專利申請(qǐng)0147178號(hào)中已作了介紹，并且已通過(guò)用限制性片段置換人工合成定向致突變的寡核苷酸方法制成。特別是pPFZ-84A不同于在凝乳酶原氨基酸殘基214(天冬酰胺→天冬氨酸)和286(天冬氨酸→甘氨酸)只有兩個(gè)堿基對(duì)的pPFZ-R2，可以為所謂的凝乳酶原A等位基因編譯密碼，所以質(zhì)粒含有凝乳酶原的理想順序并且在這個(gè)實(shí)施例中作用是相等的)。XPR2啟動(dòng)子組成片段含有1至157堿性蛋白酶前體和1至5凝乳酶原的密碼順序，按下述方法制備。從+PR2亞克隆質(zhì)粒pLD90分離出含有啟動(dòng)子密碼子和堿性蛋白酶基因5′末端的870堿基對(duì)HindⅢ-AvaⅠ DNA片段，它與具有下述結(jié)構(gòu)的人工合成片段連接5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTG5′譯讀方向→這個(gè)順序含有AvaⅠ粘性末端，然后對(duì)堿性蛋白酶前肽的最后9個(gè)密碼子進(jìn)行順序編碼，拉著對(duì)凝乳酶原的前4個(gè)氨基酸進(jìn)行順序編碼，最后在Bam HⅠ部位終止。啟動(dòng)子組成片段是用HindⅢ和BamHⅠ切割后，用人工合成片段和帶T4連接酶的870堿基對(duì)HindⅢ-AvaⅠ片段，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)獲得的。最后得到的連接順序通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化，選出適用的916堿基對(duì)HindⅢ-BamHⅠ DNA片段。如上所述，雜交基因的3′末端是由終止密碼子/載體質(zhì)粒pterm4得到的。質(zhì)粒pterm4用HindⅢ-和BClⅠ消化，并從瓊脂糖凝膠中分離出大約7.3仟堿基HindⅢ-BclⅠ終止密碼子/載體DNA片段，該片段含有XPR2終止密碼子、LEU2可選擇標(biāo)記物和pBR322。
凝乳酶原表達(dá)/分泌質(zhì)粒pLD-3通過(guò)對(duì)3個(gè)組成DNA片段含有(用HindⅢ-BclⅠ切割的Pterm4質(zhì)粒、以及916堿基對(duì)HindⅢ BamHⅠ啟動(dòng)子和1080堿基對(duì)BamHⅠ-BclⅠ凝乳酶原基因的片段)的保溫而結(jié)合在一起，構(gòu)建如上所述有連接酶T4參加(見(jiàn)圖5)。連接的混合物采用Dagert等人(Gene6，23-28(1979)氯化鈣方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從抗氨芐菁霉素選出的轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒，質(zhì)粒pLS-3用其限制性圖進(jìn)行鑒定(圖6A)。這個(gè)質(zhì)粒的XPR2-凝乳酶區(qū)經(jīng)順序排列，肯定為人工合成DNA的適合順序和理想片段的恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。
pLD90的制備。這種質(zhì)粒含有源自pLD84亞克隆。將與終止密碼子的EcoRⅠ部位對(duì)應(yīng)的XPR2啟動(dòng)子區(qū)的PVUⅠ部位中的DNA區(qū)按如下所述亞無(wú)性繁殖到pBR322的HindⅢ部位。用上述命名的兩個(gè)限制性酶可以消化幾微克pLD84。然后，被消化的DNA分子的“粘性”末端充滿了DNA聚合酶Ⅰ的克列諾夫(Klenow)片段。將被激酶致活的HindⅢ連接子(由New England Biolabs供應(yīng)的CAAGCTTG)加到帶T4 DNA連接酶的末端。去除多余的連接子，用HindⅢ酶進(jìn)行連續(xù)消化，形成HindⅢ粘性末端。將DNA分子的混合物置于事先準(zhǔn)備的瓊脂糖凝膠上，切下所需的2仟堿基帶，進(jìn)行純化，與經(jīng)HindⅢ消化過(guò)的并經(jīng)細(xì)菌堿性磷酸酶處理過(guò)的載體pBR322一起加到連接反應(yīng)中。連接混合物用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)潛能大腸桿菌。靠近pBR322的EcoRⅠ部位，XPR2終止密碼子的EcoRⅠ部位方向取名為pLD90，相反方向的則取名為pLD91。
包括在pLS-3中的XPR2啟動(dòng)子區(qū)的5′末端是PVUI部位，大約是從圖3所列順序區(qū)開(kāi)始起的280堿基對(duì)。發(fā)現(xiàn)含有野生型蛋白酶基因在這樣大量啟動(dòng)子控制下，當(dāng)被整合到在遠(yuǎn)離固有的XPr2位點(diǎn)上的基因組時(shí)，是不能使轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生大量的蛋白酶的(在脫脂乳平板上的透明區(qū)作出的鑒定)。
我們注意到，如果pLS-3含有縮短的因而是“有缺陷”的啟動(dòng)子，然后從質(zhì)粒與固有的野生型XPR2基因重組的整合結(jié)果，產(chǎn)生完整的啟動(dòng)子，它控制凝乳酶原并合產(chǎn)物的表達(dá);但有缺陷的啟動(dòng)子則是控制蛋白酶的表達(dá)。類似基因破碎型的試驗(yàn)是用Shortle等人(Science217∶371～373，1982)的啤酒酵母活性基因來(lái)完成的。與我們的預(yù)料相一致的是，有些帶有pLS-3不依賴亮氨酸的轉(zhuǎn)化株，現(xiàn)在知道實(shí)際上就是有缺陷的蛋白酶。有缺陷的蛋白酶轉(zhuǎn)化株與不希望要的副產(chǎn)品如在leu2上的基因轉(zhuǎn)化株相比，更可能是所需要的在XPR2位點(diǎn)上的整合株。關(guān)于感受體菌株ATCC20688，我們發(fā)現(xiàn)未切割的pLS-3產(chǎn)生的6.5%缺乏蛋白酶的轉(zhuǎn)化株，反之，用SnaBⅠ切割的質(zhì)粒所產(chǎn)生的缺乏蛋白酶的轉(zhuǎn)化株約為70%。就這種轉(zhuǎn)化而言，基因破碎都可回避為了從所有轉(zhuǎn)化株中發(fā)現(xiàn)合適的整合株而需要進(jìn)行大量的南部斑漬試驗(yàn)。
含有野生型蛋白酶結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒，在XPR2啟動(dòng)子控制下(位于圖3所列順序的起始處)，當(dāng)其被整合到除XPr2位點(diǎn)外的一個(gè)部位上的解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞時(shí)，可以表達(dá)大量的蛋白酶?？墒?，從這類整合株中有效地表達(dá)異源基因都要求進(jìn)一步改進(jìn)這個(gè)控制區(qū)DNA。
凝乳酶原的分泌用未切割pLS-3DNA和用SnaBⅠ消化的pLS-3DNA轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母菌株ATCC20688，可分別獲得xpr-leu+轉(zhuǎn)化株ATCC20775(DL144)和ATCC20776(DL148)。將這些轉(zhuǎn)化菌株接種到含有YEPD培養(yǎng)基的試管中。
細(xì)胞在28℃條件下生長(zhǎng)過(guò)夜。將這些培養(yǎng)菌的整分(250微升)以1∶100稀釋到每份為25毫升的GPP培養(yǎng)基中。在28℃條件下細(xì)胞在搖瓶中生長(zhǎng)16～18小時(shí)，通過(guò)離心得到的吸光率是在5.0～7.0的600毫微米處，通過(guò)濃縮上清液并濃縮到SDS-PAGE，測(cè)定所得到的培養(yǎng)液或上清液中的凝乳酶原。通過(guò)電泳把板狀凝膠轉(zhuǎn)化為硝化纖維紙，參加轉(zhuǎn)化反應(yīng)的有20毫摩爾的Tris堿基、150毫摩爾的甘氨酸、20%的甲醇，500毫安，4℃，2小時(shí)。去除板狀凝膠中的蛋白質(zhì)是用Coomassie等染色來(lái)鑒定的。
硝化纖維紙?jiān)?7℃下干燥，在65℃烘烤1小時(shí)，然后在TBS(200毫摩爾Na Cl，50毫摩爾Tris-HCl，pH7.5)中洗脫。將硝化纖維紙置于含有10%馬血清(Gibco，Chagrin Falls，俄亥俄)的TBS中，在室溫條件下保溫30分鐘，然后在含有10%馬血清的TBS中保溫，并在室溫條件下適當(dāng)稀釋凝乳酶原抗體16小時(shí)。再將硝化纖維紙放在TBS中洗脫三次，10分鐘，接著在含有10%馬血清的TBS中保溫，然后在含有10%馬血清的TBS中保溫2小時(shí)，并且適當(dāng)稀釋結(jié)合到馬蘿卜過(guò)氧化酶的山羊抗兔免疫球蛋白G抗體。再將硝化纖維紙?jiān)赥BS中洗脫3次，10分鐘，在4-氯-1-萘酚(3毫克/毫升的甲醇溶液)中顯色，然后加到濃度為0.5毫克/毫升含有0.01%過(guò)氧化氫的TBS中。測(cè)定兩個(gè)上清液中存在分子量為40，000的凝乳酶原。
在酸活化濃縮培養(yǎng)液的上清液(見(jiàn)上)后，在從含有pLS-3轉(zhuǎn)化培養(yǎng)菌ATCC20775和20776制備的樣品中存在著明顯的凝乳活性。作為例外的是，在感受體解脂亞羅威阿酵母ATCC20688的對(duì)照培養(yǎng)液的上清液中沒(méi)有得到凝乳活性。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-33的構(gòu)建為了把pLS-3轉(zhuǎn)化為改進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒pXX-33所作出的改進(jìn)已在圖6中作了概述。這種改進(jìn)增加了XPR2啟動(dòng)區(qū)280堿基對(duì)，就pLS-3而言，表達(dá)質(zhì)粒pXX-33含有一個(gè)完整的堿性蛋白酶的預(yù)前肽(157個(gè)氨基酸殘基)的雜交基因密碼，堿性蛋白酶被連接到整個(gè)凝乳酶原的結(jié)構(gòu)基因順序。
以280堿基對(duì)構(gòu)建凝乳酶原表達(dá)/分泌質(zhì)粒前，這種可能性與其說(shuō)是在pLS-3中，不如說(shuō)是在XPR2啟動(dòng)子順序中，這就需要將含有整個(gè)堿性蛋白酶基因的限制性片段無(wú)性繁殖到HindⅢ部位。這種亞無(wú)性繁殖是通過(guò)把人工合成的連接子和加到由XPR2基因組庫(kù)無(wú)性繁殖系的pLD86分離得到的限制性片段。構(gòu)建這種帶有上游區(qū)HindⅢ部位的XPR2亞無(wú)性繁殖系是從制備含有所有堿性蛋白酶基因的DNA片段著手的。XPR2無(wú)性系pLD-86的基因組區(qū)中的2.4仟堿基EcoRⅠ-BamHⅠ(部分)片段是通過(guò)瓊脂凝膠電泳進(jìn)行純化的，用人工合成的片段進(jìn)行連接，其順序?yàn)?′GATCGAAGCTTG3′3′TTCGAACTTAA5′這種連接子順序含有一個(gè)BamHⅠ粘性末端(但不再重新產(chǎn)生BamHⅠ部位)，然后先后為HindⅢ部位和EcoRⅠ粘性末端。連接產(chǎn)物用HindⅢ消化，然后插入到pBR322的HindⅢ部位。質(zhì)粒pXHP-24通過(guò)它的限制性圖予以鑒定，成為用于未來(lái)表達(dá)構(gòu)建的XPR2啟動(dòng)子片段的來(lái)源。
在質(zhì)粒pXHP-24中，亞無(wú)性系的XPR2基因含有大約280堿基對(duì)，在pLS-3中所含的是5′XPR2啟動(dòng)子順序多于XPR2啟動(dòng)子順序。首先，啟動(dòng)子組成片段是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)，用人工合成的DNA片段(如上面所述的pLS-3)和在用HindⅢ及BamHⅠ切割以后帶有T4連接酶的pXHP-24中的1150堿基對(duì)HindⅢ-AvaⅠ片段得到的。將所得到的連接順序通過(guò)凝膠電泳純化，選出大約1196堿基對(duì)HindⅢ-BamHⅠ片段。第二個(gè)片段含有編碼6～151個(gè)凝乳酶原氨基酸殘基的順序，是從經(jīng)BamHⅠ和XmaⅠ切割的pLS-3以及凝膠純化所得到的440堿基對(duì)BamHⅠ-XmaⅠDNA片段進(jìn)行制備的。第三個(gè)含有凝乳酶原基因的殘余、XPR2終止密碼子和載體順序的片段是由用HindⅢ和XmaⅠ切割的pLS-3，以及凝膠純化大約8.0仟堿基HindⅢ-XmaⅠ載體片段進(jìn)行制備的。然后將三個(gè)片段用上述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行連接。將連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從在抗氨芐青霉素的基礎(chǔ)上選出的轉(zhuǎn)化株中分離出質(zhì)粒，質(zhì)粒pXX-33用它的限制性圖進(jìn)行鑒定(圖6)。這種質(zhì)粒的蛋白酶一凝乳酶原區(qū)所排列的順序，確定為所需片段的適當(dāng)結(jié)合。
然后用經(jīng)SnaBⅠ切割的pXX-33轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母ATCC20774，以便通過(guò)如上面所述的pLS-3的情況測(cè)定被轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)菌，提供解脂亞羅威阿酵母ATCC20780和在培養(yǎng)基中被分泌的凝乳酶原。確定在培養(yǎng)液的上清液中存在凝乳酶原。
在酸活化濃縮的培養(yǎng)液上清液之后(見(jiàn)上)，在由已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)菌解脂亞羅威阿酵母ATCC20780中制備得到的樣品中觀察到明顯的凝乳活性。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-22的構(gòu)建構(gòu)建表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-22的實(shí)驗(yàn)步驟已在圖7中給出。表達(dá)載體在兩個(gè)方面不同于pLS-3。如同pXX-33一樣，它含有附加的280堿基對(duì)片段的XPR2啟動(dòng)子順序。其次，它含有堿性蛋白酶信號(hào)肽的順序密碼和僅僅38個(gè)前肽(pro1)的氨基酸殘基。
構(gòu)建pXX-22的計(jì)劃與pXX-33相似。首先，啟動(dòng)子組成片段是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的連接反應(yīng)，用pXHP-24中的890堿基對(duì)HindⅢ-BglⅡ片段以及在用HindⅢ和BamHⅠ消化之后人工合成的帶有T4連接酶順序片段，其順序?yàn)?′GATCTTGCTGAGATCACTAG3′3′AACGACTCTAGTGATCCTAG5′得到的連接順序通過(guò)凝膠電泳分離920堿基對(duì)HindⅢ-BamHⅠDNA片段進(jìn)行純化。另一個(gè)編碼6～151個(gè)凝乳酶原殘基的片段，是由經(jīng)BamHⅠ和XmaⅠ切割的pLS-3中分離以及凝膠純化所得到的440堿基對(duì)BamHⅠ-XmaⅠDNA片段。第三個(gè)含有凝乳酶原基因的殘余、XPR2終止區(qū)和載體順序的片段是通過(guò)用HindⅢ和XmaⅠ切割pLS-3以及凝膠純化大約8.0仟堿基載體片段進(jìn)行制備的。然后將3個(gè)DNA片段用上述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行連接。將連接反應(yīng)用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選擇的轉(zhuǎn)化株中分離出質(zhì)粒，質(zhì)粒pXX-22是用它的限制性圖進(jìn)行鑒別的(圖7)。
然后用經(jīng)SnaBⅠ切割的pXX-22轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母ATCC20774，以便通過(guò)如上面所述的pLS-3的情況測(cè)定被轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)菌，提供解脂亞羅威阿酵母ATCC20779和在培養(yǎng)基被分離的凝乳酶原。按照上述方法確定在培養(yǎng)液的上清液中存在著凝乳酶原。在酸活化濃縮的培養(yǎng)液的上清液后(見(jiàn)上)，在由被轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)菌解脂亞羅威阿酵母ATCC20779中制備的樣品中觀察到顯著的凝乳活性。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-11的構(gòu)建構(gòu)建凝乳酶原表達(dá)/分離質(zhì)粒pXX-11的實(shí)驗(yàn)步驟在圖8中作了概述。這種質(zhì)粒含有XPR2啟動(dòng)子順序和連接編碼凝乳酶原順序的22個(gè)氨基酸殘基信號(hào)肽。用于pXX-11的構(gòu)建計(jì)劃與用于pXX-22和pXX-33的構(gòu)建計(jì)劃相類似。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，啟動(dòng)子組成片段是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的連接反應(yīng)，用pXHP-24中大約750堿基對(duì)HindⅢ-BglⅡDNA片段和在用HindⅢ和BamHⅠ切割后帶有T4連接酶順序的人工合成片段，該順序?yàn)?′TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG3′3′AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG5′→所得連接順序通過(guò)凝膠電泳純化，選出790堿基對(duì)HindⅢ-BamHⅠDNA片段。編碼凝乳酶原殘基b～151的另一個(gè)片段則是經(jīng)BamHⅠ和XmaⅠ切割從pLS-3中分離出來(lái)并經(jīng)凝膠純化所得到的440堿基對(duì)BamHⅠ-XmaⅠDNA片段。第3個(gè)含有凝乳酶原結(jié)構(gòu)基因的殘余、XPR2終止密碼子和往返運(yùn)動(dòng)的載體順序的片段則是通過(guò)用HindⅢ和XmaⅠ切割pLS-3并經(jīng)凝膠純化的大約8.0仟堿基載體片段進(jìn)行制備的。然后將3個(gè)DNA片段用上述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行連接。連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選擇的轉(zhuǎn)化株中分離出質(zhì)粒，質(zhì)粒pXX-11用它的限制性圖進(jìn)行鑒定(圖8)。從質(zhì)粒的XPR2-凝乳酶原部分編排的順序確定人工合成DNA和所需片段的適當(dāng)連接。
然后用經(jīng)過(guò)SnaBⅠ切割的pXX-11轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿酵母ATCC20774，通過(guò)如上面所述的pLS-3方法測(cè)定被轉(zhuǎn)化過(guò)的培養(yǎng)液，給出解脂亞羅威阿酵母20778和分泌在培養(yǎng)基中的凝乳酶原。按照上述方法，確定在培養(yǎng)上清液中存在著凝乳酶原。
凝乳測(cè)定(見(jiàn)上)表明，在含有pXX-11的轉(zhuǎn)化株ATCC20778的培養(yǎng)上清液中存在著明顯的凝乳活性。
實(shí)施例二 連接臺(tái)的構(gòu)建對(duì)應(yīng)于ATCC20774中的bio-6等位基因的野生型BIO基因按如下方法通過(guò)互補(bǔ)進(jìn)行無(wú)性繁殖。構(gòu)建了部分經(jīng)Sau3A消化插入pLD40的BamHⅠ部位(這是在EcoRⅠ部位上的pBR322+LEU2)的解脂亞羅威阿酵母染色體DNA的基因庫(kù)，制備了大量DNA庫(kù)作為混合培養(yǎng)大腸桿菌質(zhì)粒的準(zhǔn)備(這是與用于無(wú)性繁殖XPR2基因相同的DNA庫(kù))。用酶ApaⅠ(在LEU2區(qū)進(jìn)行一次切割)能消化幾微克的DNA庫(kù)，通過(guò)將轉(zhuǎn)化混合物涂覆在缺亮氨酸的人工合成培養(yǎng)基上，用該DNA轉(zhuǎn)化ATCC20774(leu2 xpr2 bio)。獲得幾萬(wàn)個(gè)不依賴亮氨酸的轉(zhuǎn)化株。為了得到含有包括BIO基因的質(zhì)粒庫(kù)的菌落一如有需要-也可以把不依賴亮氨酸的轉(zhuǎn)化株由平板影印培養(yǎng)轉(zhuǎn)到含有生物素選擇培養(yǎng)基的瓊脂平板培養(yǎng)(per L配方25毫克脫硫生物素，20克葡萄糖，5克硫酸銨，1克KH2PO4，0.5克Mg SO.7H2O，0.1克CaCl2，0.1克NaCl，500微克硼酸，400微克硫胺素HCl，400微克ZnSO47H2O，400微克MnSO4H2O，200微克Na2MoO42H2O，200微克FeCl3·6H2O，100，微克KI和40微克CuSO45H2O)。
一種生長(zhǎng)在生物素選擇培養(yǎng)基上的解脂亞羅威阿酵母BIO+轉(zhuǎn)化株，取名為DL31。我們著手回收含有解脂亞羅威阿酵母菌株DL31中BIO基因的基因庫(kù)質(zhì)粒。從培養(yǎng)菌株DL31中制備染色體DNA。用限制性酶ApaⅠ切割質(zhì)粒庫(kù)就能消化幾微克這種染色體DNA。將被消化的DNA的整分部份用于連接反應(yīng)，使未知的質(zhì)粒庫(kù)構(gòu)成圓形。然后將連接混合物用來(lái)轉(zhuǎn)化抗氨芐青霉素的大腸桿菌的培養(yǎng)，以回收進(jìn)入大腸桿菌的含有BIO的未知質(zhì)粒。獲得了少量的抗氨芐青霉素的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株。小的質(zhì)粒的制備也是在大腸桿菌轉(zhuǎn)化株上進(jìn)行的。這樣得到的質(zhì)粒DNA的限制性消化呈現(xiàn)出含BIO的未知質(zhì)粒，作為例外的是有等量于pLD40的插入BamHⅠ部位。這種質(zhì)粒開(kāi)始一定來(lái)自我們的基因庫(kù)，取名為pLD51。
質(zhì)粒pLD56是通過(guò)去除pLD51中的LEU2基因作為pLD51的亞無(wú)性系而產(chǎn)生的，介紹如下。用酶EcoRⅠ消化質(zhì)粒pLD51的整分部份，以去除LEU區(qū)。被消化的DNA用于DNA的連接反應(yīng)，使質(zhì)粒再呈圓形。然后完成大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，使含有BIO的較小質(zhì)粒進(jìn)行無(wú)性繁殖。有一種抗氨芐青霉素的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株表明含有能期望的較小質(zhì)粒，取名pLD56。完成了pLD56的一些限制性消化。含有BIO的pLD56片段，在pBR322的BamHⅠ部位存在一個(gè)插入物，長(zhǎng)約3.6仟堿基。
一張非常粗仿的解脂亞羅威阿酵母DNA的3.6仟堿基插入物插入pBR322的BamHⅠ部位(與pLD56相比較)限制性圖將在下面予以介紹，圓括號(hào)內(nèi)的數(shù)據(jù)表示堿基對(duì)從插入開(kāi)始的近似距離。量值的估計(jì)是從少量瓊脂糖得出的，量值的誤差相當(dāng)大PvuⅡ(800)，PvuⅡ(1200)，PstⅠ(1800)，MluⅠ(2000)，PstⅠ(2300)，EcoRV(2700)，NcoⅠ(3200)(取向pBR322的SalⅠ部位居于所介紹的各部位之先，HindⅢ在他們之末)。
菌株ATCC20774(MATB leu2-40 bio-6 xpr2-1002)是用完整的pLD56(pBR322+含有BIO基因的解脂亞羅威阿酵母染色體DNA的近似值3.6仟堿基)。對(duì)3個(gè)不依賴生物素的不同轉(zhuǎn)化株與其親代菌株作比較，進(jìn)行NruⅠ切割(以pBR322為目標(biāo))pLD40(在pBR322上的LEU2)高頻率轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，以測(cè)定其所含的被整合到BIO區(qū)的固有的pBR322。因?yàn)閜LD40都整合到固有的pBR322中，所以3個(gè)轉(zhuǎn)化株都顯示出高頻率轉(zhuǎn)化。這已由南方斑漬雜交試驗(yàn)所確認(rèn)。3個(gè)原始的解脂亞羅威阿酵母BIO轉(zhuǎn)化株中有一株取名為DL118并進(jìn)一步用作DNA感受體。上述的限制性圖需要確定(1)以什么作為BIO特殊雜交的探針(一個(gè)NcoⅠ-PvuⅡ碎片);(2)需要用哪種酶來(lái)準(zhǔn)確地切割pLD56質(zhì)粒(MluⅠ);(3)哪個(gè)酶只在pBR322部分中進(jìn)行一次切割(ClaⅠ);和(4)哪種酶完全不能切割質(zhì)粒(ApaⅠ)。ATCC20774和DL118(已用BIO片段探測(cè))中DNA的ClaⅠ和ApaⅠ消化的南部雜交表明，正如預(yù)料的一樣，DL118的生物素區(qū)(在與ATCC20774的BIO區(qū)相比較時(shí))是被附加的近似于pLD56大小的DNA破壞了。DL118DNA的MluⅠ消化(已用pBR322進(jìn)行探測(cè))進(jìn)一步表明附加的DNA與完整的pLD56同樣大小。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pLX-34的構(gòu)建構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒把帶有XPR2分泌信號(hào)(157個(gè)氨基酸前原順序)的凝乳酶密碼順序置于LEU2啟動(dòng)子的下游。這種表達(dá)質(zhì)粒顯示出除了XPR2啟動(dòng)子外的啟動(dòng)子也可用來(lái)成功地分泌異源蛋白質(zhì)。此外，這種表達(dá)載體能夠?qū)崿F(xiàn)解脂亞羅威阿酵母基因組中整合部位的表達(dá)/分泌的獨(dú)立性。成功地地分泌帶有除了XPR啟動(dòng)子外的其他啟動(dòng)子的凝乳酶原說(shuō)明為了鑒定解脂亞羅威阿酵母中另外新的更強(qiáng)的啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體的可能性。此外，這種方法能夠用來(lái)獲得表達(dá)培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物具有兩個(gè)分離的雜交凝乳酶原基因，一個(gè)由LEU2啟動(dòng)子表達(dá)，另一個(gè)由XPR2啟動(dòng)子表達(dá)，被分別連接在宿主基因組中不同的部位上。
構(gòu)建表達(dá)載體的試驗(yàn)步驟在圖13中已作了概述，該載體含有凝乳酶原基因，帶有用LEU2啟動(dòng)子順序表達(dá)的堿性蛋白酶分泌信號(hào)(157個(gè)氨基酸的XPR2前原順序)。構(gòu)建這種質(zhì)粒是從制備LEU2啟動(dòng)子片段著手的，該片段含有上述β-異丙基苯果酸脫氫酶基因的ATG轉(zhuǎn)譯起始密碼子前的5′未轉(zhuǎn)譯的順序大約300堿基對(duì)(圖12)。從作往返移動(dòng)的載體pLD40中分離出為L(zhǎng)EU2啟動(dòng)子順序的270堿基對(duì)部分編碼的300堿基對(duì)HindⅢ-FoKⅠDNA片段。這個(gè)片段用T4連接酶與54堿基對(duì)連有下列順序的人工合成連接子連接，-Leu2-FokⅠ5′-ATACAACCACACACATCCACAATG3′-TTGGTGTGTGTAGGTGTTAC-Xpr2-BglⅠAAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC-3′TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC-5′然后用HindⅢ進(jìn)行消化。所得連接順序再用凝膠電泳分離大約360堿基對(duì)的HindⅢ-BglⅠDNA片段進(jìn)行純化。編碼XPR2前原順序的殘余和凝乳酶原的前152個(gè)氨基酸殘基的另一個(gè)組成片段是從表達(dá)質(zhì)粒pXX-33(圖6)經(jīng)BglⅠ和XamⅠ切割分離出來(lái)的，再用凝膠純化得到887堿基對(duì)DNA片段。第三個(gè)片段含有凝乳酶原基因的殘余、XPR2終止密碼子和載體順序，它是通過(guò)HindⅢ和XmaⅠ切割pXX-33，再經(jīng)切割大約8.0仟堿基載體片段再經(jīng)凝膠純化制備得到的。將這三個(gè)DNA片段用上述標(biāo)準(zhǔn)方法連接。連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株HB101。從在抗氨芐青霉素基礎(chǔ)上選出的轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒，質(zhì)粒pLX-34用它的限制性圖(圖13)進(jìn)行鑒定。
用經(jīng)NruⅠ切割的pLX-34DNA來(lái)轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母ATCC20794(DL118)，以提供解脂亞羅威阿酵母ATCC20795(DL251)，并按上述pLS-3測(cè)定由不依賴亮氨酸的轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)菌分離到培養(yǎng)液中的凝乳酶原。這種轉(zhuǎn)化方法是控制把pLX-34整合所先前已被引入宿主染色體中的bio位點(diǎn)上的pBR322順序(如上所述)。pLX-34在這個(gè)部位上的整合是用南部分折予以確定的。
用DL118作為受體南部雜交試驗(yàn)按下述方法進(jìn)行從DL118的轉(zhuǎn)化株中的DNA的NruⅠ消化，(例如當(dāng)參入質(zhì)粒是凝乳酶原表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，就與凝乳酶原探針雜交)。精確地切割了參入質(zhì)粒。幾毫微克的NruⅠ消化的轉(zhuǎn)化質(zhì)?？梢詸z查雜交帶的正確的大小，由這些轉(zhuǎn)化株(已用32P標(biāo)記的pBR322進(jìn)行探測(cè))中的DNA的MluⅠ消化(在轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中MluⅠ不切割)也說(shuō)明DL118固有的pBR322順序是由于加入了一個(gè)或二個(gè)以上的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的分子才被破壞的。這證明整合是在理想的部位上發(fā)生的。
將轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)菌解脂亞羅威阿酵母ATCC20795(DL251)置于YEPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，22℃，以利于LEU2啟動(dòng)子的表達(dá)。在培養(yǎng)物上清液中存在的凝乳酶原是用酸活化培養(yǎng)物上清液的凝乳測(cè)定(見(jiàn)上)預(yù)以確定的并經(jīng)免疫斑點(diǎn)分析(見(jiàn)上)鑒定。上述結(jié)果說(shuō)明，這個(gè)雜交基因是一個(gè)獨(dú)立的表達(dá)單位，當(dāng)其在除了XPR2或LEU2外的其他部位上被整合時(shí)，是能夠表達(dá)/分泌的。這個(gè)性質(zhì)可以用多重雜交基因構(gòu)建表達(dá)培養(yǎng)菌，它具有實(shí)現(xiàn)高水平的細(xì)胞外凝乳酶原的潛在能力。
實(shí)施例三 用于人體C5a的人工合成基因的順序設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)生人體過(guò)敏毒素C5a的計(jì)劃如在歐洲專利申請(qǐng)0147178號(hào)中所述，類似于以前用于合成和表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子(EGF的方法。采用構(gòu)建一個(gè)基因，人工合成活化補(bǔ)體組分C5a的密碼順序。給出已知的人體C5a的氨基酸序列，我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)編碼其74種氨基酸信息的DNA片段(圖9)。選擇人工合成基因順序以擴(kuò)大大腸桿菌和啤酒酵母最佳密碼子的利用并可使限制性核酸內(nèi)切酶的有些部位便于利用。這項(xiàng)探索可以通過(guò)編碼在C5a多肽的第一個(gè)氨基酸的三聯(lián)體之前引入蛋白質(zhì)合成的ATG起始密碼子，在大腸桿菌的過(guò)敏毒素內(nèi)直接表達(dá)。為便于在理想的位置上插入質(zhì)粒pBR322，設(shè)計(jì)的人工合成C5a基因在其終止區(qū)含有EcoRⅠ和HindⅢ限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別部位。為了獲得C5a基因順序，通過(guò)phosporamidite方法合成10個(gè)47-聚體并且集中在235堿基對(duì)雙股DNA片段。將C5a基因片段插入到被適當(dāng)切割的pBR322中并從隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)化株中通過(guò)DNA質(zhì)粒的限制性切割分析來(lái)鑒定克隆基因。然后采用DNA順序排列分析若干C5a克隆，鑒別出一個(gè)帶有適宜順序的克隆。在被檢查的5個(gè)克隆中有2個(gè)找到了按計(jì)劃確定的C5a基因區(qū)的核苷酸順序。
人體C5a的細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建C5a表達(dá)質(zhì)粒是從用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ切割C5a亞克隆著手的，然后用細(xì)菌堿性磷酸酶處理脫磷酸化。用從含有trp啟動(dòng)子一操縱子和核糖體結(jié)合部位順序的pPFZ-R2中的360堿基對(duì)EcoRⅠDNA片段，構(gòu)建C5a表達(dá)質(zhì)粒。用連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HB101的補(bǔ)體細(xì)胞。對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)化中的一些抗藥性菌落進(jìn)行純化并對(duì)它們的DNA質(zhì)粒進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶描圖分析，以鑒定在能導(dǎo)致C5a基因轉(zhuǎn)錄的位置上帶有trp啟動(dòng)子的那些表達(dá)質(zhì)粒。在要求直接表達(dá)C5a的構(gòu)型中，用含有靠近細(xì)菌啟動(dòng)子順序的過(guò)敏毒素基因的質(zhì)粒來(lái)鑒定上述連接反應(yīng)中的多重分離物。C5a表達(dá)質(zhì)粒pC5a-48的限制性圖見(jiàn)圖10。
人體過(guò)敏毒素在解脂亞羅威阿酵母中的表達(dá)和分泌編碼分泌人體過(guò)敏毒素C5a的表達(dá)/分泌載體pC5aX-3的制備技術(shù)如實(shí)施例一有關(guān)pXX-33部分。然后將解脂亞羅威阿酵母ATCC20774通過(guò)這個(gè)分泌載體轉(zhuǎn)化并測(cè)定由轉(zhuǎn)化培養(yǎng)菌產(chǎn)生的人體C5a，除了山羊抗C5a和家兔抗山羊免疫球蛋白G用于免疫斑點(diǎn)測(cè)定方法，其余如上所述。本實(shí)施例所述的質(zhì)粒，是確定C5a存在于培養(yǎng)基上清液中。
表達(dá)和分泌質(zhì)粒pC5aX-3的構(gòu)建構(gòu)建過(guò)敏毒素的表達(dá)/分泌質(zhì)粒pC5aX-3的實(shí)驗(yàn)步驟在圖11中已作了概述。這個(gè)質(zhì)粒含有“完整”的XPR2啟動(dòng)子的順序、157個(gè)氨基酸殘基信號(hào)以及與為74個(gè)C5a氨基酸殘基編碼的人工合成順序連接的前肽。pC5aX-3的構(gòu)建計(jì)劃類似于pXX-33。首先，用HindⅢ和AvaⅠ切割質(zhì)粒PXHP-24(或含有所需順序的另一個(gè)質(zhì)粒)，凝膠純化含有XPR2啟動(dòng)子的1150堿基對(duì)片段。另一個(gè)片段含有XPR2肽原的3′端和C5a結(jié)構(gòu)基因順序，是借助T4連接酶通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)，用大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pC5a-48中的約220堿基對(duì)HinfⅠ-HindⅢDNA片段和帶有下列順序的人工合成片段，然后再用AvaⅠ和HindⅢ進(jìn)行切割得到的。
5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGA3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA5′連接順序通過(guò)凝膠電泳純化，選出大約250堿基HindⅢ-AvaⅠ片段。HindⅢ-AvaⅠ片段含有啟動(dòng)子，AvaⅠ-HindⅢ片段是用于C5a的編碼，把2個(gè)片段用T4連接酶連接，然后用HindⅢ消化。約1.4仟堿基片段進(jìn)行凝膠純化并且用經(jīng)HindⅢ切割的pterm4(如上所述)連接。連接反應(yīng)用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選的轉(zhuǎn)化株中再分離選出抗氨芐青霉素的質(zhì)粒，質(zhì)粒pC5aX-3用其限制圖進(jìn)行鑒定。然后將解脂亞羅威阿酵母菌株P(guān)C-30869ATCC20774用由SnaBⅠ切割的pC5aX-3進(jìn)行轉(zhuǎn)化并按上所述測(cè)定由轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)菌分泌在培養(yǎng)基中的過(guò)敏毒素。用上述的方法確定上清液中存在的C5a。
人們認(rèn)為由核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合而合成的許多蛋白質(zhì)是的糖蛋白形式產(chǎn)生的。實(shí)際上，糖基化可影響給定的蛋白質(zhì)的分泌。真核生物蛋白質(zhì)的N-鏈糖基化作用發(fā)生在3肽順序上的天冬酰胺-X-蘇氨酸和天冬酰胺-X-絲氨酸，X可以是除了可能的天冬氨酸外的任何一個(gè)氨基酸(Hubbard，S.等，1981，Ann.Rev.Biochem.50;555)。凝乳酶原的氨基酸順序包括這樣兩個(gè)肽順序，所以對(duì)分泌在解脂亞羅威阿酵母培養(yǎng)基中的凝乳酶原進(jìn)行的凝膠電泳分析證明糖基化作用并不明顯。在另一些被分泌的真核生物蛋白質(zhì)中，也并不是所有的天冬酰胺-X-蘇氨酸/絲氨酸部位都被?；?。很可能三肽順序內(nèi)的某些天冬酰胺并不糖基化，因?yàn)樗麄儗?duì)糖基化酶難以接近。
關(guān)于人體C5a，氨基酸順序包括單個(gè)糖基化部位或3肽順序(天冬酰胺-異亮氨酸-絲氨酸)，通常處理與天冬酰胺相連的復(fù)合低聚糖(Fernandez，H.等，1976，J.Immunol.117，1688)。被分泌到解脂亞羅威阿酵母培養(yǎng)基中的部分C5a分子呈現(xiàn)糖基化，因?yàn)榭乖钚缘膶拝^(qū)是在免疫班點(diǎn)分析的高分子量部分。這種異源蛋白質(zhì)的電泳遷移率與所觀察的其他被分泌的蛋白質(zhì)的電泳遷移率相類似，可能是由于所加的碳水化合物不同程度所致。在本發(fā)明中，某些被分泌的異源蛋白質(zhì)的明顯糖基化啟示人們，解脂亞羅威阿酵母的表達(dá)和分泌對(duì)產(chǎn)生許多正常的糖基化的真核生物的蛋白質(zhì)將是有用的。
＊從XPR2轉(zhuǎn)化株DL112回收質(zhì)粒的圖解說(shuō)明(參閱圖1)。各個(gè)標(biāo)記區(qū)是(從左到右)解脂亞羅威阿酵母未排列成順序，EcoRⅠ部位與連接解脂亞羅威阿酵母DNA(以前為BamHⅠ部位)之間的小片段pBR322，解脂亞羅威阿酵母LEU2基因，pBR322的大片段，和排列成順序的XPR2的突變等位基因?！癇”是BglⅡ部位，“E”是coRⅠ部位。用線條表示回收的3個(gè)質(zhì)粒，它們?cè)贐glⅡ部位的末端連接成環(huán)形分子。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)解脂亞羅威阿酵母培養(yǎng)菌，產(chǎn)生和分泌異源蛋白質(zhì)的方法，包括①將表達(dá)載體引入所述的解脂亞羅威阿酵母中，表達(dá)載體包括編碼異源于所述解脂亞羅威阿酵母、解脂亞羅威阿酵母基因或解脂亞羅威阿酵母啟動(dòng)子、解脂亞羅威阿酵母基因的信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止密碼子DNA順序的蛋白質(zhì)的DNA順序。②將所產(chǎn)生的①的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株置于適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；和③回收異源蛋白質(zhì)。
2.一種通過(guò)解脂亞羅威阿酵母培養(yǎng)菌，產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括①將表達(dá)載體引入所述解脂亞羅威阿酵母，表達(dá)載體包括與解脂亞羅威阿酵母異源的蛋白質(zhì)的DNA編碼和至少下述之一的表達(dá)載體;LEU2基因及其啟動(dòng)子或終止密碼子順序、XPR2基因、啟動(dòng)子、信號(hào)、prol-、pro2-或XPR2基因的終止密碼子順序;②將所產(chǎn)生的①的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株置于適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng);和③回收該異源蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述方法，其中所述基因是XPR2基因或LEU2基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述方法，其中所述異源蛋白質(zhì)DNA順序是凝乳酶原或人體過(guò)敏毒素C5a順序。
5.一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括將具有ATCC-20780鑒別特征的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株置于適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
6.一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括將具有ATCC20779鑒別特征的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株置于適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
7.一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括將具有ATCC20778鑒別特征的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株置于適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
8.一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括將具有ATCC20777鑒別特征的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株置于適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其中異源蛋白質(zhì)基因被插在XPR2基因的啟動(dòng)子和終止密碼子順序之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其中異源蛋白質(zhì)的基因是凝乳酶原或人體過(guò)敏毒素C5a基因。
11.一種制造不產(chǎn)生堿性蛋白酶的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株的方法，包括用XPR表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母的XPR+菌株。
12.一種檢測(cè)具有在XPR2基因上整合的載體DNA的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株的方法，包括①用XPR表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母的XPR+菌株;②篩選在失去堿性蛋白酶活性①中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12所述方法，其中XPR+解脂亞羅威阿酵母菌株是用未切割的質(zhì)粒PLS-3DNA或用Sna BⅠ消化的pls-3DNA轉(zhuǎn)化的。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12所述方法，其中所述解脂亞羅威阿酵母具有解脂亞羅威阿酵母ATCC20688鑒別特征。
15.制備解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株的方法，包括將表達(dá)載體整合到含有與異源載體DNA同系區(qū)的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株，所述同系區(qū)包括在所述解脂亞羅威阿酵母整合轉(zhuǎn)化期間用作信息接受部位的外源DNA。
16.產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括在適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有ATCC20795鑒別特征的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株。
17.產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)含有與異源載體DNA同系區(qū)的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株，所述同系區(qū)包括在所述解脂亞羅威阿酵母整合轉(zhuǎn)化期間用作信息接受部位的外源DNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，其中同系區(qū)是由pBR322衍生物的或是它的一個(gè)衍生物。
19.制造質(zhì)粒pXX33的方法，包括用HindⅢ-AvaⅠ切斷質(zhì)粒pXHP-24，以產(chǎn)生1150堿基對(duì)片段。分離所述片斷。在存在T4連接酶條件下，用合成DNA片段連接在所述片段，5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG5′用HindⅢ-BamHⅠ切斷由此產(chǎn)生的連接產(chǎn)物，以產(chǎn)生1196堿基對(duì)片段，分離所述的1196堿基對(duì)片段，在T4連接酶存在下，用由BamHⅠ-XmaⅠ切斷質(zhì)粒pLS3得到的440堿基對(duì)片段和由HindⅢ及XmaⅠ切斷質(zhì)粒pLS3得到的～8.0堿基對(duì)片段連接所述的1196堿基對(duì)片段，用由此產(chǎn)生的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗芐青霉素的轉(zhuǎn)化株和從所述轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒pXX33。
20.制造質(zhì)粒pXX22的方法，包括用HindⅢ-BglⅡ切斷質(zhì)粒pXHP24，以產(chǎn)生890堿基對(duì)片段，分離所述片段，在有T4連接酶存在下，用合成DNA片段連接所述片段，用HindⅢ-BamHⅠ切斷此產(chǎn)生的連接產(chǎn)物，以產(chǎn)生920堿基對(duì)片段，分離所述920堿基對(duì)片段，在有T4連接酶存在下，用由BamHⅠ-XmaⅠ切斷質(zhì)粒pLS3得到的440堿基對(duì)片段和由HindⅢ-XmaⅠ切斷質(zhì)粒pLS3得到的～8.0仟堿基片段連接所述的920堿基對(duì)片段，用由此產(chǎn)生的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑選抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化株，和由所述的轉(zhuǎn)化株分離質(zhì)粒pXX22。
21.制造質(zhì)粒pXX11的方法，包括用HindⅢ-BglⅡ切斷質(zhì)粒pXHP24，以產(chǎn)生750堿基對(duì)片段，分離所述片斷，在有T4連接酶存在下，用合成DNA片段連接所述片段，5′TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG3′3′AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG5′用HindⅢ-BamHⅠ切斷由此產(chǎn)生的連接產(chǎn)物，以產(chǎn)生790堿基對(duì)片段，分離所述790堿基片段，用由BamHⅠ-XmaⅠ切斷質(zhì)粒pLS3得到的440堿基對(duì)片段和由HindⅢ-XmaⅠ切斷質(zhì)粒pLS3得到的～8.0仟堿基片段，在有T4連接酶存在下，連接所述的790堿基對(duì)片段，用由此產(chǎn)生的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑選抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化株，和從所述的轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒pXX11。
專利摘要
解脂亞羅威阿(YARROWIA LIPOLYTICA)的XPR2和LEU2基因順序的排列，重組體解脂亞羅威阿無(wú)性繁殖的載體，包括編碼表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)和其他多肽的異源DNA；用XPR2基因啟動(dòng)子、堿性蛋白質(zhì)前源區(qū)和XPR2終止密碼子區(qū)等整合表達(dá)載體，能夠在已轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿的細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)和分泌細(xì)胞外異源蛋白質(zhì)；解脂亞羅威阿轉(zhuǎn)化株包括所述的載體和質(zhì)粒；并提供制備載體的方法。
文檔編號(hào)C12N15/62GK86106522SQ86106522
公開(kāi)日1987年9月16日 申請(qǐng)日期1986年10月17日
發(fā)明者蘭斯·史蒂文·維多, 約翰·羅伯特·德齊, 阿瑟·歐內(nèi)斯特·弗蘭克 申請(qǐng)人:美國(guó)輝瑞有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan