專利名稱:雜交瘤細胞系及其產(chǎn)生的抗人多能粒細胞集落刺激因子單克隆抗體的制作方法
一般地說，本發(fā)明涉及在分離和定量檢測生物性液體中造血生長因子的免疫學技術(shù)中所應(yīng)用的材料和方法。具體地說，就是包括由新的雜交瘤細胞系(以A.T.C.C.HB-8957，A.T.C.C.HB-8958，A.T.C.C.HB-8959，A.T.C.C.HB-8960，A.T.C.C.HB-8961和A.T.C.C.HB-8962為例)產(chǎn)生的、能與造血生長因子起特異性反應(yīng)的單克隆抗體，以及應(yīng)用這些抗體在親和純化技術(shù)中分離造血生長因子，檢測造血生長因子和應(yīng)用免疫學技術(shù)研究這些生長因子。更明確地說，本發(fā)明涉及與天然的和重組的人多能粒細胞集落刺激因子(hpG-CSF)特異性反應(yīng)的單克隆抗體。
人的成血(造血)系統(tǒng)負責各種白細胞(包括中性白細胞，巨噬細胞及嗜堿細胞/肥大細胞)，紅細胞和凝血形成細胞(巨核細胞/血小板)的更新。據(jù)估計，一般男性成人的造血系統(tǒng)每年生4.5×1011左右的粒細胞和紅細胞，這相當于每年將全部體重更新一次。Dexter等，BioEssays，2，154-158(1985)。
據(jù)信，小量祖始“干細胞”向各種血細胞系的分化以及這些血細胞系驚人的增殖和最終分化成為成熟的血細胞都是由少量的特定造血生長因子所負責。因為造血生長因子僅以極微量的形式存在，迄今為止檢測與鑒別這些因子所應(yīng)用的一套方法，都僅是根據(jù)不同因子對人工培養(yǎng)細胞的不同刺激效應(yīng)來區(qū)分它們。結(jié)果，創(chuàng)造出大量的名稱來命名實際上數(shù)目很少的因子。由此造成的混亂可從下面的例子中窺見一斑IL-3(白細胞介素3)，BPA(多集落促發(fā)活性)，multi-CSF(多集落刺激因子)，HCGF(造血細胞生長因子)，MCGF(肥大細胞生長因子)和PSF(P細胞刺激因子)等，目前認為這些皆適用于一種鼠類造血生長因子的縮寫詞。Metcalf，Science，229，16-22(1985)。
遺傳重組技術(shù)的應(yīng)用已從這種混亂中獲得某些條理。例如，刺激產(chǎn)生紅細胞的人紅細胞生成素的氨基酸和脫氧核糖核酸的順序已被獲得(見Lin，PCT公布的85/02610號申請書1985年6月20日公布)。重組方法也已被用于分離人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和人巨噬細胞特異性集落刺激因子(CSF-1)的互補脫氧核糖核酸(見Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，4360-4364(1985);Wong等，Science，228，810-814(1985)和Kowasaki等，Science，230，291-296(1985)。
一個稱為人多能集落刺激因子(hpcsf)或多能生成素(pluripoietin)的人造血生長因子已被證明存在于命名為5637的人膀胱癌細胞系的培養(yǎng)基中，該細胞系在一些限制性條件下寄存在馬里蘭州羅克維爾的美國典型培養(yǎng)物收集中心(American Type Culture Collection)，貯存號為HTB-9。據(jù)報告從該細胞系純化的人多能集落刺激因子在用人骨髓原祖細胞所進行的測定中刺激了多能祖始細胞的增殖和分化，最終導(dǎo)致所有主要類型血細胞的產(chǎn)生。Welte等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)，82，1526-1530(1985)。
初步研究表明在人粒細胞-巨噬細胞集落形成單位試驗的頭7天期間，被鑒定為人多能集落刺激因子，主要具有粒細胞集落刺激活性。
另一個被命名為人集落刺激因子β的因子(CSF-β)，也是從人膀胱癌細胞系5637中分離得到。該因子被認為是一種125Ⅰ標記的鼠類粒細胞集落刺激因子與WEHI-3BD+細胞結(jié)合的競爭物，并具有與非標記鼠類粒細胞集落刺激因子相同的劑量-反應(yīng)關(guān)系(Nicola等，Nature，314，625-628(1985)。這種劑量-反應(yīng)關(guān)系以前曾被報告為非標記鼠類粒細胞集落刺激因子所獨有，并且為諸如巨噬細胞集落刺激因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素3所不具備的(Nicola等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，81，3765-3769(1984))。還可參考Metcalf等，Leukemia Research9，No.5，521-527(1985)。集落刺激因子β和粒細胞集落刺激因子在諸多集落刺激因子中占獨特地位，還因為它們都具有誘導(dǎo)WEHI-3BD+細胞分化的高度能力(Nicola等，Immunology Today，5，76-80(1984)。高濃度粒細胞集落刺激因子刺激混合的粒細胞-巨噬細胞集落形成細胞(Nicola等，同上)，其結(jié)果與人骨髓加人多能集落刺激因子培養(yǎng)14天后出現(xiàn)粒細胞性、單核細胞性、混合粒細胞/單核細胞性和嗜酸細胞性集落(GEMM集落形成單位)的初步結(jié)果一致。集落刺激因子β也被描述為能在用小鼠骨髓細胞進行的測定中刺激嗜中性粒細胞集落形成，后一性質(zhì)已是鑒定粒細胞集落刺激因子的一個標準。根據(jù)這些相似性，人集落刺激因子β已被認為就是粒細胞集落刺激因子，見Nicola等，Nature，314，625-628(1985)。
根據(jù)具有共同的性質(zhì)這一點，看來Nicola等的人集落刺激因子β(文獻見前)和Welte等的人多能集落刺激因子(文獻見前)是同一個因子。應(yīng)正確地稱為人多能粒細胞集落刺激因子(hpG-CSF)。
具有人多能粒細胞集落刺激因子的部分或全部一級結(jié)構(gòu)構(gòu)象及其一種或多種生物學性質(zhì)的、由重組體產(chǎn)生的新多肽已在1985年8月23日作為“多能粒細胞集落刺激因子的生產(chǎn)”而提出的、共同擁有和共同末決的第768959號美國專利申請書(列此備考)中公開。同時被公開的有編碼這些多肽的脫氧核糖核酸順序和轉(zhuǎn)化的宿主細胞以及用重組方法合成這些多肽的步驟。
與本發(fā)明的背景有關(guān)的是當前的研究集中在雜交瘤技術(shù)上。目的是為獲得能分泌針對一個既定抗原的高特異性單克隆抗體的腫瘤細胞系。產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)在此研究領(lǐng)域中為人所普遍熟知，其技術(shù)步驟的典型描述可在下列文獻中查到Wands J.R.和Zurawski V.R.，Gastroenterology，80，225(1981);Marshak-Rothstein等，J.Immunol.122，2491(1979);Oi，V.T.和L.A.Herzenberg，“產(chǎn)生免疫球蛋白的雜交細胞系”，載于Mishell，B.B.和S.M.Shiigi編著的《細胞免疫學方法選編》一書中，舊金山，弗里曼出版公司，1979年以及Goding的“雜交瘤的抗體產(chǎn)生”，J.Immunol.Meth，39，285-308(1980)。簡要總結(jié)如下從預(yù)先注射過有關(guān)抗原的動物脾臟中分離出淋巴細胞，并在聚乙二醇存在下誘導(dǎo)其與骨髓瘤細胞融合。數(shù)以千計的“雜交”骨髓瘤細胞在融合過程中產(chǎn)生。測定每個“雜交瘤”細胞培養(yǎng)的上清，以確定是否存在所需抗體活性。當在某個細胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)這種抗體活性時，即用有限稀釋法對其進行克隆化，并再次對每個克隆分別進行上清活性的測定。
由于具有高度特異的免疫學性質(zhì)，用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體已被建議作為診斷和治療劑以及用來從粗制品中親和純化出具有特異性交叉反應(yīng)抗原的蛋白質(zhì)，例如可參見Trends in Biote-chnology，3，No.7(1985年7月)，及第4465624、4514505和4514507號美國專利。
盡管迫切需要特異性單克隆抗體以便用來檢測、分離、純化和研究諸如人多能粒細胞集落刺激因子這樣的造血生長因子，至今為止尚無成功地應(yīng)用雜交瘤技術(shù)來獲得抗人多能粒細胞集落刺激因子單克隆抗體的成功報告。
本發(fā)明首次提供了可產(chǎn)生在抗原抗體反應(yīng)中能與人多能粒細胞集落刺激因子起特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。做為例證，本發(fā)明提供了新的鼠源雜交瘤細胞系A(chǔ).T.C.C.HB-8957，A.T.C.C.HB-8958，A.T.C.C.HB-8959，A.T.C.C.HB-8960，A.T.C.C.HB-8961和A.T.C.C.HB-8962，每個細胞系都產(chǎn)生一個作為培養(yǎng)上清中的一種成分形式存在的，可與人多能粒細胞集落刺激因子起特異反應(yīng)的單克隆抗體。雜交瘤細胞系A(chǔ).T.C.C.HB-8957，A.T.C.C.HB-8958，A.T.C.C.HB-8959，A.T.C.C.HB-8960，A.T.C.C.HB-8961和A.T.C.C.HB-8962，目前存放在美國典型培養(yǎng)物收集中心(馬里蘭州20852，羅克維爾市帕克勞恩路12301號)。
在本發(fā)明的實踐中，雜交瘤細胞系的產(chǎn)生采用在Oi和Herzenberg的“產(chǎn)生免疫球蛋白的雜交細胞系”(見前)和Goding的“雜交瘤的抗體產(chǎn)生”(J.Immunol.Meth.1980年第39卷第285-308頁)中描述的標準免疫學技術(shù)。用天然人多能粒細胞集落刺激因子超免疫的小鼠的脾細胞，在聚乙二醇存在下與一個小鼠骨髓瘤細胞系相融合。對每個有雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)上清進行測定，以確定有無所需的抗體活性存在。篩選出的雜交瘤細胞被克隆化以便擴增成為一個細胞系，后者在其生長的上清中產(chǎn)生具有高特異性抗人多能粒細胞集落刺激因子活性的抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體在免疫學技術(shù)中可用于從天然或重組來源的材料中親和純化和分離出人多能粒細胞集落刺激因子(以及擁有共同或相關(guān)決定簇的其他造血生長因子)，在此技術(shù)中，一個預(yù)先選擇的抗體被固相化(例如固化在一個層析柱上)，然后使原材料與固相抗體接觸。人多能粒細胞集落刺激因子或具相關(guān)抗原性的物質(zhì)可與固相抗體結(jié)合，然后將其以高度純化的形式從固相抗體上洗脫下來。本發(fā)明的抗體也可單獨或相互結(jié)合，或與多克隆抗體結(jié)合在免疫學技術(shù)(各種放射免疫分析，酶聯(lián)免疫吸附試驗等等)中用于定量檢測人多能粒細胞集落刺激因子。本發(fā)明的抗體或許也可在體內(nèi)應(yīng)用以結(jié)合那些過度產(chǎn)生的人多能粒細胞集落刺激因子或相關(guān)因子。本發(fā)明的其他方面，在考慮了下面的詳細描述后，更為清楚。
下面的實施例說明了在本發(fā)明中產(chǎn)生包括A.T.C.C.HB-8957、A.T.C.C.HB-8958、A.T.C.C.HB-8959、A.T.C.C.HB-8960、A.T.C.C.HB-8961和A.T.C.C.HB-8962在內(nèi)的許多雜交瘤細胞系，分離抗人多能粒細胞集落刺激因子抗體，以及擴大并鑒定這些單克隆抗體的實際過程。
更具體地說，實施例1涉及刺激小鼠以產(chǎn)生抗人多能粒細胞集落刺激因子的多克隆血清抗體、脾細胞與骨髓瘤細胞的融合和雜交瘤細胞的篩選、克隆化以及生長以及從中分離單克隆抗體。實施例2與用酶聯(lián)免疫吸附試驗，放射免疫分析以及用競爭性抑制和中和試驗來鑒定所產(chǎn)生的單克隆抗體，和用腹水方法來擴大單克隆抗體產(chǎn)量有關(guān)。實施例3描述應(yīng)用本發(fā)明的單克隆抗體來分離和純化人多能粒細胞集落刺激因子的步驟。實施例4描述了在測定技術(shù)中應(yīng)用本發(fā)明的抗體來定量檢測人多能粒細胞集落刺激因子的步驟。
實施例1A.多克隆抗血清的產(chǎn)生給每只BALB/C小鼠注射用高壓液體色譜法從人膀胱癌細胞系5637(1A6亞克隆)純化的人多能粒細胞集落刺激因子，純化方法按照第768959號美國專利申請書中實施例1(b)所描述的步驟進行。該物質(zhì)經(jīng)一個C4高壓液體色譜柱純化后，純度大于85%，在含有50%丙醇和100毫摩醋酸銨的溶液(pH7)中濃度約為60微克/毫升。開始時，給10只小鼠的每一只多點皮下注射，每每只小鼠總劑量約為0.1毫升(每鼠7.2微克的人多能粒細胞集落刺激因子)，注射物是由用快速真空法將1.2毫升的人多能粒細胞集落刺激因子溶液濃縮成0.6毫升，再通過聲處理將它和0.6毫升BACTO-弗氏完全佐劑H37Ra(DIFCO公司，產(chǎn)品目錄號311360)混合組成。18天以后，每只小鼠給予多點皮下加強注射，總劑量每只小鼠約0.15毫升(每鼠7.2微克人多能粒細胞集落刺激因子)，注射物為由1.2毫升濃縮至0.75毫升的人多能粒細胞集落刺激因子溶液與0.75毫升弗氏不完全佐劑(DIFCO公司，BACTO 0639-60-6)的混合液。
4天以后，小鼠放血，用放射免疫分析法檢查其血清以確定有無抗人多能粒細胞集落刺激因子的抗體產(chǎn)生。用于該血清試驗中的人多能粒細胞集落刺激因子約為0.5毫升，它已經(jīng)4次濃縮并有100毫摩硫酸銨和50%丙醇，純度為80%，濃度約為100微克/毫升。250微升上述溶液再被濃縮至150微升，爾后與5毫升50毫摩的碳酸根/碳酸氫根緩沖液(pH9.2)混合。在96孔板的每一孔中加入50微升，室溫下溫育2小時爾后4℃過夜。再用一個含5%牛血清白蛋白(BSA)的封閉物質(zhì)加入孔中，溫育30分鐘。待檢血清以1∶5，1∶25，1∶625和1∶3125的比例稀釋。對照血清(未經(jīng)注射的小鼠的血清)以1∶5和1∶125的比例稀釋。每孔加50微升，室溫下溫育2小時。各孔然后用洗滌液〔柯克加德和佩里實驗室(Kirkeguard & Perry Laboratories，KPL)，馬里蘭州蓋瑟斯堡市〕洗3遍。加入125Ⅰ標記的兔抗小鼠ⅠgG抗體，加入量為每孔50微升，每分鐘計數(shù)大約為199000。室溫下溫育1.5小時后各孔用洗滌液洗5次，最后用γ計數(shù)器測定孔中的放射性。
加強注射后21天，經(jīng)放射免疫分析法檢查證明正在產(chǎn)生抗人多能粒細胞集落刺激因子抗體的5只小鼠被給予第三次注射，這次免疫所用的材料與加強注射時相同，但每只小鼠給予大約10微克。
B.細胞融合在產(chǎn)生雜交瘤的技術(shù)過程中，首先將接受過免疫注射的小鼠脾弄碎以便懸浮那些產(chǎn)生抗人多能粒細胞集落刺激因子抗體的淋巴細胞。這些脾細胞與來自SP2/0骨髓瘤細胞系的細胞融合，形成雜交細胞。脾細胞與骨髓瘤細胞的胞膜融合在一起，并在最初的幾天中包圍著一個含有2個或更多個核的共同胞漿。幾天后，細胞核融合，并能同步進行有絲分裂。當這些融合細胞分裂時，數(shù)量不等的來自兩個參與融合的細胞的染色體被丟失，直到雜交瘤細胞系穩(wěn)定下來。含有次黃嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT)的培養(yǎng)基防止雜交過程中產(chǎn)生的SP2/0∶SP2/0雜交細胞或未融合的SP2/0細胞生長，而脾細胞和脾細胞雜交體或未融合的脾細胞一般在培養(yǎng)兩周后死亡。因此只有SP2/0與脾細胞融合形成的雜交細胞能在培養(yǎng)中存活。
第二次加強注射后3天，用頸脫位法處死小鼠。以70%乙醇浸泡，無菌取出其脾臟，置于一個放在冰上的陪替氏培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿內(nèi)盛杜氏改良伊格爾培基(GIBCO公司，目錄號320-1885，批號18K3252)，培養(yǎng)基中加有100單位/毫升青霉素G和100微克/毫升鏈霉素溶液(1倍液)，下稱1倍青鏈溶液〔歐文尼科學公司(Irvine Scientific)，產(chǎn)品目錄號9366〕。除去粘附在脾臟上的脂肪組織。用含2倍青鏈溶液(每毫升200單位青霉素G和200微克鏈霉素)的杜氏改良伊格氏培基洗滌脾臟兩次。并將其放入一個置于冰上的無菌袋內(nèi)。向袋內(nèi)加入由杜氏改良伊格爾培基和2倍青鏈溶液組成的溶液，將脾臟在此裝置中弄碎，然后通過四層無菌紗布濾入50毫升離心管。用40毫升含有杜氏改良伊格爾培基和2倍青鏈溶液組成的溶液沖洗袋和濾層。然后將細胞在一個IEC NH-SII型離心機(Damon/IEC部)內(nèi)以每分鐘1000轉(zhuǎn)離心10分鐘，輕輕吸去上清。細胞用含杜氏改良伊格爾培基和2倍青鏈的溶液洗2次，再用無添加劑的杜氏改良伊格爾培基洗一遍，爾后重懸于杜氏改良伊格爾培基中。
骨髓瘤細胞(SP2/0)培養(yǎng)在含有1倍青鏈和1%胎牛血清(歐文尼科學公司，目錄號3000，批號209608，熱滅活)的HB101培養(yǎng)基中，并在對數(shù)生長期中擴增3天。在IEC NH-SII型離心機上以每分鐘1000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集SP2/0細胞，用杜氏改良伊格爾培基洗滌，然后重懸在此培養(yǎng)基內(nèi)。
將脾細胞和骨髓瘤細胞以4∶1的比率混合于一只50毫升離心管中，每分鐘1000轉(zhuǎn)離心10分鐘吸去上清。然后將細胞沉塊放在一個有通風罩的37℃水浴箱內(nèi)。融化聚乙二醇(分子量1500，M.A.Biopr oducts，目錄號17780z，批號4J030)然后以1∶1體積比與杜氏改良伊格爾培基混合便成為50%溶液。按下述步驟將聚乙二醇溶液加入細胞。在第1分鐘里加入1毫升50%聚乙二醇溶液。在第2分鐘里，用一只吸管輕輕攪拌溶液，該吸管做連續(xù)的圓周運動但需避免接觸試管壁或底部。在第3分鐘里加入1毫升含有杜氏改良伊格爾培基、10%胎牛血清和1倍青鏈的溶液。在第4分鐘里再加入1毫升上述溶液。在第5和第6分鐘里再加入8毫升相同的溶液。此混合液用IEC NH-SII型離心機以每分鐘1000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，吸出離心管中的上清，再用100到150毫升含杜氏改良伊格爾培基、10%胎牛血清和1倍青鏈的培養(yǎng)基輕輕懸起細胞。將此細胞懸液加入8塊半在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)平衡過的96孔培養(yǎng)板上的大約800個孔中，每孔加0.1毫升。將培養(yǎng)板放回到溫度為37℃，二氧化碳含量為7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中。
一天以后，每孔加入100微升用杜氏改良伊格爾培基和10%胎牛血清配成的次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶脫氧核苷培養(yǎng)基。第二天從每孔吸出100微升陳舊的培基，再加入100微升新鮮的上述培基。這一過程在第2、第4、第7和第11天重復(fù)進行一次。在第14天，從每孔中吸出100微升陳舊的培基，加入100微升含1.36毫克/分升次黃嘌呤和0.76毫克/分升胸腺嘧啶脫氧核苷的次黃嘌呤-胸腺嘧啶脫氧核苷培養(yǎng)基。同樣的過程在第18、第22和第26天重復(fù)一次。在第28天，用含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾完全培養(yǎng)基進行換液。以后每周用此完全培基給培養(yǎng)物換液兩次。在第17天，用抗小鼠IgG的抗體檢查各孔有無免疫球蛋白產(chǎn)生。放射免疫分析和酶聯(lián)免疫吸附試驗的結(jié)果表明，800個孔中大約有260個孔顯示小鼠IgG明顯陽性。
實施例2A.單克隆抗體的初步鑒定為檢測產(chǎn)生抗人多能粒細胞集落刺激因子抗體克隆的存在，進行了酶聯(lián)免疫吸附試驗。用以50毫摩碳酸根/碳酸氫根緩沖液(PH9.2)稀釋的純度為90%的人多能粒細胞集落刺激因子包被96孔板，室溫下2個小時每孔加入50微升含100毫微克人多能粒細胞集落刺激因子的上述溶液，4℃下溫育過夜。各孔然后用5%牛血清白蛋白封閉液溫育處理30分鐘。
雜交瘤培養(yǎng)上清用含1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.0)稀釋，加入包被好的孔中，室溫下溫育2小時。然后用洗滌液洗3次，加入1∶300稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgG抗體(BMB公司，目錄號605-250)溫育1.5小時。各孔用洗滌液洗5次。加入過氧化物酶底物ABTS(連氨基雙乙基苯噻唑啉磺酸鹽，柯克加德和佩里實驗室)，每孔50毫微升。然后用一個Titertek Multiscan分光光度計(Flow實驗室，弗吉尼亞州麥克萊恩市)讀取各孔在414毫微米波長處的光密度值。發(fā)現(xiàn)23個孔(孔3，4，5，20，21，28，35，37，39，40，58，61，63，64，66，68，72，74，75，98，151，182和231)與還原后的人多能粒細胞集落刺激因子有明顯反應(yīng)。
對陽性孔中的雜交瘤細胞進行了正式的克隆化，即將細胞稀釋后加入另外的孔中，大約平均3個孔有1個細胞。一般來說，對一個活性孔進行正式克隆化產(chǎn)生的正式克隆似乎是同一雜交瘤細胞的亞克隆，不過在若干孔中，正式克隆化后出現(xiàn)了不同抗體亞型和反應(yīng)性質(zhì)的不同克隆群體。從同一孔獲得的亞克隆都用一個字母編號(例如從孔4獲得的克隆編號為4A，4B等等)。
應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗以確定單克隆抗體對天然的以及還原后的天然人多能粒細胞集落刺激因子的反應(yīng)性。我們利用天然的和經(jīng)十二烷基磺酸鈉/巰基乙醇變性的天然人多能粒細胞集落刺激因子，檢查了與人多能粒細胞集落刺激因子起陽性抗體反應(yīng)的孔中上清。發(fā)現(xiàn)這些克隆所產(chǎn)生的抗體與上述兩種形式的因子反應(yīng)時具有幾乎相等的特異性，說明與這些抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原決定簇可能是由蛋白質(zhì)的連續(xù)氨基酸順序(一級結(jié)構(gòu))所確定的。
B.單克隆抗體與哺乳類的和重組體的人多能粒細胞集落刺激因子的反應(yīng)性在本實施例中進行了固相放射免疫分析和酶聯(lián)免疫吸附試驗以確定活性孔雜交瘤上清與由哺乳類產(chǎn)生的以及重組體大腸桿菌產(chǎn)生的人多能粒細胞集落刺激因子的反應(yīng)性。在除了一次例外的所有實驗中，所獲得的單克隆抗體無論與哺乳類產(chǎn)生的(天然的)或和重組體產(chǎn)生的人多能粒細胞集落刺激因子都皆發(fā)生同樣良好的反應(yīng)。例外的情況涉及亞克隆35B、35D和35I，它們產(chǎn)生的抗體在直接結(jié)合實驗中與重組體材料的反應(yīng)性明顯低于與哺乳類來源的材料的反應(yīng)性。
C.檢查抗體亞類在本實施例中用放射免疫分析檢查從原先發(fā)現(xiàn)的23個活性孔獲得的正式克隆以確定其產(chǎn)生的抗體亞類。用具有不同亞類特異性的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體處理96孔板，這些抗體包括兔抗小鼠IgG1(邁爾斯實驗室，伊利諾斯州內(nèi)珀維爾市，目錄號64-360-1)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目錄號64-361)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目錄號64-362-1)，免抗小鼠IgG3(同上，目錄號64-363-1)，兔抗小鼠IgM(同上，目錄號64-365-1)和兔抗小鼠IgG(同上，目錄號65-157-2)。每孔用50微升含有約0.5微克抗體、用碳酸根/碳酸氫根緩沖液稀釋的抗小鼠免疫球蛋白抗體溶液包被，室溫下溫育2小時后4℃過液。經(jīng)5%牛血清白蛋白溶液溫育30分鐘封閉后，每孔與雜交瘤培養(yǎng)上清在室溫下共育2小時，再用洗滌液洗3次。對用抗IgG包被的孔中與每孔加入50微升125Ⅰ標記兔抗小鼠IgG抗體，共育1.5小時，而對用抗IgM包被過的孔則每孔加入50微升125Ⅰ標記兔抗小鼠ⅠgM抗體，共育1.5小時。各孔然后用洗滌液洗5次。用伽馬計數(shù)器計數(shù)。對初始23個克隆進行分析的結(jié)果表明，兩個孔(孔37和182)停止合成IgG;1個孔表現(xiàn)為IgG陽性，但在早期的篩選中并未顯出對人多能粒細胞集落刺激因子有反應(yīng)性(孔58);15個孔表現(xiàn)免疫球蛋白G1陽性(孔4c，5，28，39，40，61，63，64，66，68，72，74，75，98和231)。其中一孔的一個亞克隆5d被發(fā)現(xiàn)與抗ⅠgG3和抗ⅠgM抗體都發(fā)生反應(yīng);4個孔表現(xiàn)IgG2a陽性(孔3，4A，21和151)，1個孔IgG2b陽性(孔35)。
D.利用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入測量對人多能粒細胞集落刺激因子刺激活性的中和效應(yīng)在本實施例中，測定了抗人多能粒細胞集落刺激因子的單克隆抗體對該因子刺激3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入人骨髓細胞這一生物活性的中和能力。為此目的，重組體或天然的人多能粒細胞集落刺激因子與不同濃度的本發(fā)明中的抗體在4℃共育12小時。然后將此溶液加到低密度、非粘附的人骨髓細胞中，按照共同未決的第768959號美國專利申請書中實施例7所描述的方法進行處理。對包括克隆20A、35B、39B、40A，61D，63D，75A和151K在內(nèi)的各克隆所產(chǎn)生的抗體進行了測定，以克隆75A產(chǎn)生的抗體對人多能粒細胞集落因子刺激3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入效應(yīng)的中和效力最強，上面提到的抗體除由克隆35B產(chǎn)生者外都表現(xiàn)不同程度的對3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入的中和效應(yīng)。
E.對人多能粒細胞集落刺激因子誘導(dǎo)細胞分化活性的中和效應(yīng)在本實施例中，測定了抗人多能粒細胞集落刺激因子抗體對該因子誘導(dǎo)鼠類骨髓單核細胞白血病細胞系WEHI-3B D+分化的能力的中和效應(yīng)。各種濃度的由本發(fā)明產(chǎn)生的抗體(由克隆20A，39B，40A，61D，63D和75A產(chǎn)生)與人多能粒細胞集落刺激因子在4℃共育12小時。然后將此溶液按照共同未決的第768959號美國專利申請書中實施例7所描述的方法加至懸浮于瓊脂中的WEHI-3BD+細胞上。由克隆40A，61D和75A產(chǎn)生的抗體顯示出阻斷細胞分化的能力。因為這幾個單克隆抗體對人多能粒細胞集落刺激因子具有不同的沉淀能力，因此某些單克隆抗體具有阻斷人多能粒細胞集落刺激因子的誘導(dǎo)分化能力，而另一些單克隆抗體則否的事實不能簡單地用親和力強度不同來解釋。有意義的是，由克隆75A產(chǎn)生的單克隆抗體不僅抑制了WEHI-3BD+細胞的分化而且也抑制了細胞生長。提示該單克隆抗體也許與WEHI-3BD+細胞分泌的一種鼠類生長因子有交叉反應(yīng);或具有與其結(jié)合人多能粒細胞集落刺激因子能力無關(guān)的抗增殖效應(yīng)。
F.決定簇鑒定在本實施例中應(yīng)用125Ⅰ標記的，由克隆75A與151K產(chǎn)生的抗體和固相化的、由重組體產(chǎn)生的人多能粒細胞集落刺激因子進行了競爭性結(jié)合的研究。在這些研究中，讓其他克隆產(chǎn)生的抗體與已結(jié)合在重組體產(chǎn)生的人多能粒細胞集落刺激因子上的、放射標記的75A和151K單克隆抗體相競爭。在按照為本領(lǐng)域所熟知的方法溫育和洗滌后，以放射性計數(shù)為指標來確定75A克隆產(chǎn)生的抗體或者151K克隆產(chǎn)生的抗體從人多能粒細胞集落刺激因子上被取代下來的程度。
這些實驗的結(jié)果表明，由克隆63D.75A和151K產(chǎn)生的抗體可能都能與人多能粒細胞集落刺激因子蛋白分子上一個共同抗原決定簇互相反應(yīng)。這些實驗的結(jié)果也表明，由克隆4C、28A和35B產(chǎn)生的抗體與人多能粒細胞集落刺激因子蛋白分子上的一個或數(shù)個抗原決定簇起反應(yīng)，而克隆75A和151K產(chǎn)生的抗體并不與之發(fā)生特異性反應(yīng)。這些實驗的結(jié)果還表明，克隆40A和61D所產(chǎn)生之抗體與人多能粒細胞集落刺激因子結(jié)合的性質(zhì)不同于它和克隆4C、28A、35B、75A和151K產(chǎn)生之抗體相結(jié)合的性質(zhì)。
G.已保管的代表性細胞系所產(chǎn)生的抗體的特性由本發(fā)明提供的具有代表性的能分泌單克隆抗體的、新雜交瘤細胞系已經(jīng)委托美國典型培養(yǎng)物收集中心(馬里蘭州20852，羅克維爾市帕克勞恩路12301號)保管。這些細胞系相應(yīng)于在正式克隆化過程中產(chǎn)生的下述細胞系克隆4C(A.T.C.C HB-8962)，克隆28A(A.T.C.C.HB-8957)，克隆35B(A.T.C.C.HB-8960)，克隆63D(A.T.C.C.HB-8958)，克隆75A(A.T.C.C HB-8959)和克隆151K(A.T.C.C.HB-8961)。由這些克隆所產(chǎn)生的抗體的特性總結(jié)于下面的表1中。
表1抗原決定簇結(jié)合 中和效應(yīng) 特征大腸3H-胸苷 WEHI 相似性克隆號亞類桿菌天然 (人骨髓細胞) 3BD+375A 151K4C IgG1+ + 未做未做 - -28A IgG1+ + 未做未做 - -35B IgG2b± + - 未做 - -63D IgG1+ + ± - + +75A IgG1+ + +++ + + +151K IgG2a+ + ++ 未做 + +
H.用腹水法擴大抗體產(chǎn)量為獲得比組織培養(yǎng)法所產(chǎn)生的更濃的抗體，采用了腹水法來擴大本發(fā)明中單克隆抗體的產(chǎn)量，該法在Kenneth等人編著的《單克隆抗體，雜交瘤生物學分析中的新天地》(紐約普萊南出版公司，1981年)一書第403頁中有全面的描述。按照這一方法，用25或27號標準針頭向每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5毫升降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷，獲自Aldrich化學品公司)。降植烷處理使瘤細胞能以腹水瘤形式在腹腔內(nèi)生長。大約1-2周后，106個左右懸浮于無血清杜氏改良伊格爾培基(歐文尼科學公司)或者HB101培養(yǎng)基(漢納生物制品公司，加利福尼亞州伯克利市)的雜交瘤細胞被注入腹腔。每個克隆都按上述程序注入小鼠。
注射雜交瘤細胞大約1-3周后，在皮膚上做小切口，用吸管從腹腔中吸出腹水。腹水經(jīng)離心澄清后凍存。腹水抗體可通過45%硫酸銨沉淀和蛋白A-瓊脂糖色譜進一步純化除去腹水白蛋白。
實施例3分離與純化造血細胞生長因子通過提供高特異和高反應(yīng)性的抗人多能粒細胞集落刺激因子的單克隆抗體，本發(fā)明首次使利用本領(lǐng)域所熟知的親和純化技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)及天然哺乳類中分離人多能粒細胞集落刺激因子和造血細胞生長因子成為可能。簡單地說，推薦的分離步驟涉及將本發(fā)明的一個抗體固定在一個固相支持物(例如一個色譜柱)上，令含有人多能粒細胞集落刺激因子或造血細胞生長因子的液體與固化的抗體接觸，然后從與固相抗體相結(jié)合的免疫復(fù)合物中洗脫下純化的人多能粒細胞集落刺激因子或造血細胞生長因子。通過調(diào)整使用的特異性抗體，這一純化技術(shù)可使以正確折疊構(gòu)象形式存在的天然人多能粒細胞集落刺激因子與正確折疊的或變性的該因子相分離。人多能粒細胞集落刺激因子的類似物可被分離和加以研究，如對造血細胞生長因子分子的特異性抗原決定簇即可進行這樣的研究。
實施例4定量檢測造血細胞生長因子通過本發(fā)明提供高特異性的抗人多能粒細胞集落刺激因子的單克隆抗體，可以建立利用一個以上抗體的新的固相或液相測定方法，來定量檢測液體樣品中人多能粒細胞集落刺激因子和造血細胞生長因子含量。典型的固相測定方法包括下述步驟(1)令待測液體與固相化的第一抗體相接觸，該抗體即與液體中人多能粒細胞集落刺激因子上的一個抗原決定簇反應(yīng)形成該因子與第一抗體的免疫復(fù)合物(2)將第(1)步中形成的復(fù)合物與第二個抗體接觸，該抗體即與人多能粒細胞集落刺激因子上不同于第一個決定簇的另一個抗原決定簇反應(yīng)形成該因子與第二個抗體的免疫復(fù)合物;
(3)測定在第(2)步中所形成的免疫復(fù)合物中結(jié)合的第二個抗體的量。
液相競爭分析法涉及人多能粒細胞集落刺激因子的標記和用一個或多個本發(fā)明的抗體沉淀標記物。這樣即可以競爭結(jié)合的方式對非標記的人多能粒細胞集落刺激因子或相關(guān)的因子進行定量。這樣的測定方法最好采用兩個前述的單克隆抗體，不過也可用一個單克隆抗體和一個抗人多能粒細胞集落刺激因子的多克隆血清的抗體來建立。
可以預(yù)料，熟悉本門技術(shù)的人思考了前面所描述的具體例子之后，會想出許多對本發(fā)明實施的改進和變化。因此對他們在本發(fā)明的權(quán)利要求
中僅做出這樣一些限制。
權(quán)利要求
1.鼠類來源的雜交瘤細胞系，該細胞系在其生長的培養(yǎng)基中產(chǎn)生在抗原抗體反應(yīng)中能與人多能粒細胞集落刺激因子特異性結(jié)合的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的雜交瘤細胞系，該細胞系能夠產(chǎn)生選自IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3-組中的亞類的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的雜交瘤細胞系，該細胞系是選自A.T.C.C.HB-8957、HB-8958、HB-8959、HB-8960、HB-8961和HB-8962組成的一組細胞系。
4.由細胞系產(chǎn)生的單克隆抗體，該細胞系能在其生長的培養(yǎng)基中產(chǎn)生在抗原抗體反應(yīng)中能與人多能粒細胞集落刺激因子特異性結(jié)合的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)要求4的單克隆抗體，該單克隆抗體選自IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3-組中的一個亞類。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的細胞系是選自A.T.C.C.HB-8957，HB-8958，HB-8959，HB-8960，HB-8961和HB-8962一組細胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求
4、5或6的單克隆抗體，該單克隆抗體能夠中和人多能粒細胞集落刺激因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的WEHI 3B D+細胞分化的能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求
4、5或6的單克隆抗體，該單克隆抗體能夠中和人多能粒細胞集落刺激因子刺激骨髓細胞攝取胸腺嘧啶脫氧核苷的能力。
9.根據(jù)抗人多能粒細胞集落刺激因子的抗體特異性，以選擇性免疫反應(yīng)，從生物性液體中分離有生物活性的人多能粒細胞集落刺激因子所用的免疫學方法中，所做的改進包括應(yīng)用能在抗原抗體反應(yīng)中與人多能粒細胞集落刺激因子特異性結(jié)合的單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9的免疫學方法，其中的單克隆抗體是選自IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3的一組中的一個亞類。
11.根據(jù)權(quán)利要求
9的免疫學方法，其中的單克隆抗體是選自A.T.C.C.HB-8957、HB-8958、HB-8959、HB-8960、HB-8961和HB-8962組成的一組細胞系中的細胞系產(chǎn)生的。
12.根據(jù)抗人多能粒細胞集落刺激因子的抗體特異性，以一種或多種選擇性免疫學反應(yīng)，從生物性液體中定量檢測人多能粒細胞集落刺激因子所用的免疫學方法中，所做的改進包括應(yīng)用一種或多種能在抗原抗體反應(yīng)中與人多能粒細胞集落刺激因子特異性結(jié)合的單克隆抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的免疫學方法，其中的單克隆抗體是選自IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3-組中的一個亞類。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12的免疫學方法，其中的單克隆抗體是選自A.T.C.C HB-8957、HB-8958、HB-8959、HB-8960、HB-8961和HB-8962組成的一組細胞系中的細胞系產(chǎn)生的。
專利摘要
鼠類來源的雜交瘤細胞系和由該細胞系產(chǎn)生的、單克隆的抗人多能粒細胞集落刺激因子的抗體物質(zhì)。在免疫學方法中單獨或聯(lián)合應(yīng)用上述單克隆抗體物質(zhì)來分離人多能粒細胞集落刺激因子和定量檢測液體樣品中的人多能粒細胞集落刺激因子。
文檔編號C12P21/08GK86107666SQ86107666
公開日1987年9月30日 申請日期1986年12月8日
發(fā)明者戴維·張, 布魯斯·阿特羅克 申請人:柯瑞英-艾格公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan