專利名稱：聚合物鍵接的喜樹堿衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗癌活性的水溶性聚合物鍵接的喜樹堿和聚合物鍵接的喜樹堿衍生物，制備它們的方法及含有它們的藥物組合物。
喜樹堿是一種從喜樹的葉和樹皮分離出來的生物堿；喜樹堿的其它類似物也是已知的并能通過從喜樹堿進(jìn)行半合成或通過總體合成來制備參見J.Amer.Chem.Soc.94(10)，3631(1972)；J.Chem.Soc.D(7)，404(1970)；US—A—4,981,969(1991年1月1日)；US—A—5,049,668(1991年9月17日)。
喜樹堿具有由稠環(huán)體系組成的五環(huán)結(jié)構(gòu)，稠環(huán)形成喹啉環(huán)(環(huán)A和B)，吡咯烷環(huán)(環(huán)C)，吡啶酮環(huán)(環(huán)D)和α—羥基—δ—內(nèi)酯部分(環(huán)E)。喜樹堿和幾種其A環(huán)被取代的衍生物都對各種固體癌(細(xì)胞)譜系，包括耐臨床上可使用的化學(xué)治療劑的細(xì)胞譜系，表現(xiàn)出抗癌活性[參見J.Clin.Phamacol.30，770(1990)；Cancer Chemoth-er.Pharmacol.28，192(1991)]。
喜樹堿，以及其絕大多數(shù)衍生物，由于醌氮原子的弱堿性，幾乎不溶于適合腸胃外施藥的賦形劑。為了溶解喜樹堿，曾推出幾種水溶性前藥(Prodrug)，如20—O—磷酸酯或20—O—酰氨基衍生物，它們能被無機(jī)酸質(zhì)子化，從而具有水溶解性參見US—A—4,943,579(1990年7月24日)。在施用這些藥物時，會伴隨而來一些毒副作用，包括血液和胃腸毒副作用。已經(jīng)作了許多嘗試，通過改善其結(jié)構(gòu)來改進(jìn)喜樹堿的治療指數(shù)。
本發(fā)明提供水溶性的及在體內(nèi)具有抗癌活性和低毒性的喜樹堿的聚合共軛體。更具體地說，本發(fā)明提供了聚合共軛體，它在這里表示為A并主要由以下單元組成(i)60～99摩爾％的由以下通式1表示的N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰胺單元 (ii)1～40摩爾％的由以下通式2表示的20—O—(N—甲基丙烯酰甘氨酰—氨基?；?喜樹堿單元 其中[A]是具有由至少三個原子隔開的各端氨基和羰基的間隔基，O—CPT表示喜樹堿殘基，喜樹堿的C—20基團(tuán)連接到司隔基[A]的端羰基；和(iii)0～10摩爾％的由以下通式3表示的N—甲基丙烯酰甘氨酸或N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰甘氨酰胺單元 其中Z表示羥基或結(jié)構(gòu)式為—NH—CH2—CH(OH)—CH3的殘基。
本發(fā)明還提供了制備如上定義的聚合共軛體的方法，該方法包括讓通式7的20—O—酰氨基喜樹堿衍生物H[A]-O-CPT7其中[A]和O—CPT如上所定義，與主要由以下單元組成的聚合物進(jìn)行反應(yīng)(i)60～99摩爾％的由通式1表示的N—(2—羥丙基)甲基丙烯酰胺單元 和
(iv)40～1摩爾％的由通式4表示的N—甲基丙烯酰甘氨酸單元 其中R2是(a)活性酯殘基或(b)羥基；及選擇性地用1—氨基—2—丙醇置換剩余活性酯基。
該聚合共軛體A含有比例達(dá)60摩爾％或更高的，例如至少80摩爾％或至少85摩爾％的，由通式1表示的N—(2—羥丙基)甲基丙烯酰胺單元。這些單元可以以91—98摩爾％的量存在。該共軛體還可含有1～40摩爾％的由通式2表示的20—O—(N—甲基丙烯酰甘氨?！被；?喜樹堿單元，例如1～20％摩爾％的此類單元。該共軛體可含有1～8摩爾％的，例如2～6摩爾％的這些單元。
間隔基[A]可以是3～12，例如6～9個原子長。一般地，該基團(tuán)易發(fā)生細(xì)胞內(nèi)水解。優(yōu)選其耐細(xì)胞內(nèi)水解。該間隔基可以是多肽間隔基，例如1～4或2～4個氨基酸殘基那樣長。該間隔基可以是二肽、三肽或四肽。
優(yōu)選的間隔基[A]是選自Ala-Gly，Phe-Gly，Phe-Phe，Leu-Gly，Val-Ala，Phe-Ala，Leu-Phe，Leu-Ala，Phe-Leu-Gly，Phe-Phe-Leu，Leu-Leu-Gly，Phe-Tyr-Ala，Phe-Gly-Phe，Phe-Phe-Gly和Phe-Leu-Gly-Phe。此外，間隔基[A]是結(jié)構(gòu)式為HN—Y—CO—的基團(tuán)，其中Y是C3—C6直鏈或支鏈烷基，如—(CH2)n—，這里n是3，4，5或6。
此外，間隔基[A]是結(jié)構(gòu)式為Ala-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Phe-NH-Y-CO-，Leu-Gly-NH-Y-CO-，Val-Ala-NH-Y-CO-，Phe-Ala-NH-Y-CO-，Leu-Phe-NH-Y-CO-，Leu-Ala-NH-Y-CO-，Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-，Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO，Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-，Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO-或Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO-的基團(tuán)，其中Y具有與以上同樣的定義。
喜樹堿殘基由O—CPT表示。該喜樹堿可以是喜樹堿本身或其類似物如A—環(huán)類似物。這種A—環(huán)類似物因而是在A—環(huán)上被取代的喜樹堿。該喜樹堿可以是天然S形式或R形式，或者是R和S形式的混合物(外消旋混合物)。適宜的喜樹堿殘基O—CPT由通式5表示 其中R1表示，例如氫、羥基、硝基或氨基或者連接到A環(huán)上兩相鄰碳原子上的亞甲二氧基。優(yōu)選R1表示氫，9—，10—，11—或12—羥基，9—或10—硝基，9或10氨基或10，11—亞甲二氧基。更優(yōu)選的是通式6的喜樹堿殘基 其中R1是如上所定義。
優(yōu)選地，通式2單元以1—10摩爾％，如0.5—5摩爾％的量存在。同時還優(yōu)選地，喜樹堿含量占聚合共軛體體的1—10％(W/W)，更優(yōu)選4—8％(W/W)。
本發(fā)明還提供如上所定義的通式7的20—O—酰氨基—喜樹堿衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備通式7的20—O—酰氨基—喜樹堿衍生物的方法，該方法包括在活化劑如4—二甲氨基吡啶存在下，讓喜樹堿與通式8的N—保護(hù)了的氨基酰基衍生物進(jìn)行縮合R3-[A]-P 8其中[A]如上所定義，以及R3表示氨基保護(hù)基，如t—boc，CBZ，F(xiàn)MOC，三苯甲硅烷基、二苯亞甲基或三苯甲基，和P是活化酯殘基，如對—硝基苯氧基，五氟苯氧基或N—羥基琥珀酰亞胺基，制得由通式9表示的N—保護(hù)了的—20—O—(酰氨基)化合物R3-[A]-[O-CFT]其中R3，[A]和[O—CPT]是如上定義；和從所得化合物脫去N—保護(hù)基通式8的化合物的制備是采用了文獻(xiàn)中已知的標(biāo)準(zhǔn)合成工藝步驟。合適的通式8的N—保護(hù)了的—氨基?；苌锇∟—三苯甲基—L—苯基丙酰胺基—L—亮氨酰甘氨酸(對硝基苯)酯(8a)或N—三苯甲基—甘氨酰—L—亮氨?！拾彼?對硝基苯)酯(8b)，或6—N—三苯甲基—己酸(對硝基苯)酯(8c)。一些通式8的衍生物及它們的制備方法還在我們等待審查的國際專利申請PCT/EP94/01100中有敘述。
因此，比方說，在活化劑如4—二甲氨基吡啶的存在下，喜樹堿能夠在無水溶劑如無水二甲基甲酰胺或二甲亞砜中與摩爾過量的，例如接近5倍摩爾過量或更多的，尤其2摩爾當(dāng)量的通式5的N—保護(hù)了的—氨基?；苌镞M(jìn)行反應(yīng)。以這種方式，該保護(hù)了的氨基酸被連接在喜樹堿分子的C—20位上。該反應(yīng)一般可進(jìn)行8—24小時。該反應(yīng)一般在15—40℃的溫度下進(jìn)行。應(yīng)該注意，在此類反應(yīng)條件下，9—氨基喜樹堿因9—氨基的弱堿性而能夠部位專一地在C—20—羥基位發(fā)生反應(yīng)。
氨基保護(hù)基R3可由適當(dāng)?shù)慕獗Ｗo(hù)劑來脫除，得到通式7的20—O—酰氨基—喜樹堿衍生物。因而，解保護(hù)可由中等強(qiáng)度的酸來實(shí)現(xiàn)，如用乙酸處理，或者由還原來實(shí)現(xiàn)。從而可使用氫解方法。
通式7的20—O—酰氨基—喜樹堿衍生物與主要由60—99摩爾％通式1的N—(2—羥丙基)—甲基丙烯酰胺單元和40—1摩爾％通式4的N—甲基丙烯酰胺單元所組成的聚合物的縮合，以及隨后可以進(jìn)行的剩余活性酯基的置換，都是在能夠保留喜樹堿和間隔基[A]之間的鍵合性質(zhì)及保留共軛體的性質(zhì)的條件下進(jìn)行的。
按照在Makromol.Chem.178，2159(1977)中所描述的那樣，主要由60—99摩爾％通式1的N(2—羥丙基)—甲基丙烯酰胺單元和40—1摩爾％通式4的N—甲基丙烯酰甘氨酸單元組成的聚合物是通過N—(2—羥丙基)甲基丙烯酰胺與N—甲基丙烯酰甘氨酸或N—甲基丙烯酰甘氨酸活性酯衍生物進(jìn)行共聚而制備的。R2可以表示苯氧基，它能夠在苯環(huán)上被一個或多個吸電子基團(tuán)取代。適宜的吸電子基團(tuán)的例子包括硝基和鹵素。R2優(yōu)選是離去基團(tuán) 其中L是吸電子基團(tuán)，例如—NO2或鹵素如氟或氯，和m是1—5之間的整數(shù)，一般為1—3，優(yōu)選為1或2。R2優(yōu)選是對硝基苯氧基或2，4—二氯苯氧基。
優(yōu)選地，在其中R2表示(a)活性酯殘基的聚合物和通式7的化合物之間發(fā)生的制備本發(fā)明聚合物共軛體的反應(yīng)是在無水極性有機(jī)溶劑如二甲基甲酰胺或二甲亞砜中進(jìn)行的。該反應(yīng)一般進(jìn)行8—24小時。該反應(yīng)一般在15—30℃的溫度下，優(yōu)選在室溫下進(jìn)行15小時；然后，剩余活性酯的氨解可以在室溫下在1—氨基—2—丙醇存在下進(jìn)行0.5—1小時。該共軛體可適當(dāng)?shù)赜帽恋恚苡谝掖贾?，然后用丙酮沉淀?br> 在另一個方法中，為了制備本發(fā)明的聚合物共軛體，在其中R2表示羥基(b)的聚合物和通式7的化合物之間發(fā)生的反應(yīng)是在縮合劑2—乙氧基—1—乙氧基羰基—1，2—二氫喹啉存在下在無水極性溶劑如二甲基甲酰胺或二甲亞砜中進(jìn)行的。該反應(yīng)一般進(jìn)行8至24小時。該反應(yīng)一般在15—30℃的溫度下，優(yōu)選在室溫下反應(yīng)15小時；然后，共軛體用丙酮沉淀，溶于乙醇中，接著用丙酮沉淀。
例如，其中R2表示活性酯殘基(a)的、在無水二甲亞砜中以15％(重量/體積)的濃度提供的聚合物是在室溫下用3％(W/V)的通式7的20—O—氨基酰基喜樹堿衍生物處理15小時。然后，加入0.1％(W/V)的1—氨基—2—丙醇，該反應(yīng)混合物在室溫下保持1小時。該共軛體可用丙酮沉淀，然后以10％(W/V)的濃度用絕對乙醇溶解，接著再次用丙酮沉淀，得到根據(jù)本發(fā)明的中性喜樹堿共軛體。
在另一個實(shí)施例中，其中R2表示羥基(b)的、在無水二甲亞砜中以15％(重量/體積)的濃度提供的聚合物是在室溫下在1.3％(W/V)的2—乙氧基—1—乙氧基羰基1，2—二氫喹啉存在下用3％(W/V)的通式7的20—O—氨基酰基喜樹堿衍生物處理15小時。然后，加入丙酮引起沉淀，以10％(W/V)的濃度用絕對乙醇溶解沉淀物，接著再次加入丙酮引起沉淀，得到根據(jù)本發(fā)明的聚合共軛體。
在本發(fā)明的聚合共軛體中活性藥物如喜樹堿或其A—環(huán)類似物的含量是通過HPLC或吸收光譜分析法測定的。
在本發(fā)明中描述的喜樹堿及其A—環(huán)類似物的聚合物共軛體具有改進(jìn)的水溶性和較低的毒性。該共軛體表現(xiàn)出良好的水溶性、生物相容性并通過酶催裂解將喜樹堿釋放在血漿中或在內(nèi)化后進(jìn)入細(xì)胞中。
生物活性N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰胺，20—O—[N—甲基丙烯酰甘氨?！狶—苯基丙酰胺基—L—亮氨酰甘氨酰]喜樹堿和N—(2—羥丙基)甲基丙烯?；拾滨０?A2)的共聚物對移植有HT29/ColonCarcinoma(表1)的裸(nude)鼠和對有早期和后期M5076鼠網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)瘤(表2和表3)的鼠進(jìn)行試驗(yàn)，與游離的喜樹堿(CPT)相比較。
當(dāng)與喜樹堿對比時，對于聚合物鍵接的喜樹堿衍生物A2來說，在所有的實(shí)驗(yàn)中都觀察到了很高的活性。值得注意的是，在對HT29/Colon Carcinoma的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)治愈的鼠。
用同樣的治療程序測試A2和CPT的抗癌活性。
應(yīng)該注意，聚合物鍵接的喜樹堿A2被發(fā)現(xiàn)高度溶于水并能溶于鹽水及可以靜脈(iv)注射，而CPT溶于水和吐溫80(Tween 80，聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇單月桂酸酯)的混合物中。
藥物制劑和施用化合物A2在使用前溶于蒸餾水中，其濃度在370nm(EL％57.18)處用分光光度分析法檢測。喜樹堿(CPT)溶于有10％吐溫的滅菌水中。
以體重的10ml/kg的容積進(jìn)行靜脈(iv)注射治療，對比鼠用滅菌水進(jìn)行治療。
瘤使用15—20mg瘤漿將HT29 Colon Carcinoma皮下(S.C.)移植在athymic Swiss/nu/mice體內(nèi)。
M5076鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤由一連串i、m、(肌內(nèi))通道保藏并被皮下移植(5×105細(xì)胞/鼠)在可相容的C57B1/6鼠體內(nèi))。
所有的動物來自Charles River Calco，Como，Italy。
普通鼠10只一組，無胸腺鼠8只一組普通鼠重量為20—22g，并保持在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下。
該鼠群被定期試驗(yàn)一組病原體(包括鼠肝炎，Sendai Virus和Myco Plasma Pulmonis)的抗體的消失。
抗癌活性和毒性的評價由長規(guī)測量鑒測瘤的生長并根據(jù)Geran等(參見Cancer Chem.Rep.，Part3，3(2)ed.3，PP1—103，1972)估計(jì)瘤重量?？拱┗钚允褂孟率奖磉_(dá)為瘤生長的抑制百分?jǐn)?shù)(％T/l) 使用下式計(jì)算存活時間(T/C％)的中等增長 治愈的鼠是在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時沒有瘤的鼠。
以體重的減少和全部尸體剖檢為基礎(chǔ)，主要根據(jù)脾臟和肝的大小的減少來評價毒性。
表1.化合物A2與喜樹堿(CPT)對HT29/Colon Carcinoma的抗癌活性的比較
(1)表示為CPT當(dāng)量。
(2)毒死鼠的數(shù)目/鼠的總數(shù)(3)瘤移植90天后無瘤的鼠。
表2.化合物A2與喜樹堿(CPT)對早期M5076鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤的抗癌活性的比較
(1)表示為CPT當(dāng)量。
(2)毒死鼠的數(shù)目/鼠的總數(shù)
(3)在最后治療后的一星期時間估計(jì)瘤抑制率％。
表3.化合物A2與喜樹堿(CPT)對后期M5076鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤的抗癌活性的比較。在第16、20、24、28、31、35天的治療程序iv(靜脈注射)
(1)表示為CPT當(dāng)量。
(2)毒死鼠的數(shù)目/鼠的總數(shù)(3)在第34天評估瘤抑制率％。
毒性N—(2—羥丙基)甲基丙烯酰胺，20—O—[N—甲基丙烯?；拾滨！狶—苯基丙酰胺基—L—亮氨酰甘氨酰]喜樹堿和N—(2—羥丙基)甲基丙烯酰甘氨酰胺(A2)的共聚物的毒性是以健康C57B1/F鼠進(jìn)行評價的，與喜樹堿比較靜脈注射治療。
C57 B1/F鼠的LD10(1)和LD50(2)值如下
(1)LD10誘發(fā)10％的死鼠的劑量。
(2)LD50誘發(fā)50％的死鼠的劑量。
聚合物鍵接的喜樹堿衍生物A2的低毒性使得能施用較大劑量的產(chǎn)物并能達(dá)到與喜樹堿相當(dāng)?shù)幕蚋玫男Ч?br> 該聚合物鍵接的喜樹堿具有抗癌活性。它們抑制topo isomeraseI。它們尤其用于治療白血病及結(jié)腸癌和直腸癌。
因此，人或動物可由這樣一種方法進(jìn)行治療包括向他(它)們施用治療有效量的本發(fā)明的聚合共軛體。從而可以改善病人或患病動物的狀況。
所使用的劑量范圍將取決于施藥途徑和取決于患者的年齡、重量和狀況。該聚合物共軛體一般通過腸胃外途徑施藥，例如肌內(nèi)注射、靜脈注射或通過快速濃注施藥。適宜的劑量范圍是每m2體表面積1—1000mg喜樹堿當(dāng)量，例如10—50mg/m2。
該聚合共軛體可與藥理上可接受的載體或稀釋劑一起配成藥物組合物。該聚合共軛體一般經(jīng)配制后用于腸胃外施藥，例如溶于水或生理鹽水中用于注射。
下面實(shí)施例是為了說明本發(fā)明，而不是限制定。在本說明書的上下文中，氨基酸殘基都是以根據(jù)Eur.J.Biochem，138，9—37，1984的三字母編碼表示的。
以如下方式測試聚合共軛體在鼠或人的血漿中的穩(wěn)定性向1ml鼠或人的血漿中，加入不同濃度的本發(fā)明聚合共軛體，然后在適當(dāng)?shù)臅r間(24，48，72，96小時)收集100μl樣品并在—70C下貯藏直到進(jìn)一步處理為止。
每一樣品通過加入100μl的0.25M磷酸，500μlCH3CN和700μl乙酸乙酯及在4℃下劇烈振蕩20分鐘來進(jìn)行萃取。然后，樣品以15000×g離心旋轉(zhuǎn)10分鐘，分離出上層清液。向殘余物中加入300μlCH3CN和500μl乙酸乙酯，以15000×g離心旋轉(zhuǎn)10分鐘。分離出上層清液。合并有機(jī)相，使用高真空離心進(jìn)行蒸發(fā)。通過加入500μlMeOH/水(70/30，體積比)(PH為2)回收樣品，并注射入HPLC裝置(高效液體色譜)中測定藥的總百分含量。
HPLC體系柱μBondapak C10(Waters)3.9×300mm流速1.5ml/mmin檢測器Spectrophotometer Fluorescence 650—40(Perkin Elmer)；發(fā)射434nm(窄縫5)；激發(fā)370nm(窄縫5注射10μl流動相51.5％MeOH，47.5％水，1％磷酸實(shí)施例16—N—三苯甲基—己酸對硝基苯酯(8C)(C6H5)3C-NH(CH2)5CO-OC6H4pNO28C6—氨基己酸(6.5g，50mmol)懸浮在干燥氯仿(75ml)和干燥乙腈(acetonitrile)(15ml)的混合物中，添加氯化三甲基硅(6.3ml，50mmol)并在劇烈攪拌下回流2小時。然后，冷卻該混合物，按順序添加三乙胺(13.7ml，100mmol).和己溶于干燥氯仿(100ml)的三苯甲基氯(14g，50mmol)。該混合物在室溫下放置過夜，然后加入甲醇(10ml)，反應(yīng)混合物在減壓下濃縮。殘余物用5％冷檸檬酸水溶液(200ml)溶解，用乙酸乙酯(200ml)萃取。分離出有機(jī)相，用冷的1N氫氧化鈉水溶液(200ml)萃取。分離出有機(jī)相，用冰冷卻，用乙酸調(diào)PH至5，然后用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。在減壓下除去有機(jī)溶劑，在從乙酸乙酯中結(jié)晶出來后，得到6—N—三苯甲基—己酸(16g)。這一物質(zhì)溶于無水四氫呋喃(150ml)和在攪拌下在0℃用對硝基苯酚(5.6g，400mmol)和二環(huán)己基碳二亞胺(8.4g，40mmol)處理1小時，然后在8℃下放置過夜。然后，過濾該反應(yīng)混合物，在0℃下冷凍2小時，再一次過濾。最后，在減壓下除去有機(jī)溶劑，殘余物用乙醚結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物8C(16.4g)。在Kieselgel(白色硅藻土載體)板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系乙醚/正己烷(1∶1，按體積)Rf＝0.6；FD-MSm/z[M＋H]＋495 H1NMR(90MHz，CDCl3)δ1.1-1.9(m，6H)；2-2.5(m，4H)；5.7-5.9(m，2H，NH，-COOH)；7.2-7.7(m，15H)。
實(shí)施例220—O(6—氨基己酰)喜樹堿(7C) 將喜樹堿(6a，R1＝H，0.7g，2mmol)溶于干燥二甲亞砜(100ml)，添加按照在實(shí)施例1中所敘述的那樣制備的6—N—三苯甲基—己酸對硝基苯酯(8C，2g，4mmol)，及4—二甲氨基吡啶(0.24g，2mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下保持48小時，然后用氯仿稀釋(400ml)，用水(3×100ml)洗滌。分離出有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，在減壓下濃縮至較小的體積。該粗物質(zhì)在硅酸柱上進(jìn)行快速色譜分離，用氯仿洗脫，得到20—O—(6—N—三苯甲基—己酰)喜樹堿(0.6g)。在Kieselgel板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系氯仿/甲醇(95∶5，按體積)Rf＝0.4。該N—保護(hù)了的衍生物在室溫下用95％的三氟乙酸(10ml)處理50分鐘。在減壓下除酸之后，用乙醚收集標(biāo)題化合物7C。收率0.4g。在Kieselgel板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(80∶20∶7∶3)Rf＝0.6。FD—MSm/Z[M＋H]＋462實(shí)施例3
20—O—(L—苯基丙酰胺基—L—亮氨?！拾滨?喜樹堿(7b) 按照前面在UK申請?zhí)?309663.4中敘述的那樣所制備的N—三苯甲基—L—苯基丙酰胺基L—亮氨酰甘氨酸對硝基苯酯(8a，1.4g，2mmol)，喜樹堿(6a，R1＝H，0.35g，1mmol)和4—二甲氨基吡啶(0.12g，1mmol)用干燥二甲亞砜(50ml)溶解，在室溫下攪拌20小時。然后，反應(yīng)混合物用氯仿(400ml)稀釋并用水(3×100ml)洗滌。分離出有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，然后在減壓下濃縮至較小的體積。該粗物質(zhì)在硅酸柱上進(jìn)行快速色譜分離，用氯仿/甲醇(99.5/0.5，按體積)的混合物洗脫。合并含有標(biāo)題化合物的N—保護(hù)了的衍生物的級分，濃縮至干燥，用75％乙酸水溶液(30ml)溶解，然后在室溫下保持1小時。反應(yīng)混合物用固體碳酸氫鈉調(diào)至PH7，然后用氯仿(400ml)萃取。在除去有機(jī)溶劑之后，標(biāo)題化合物7b從乙醚中結(jié)晶出來。收率0.16g。在Kieselge(板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系氯仿/甲醇(9∶1，按體積)Rf＝0.35。FD-MSm/z[M＋H]+6671H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.81(d，J＝6.5Hz，3H，δ-Leu)；0.82(d，J＝6.6Hz，3H，δ′-Leu)；0.98(t，J＝7.6Hz，3H，CH3-CH2)；1.25(m，1H，β-Leu)；1.39(m，1H，-Leu)；1.56(m，1H，β′-Leu)；1.98(dd，J＝6.4Hz，J＝13.5Hz，1H，β-Phe)；2.1-2.4(m，2H，CH2CH3)；2.48(d，J＝7.0Hz，1H，NH-Phe)；2.77(dd，J＝4.7Hz，J＝13.5Hz，1H，β′-Phe)；3.41(m，1H，α-Phe)；4.0-4.3(m，3H，α-Gly＋α′-Gly＋α-Leu)；5.20-5.27(two-d，J＝19.9Hz，2H，5-CH2)；5.41-5.68(two-d，J＝17.3Hz，2H，17-CH2)；6.35(t，J＝5.3Hz，1H，NH-Gly)；6.76(d，J＝7.6Hz，1H，NH-Leu)；6.8-7.3(m，21H，4×(C6H5)＋14-H)。
實(shí)施例49—氨基—20—O—(L—苯基丙酰胺基—L—亮氨?！拾滨?喜樹堿(7C) 按照在實(shí)施例3中所敘述的那樣，N—三苯甲基—L—苯基丙酰胺基—L—亮氨酰甘氨酸對硝基苯酯(8a，1.14g，2mmol)，9—氨基—喜樹堿(6b，R1＝NH2，0.363g，1mmol)，4—二甲氨基吡啶(0.12g，1mmol)在室溫下在干燥二甲亞砜(20ml)中進(jìn)行反應(yīng)，得到標(biāo)題化合物7C(0.31g)。在Kieselgel板F245(Merck)上做TLC，洗脫體系氯仿/甲醇(9∶1，按體積)Rf＝0.2；FD-MSm/z[M＋H]+682；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.82(d，J＝6.5Hz，6H，δ-Leu＋δ′-Leu)；1.00(t，J＝7.6Hz，3H，CH2CH3)；1.25(m，1H，β-Leu)；1.41(m，1H，-Leu)；1.59(m，1H，β′-Leu)；1.99(dd，J＝6.2Hz，J＝13.5Hz，1H，β-Phe)；2.1-2.4(m，2H，CH2CH3)；2.47(d，J＝6.5Hz，1H，NH-Phe)；2.79(dd，J＝4.7Hz，J＝13.5Hz，1H，β′-Phe)；3.4 3(m，1H，α-Phe)；4.0-4.3(m，5H，9-NH2＋α-Leu＋α-Gly＋α′-Gly)；5.04-5.15(two-d，J＝19.9Hz，2H，CH2)；5.39-5.66(two-d，J＝17.0Hz，2H，17-CH2)；6.44(t，J＝5.3Hz，1H，NH-Gly)；6.81(d，J＝7.6Hz，1H，NH-Leu)；6.85(m，3H，10-H+ -)；7.0-7.4(m，19H，3x(C6H5) +14-H)；7.51(m，1H，11-H)。
實(shí)施例5N—(2—羥丙基)甲基丙烯酰胺，20—O—[N—甲基丙烯酰甘氨?！?6—氨基己酰)]喜樹堿和N—(2—羥丙基)甲基丙烯酰甘氨酰胺的共聚物(A1X＝96，Y＝3，Z＝1) 按照在Makromol.Chem.，178，2159(1977)中描述的那樣所制備的含有2.7×103當(dāng)量對硝基苯酯的N—(2—羥丙基)甲基丙烯酰胺和N—甲基丙烯酰甘氨酸對硝基苯酯的共聚物(0.15g)，與按照在實(shí)施例2中描述的那樣所制備的20—O—(6—氨基己酰)喜樹堿(7C，18mg)在室溫下在干燥二甲亞砜(1ml)中反應(yīng)18小時，然后，在室溫下與1—氨基—2—丙醇(2μl)反應(yīng)1小時。然后，用丙酮(70ml)處理反應(yīng)混合物。收集沉淀，用無水乙醇(5ml)再次溶解，然后用丙酮(50ml)再次沉淀，得到含有5％(W/W)喜樹堿的標(biāo)題共軛體A1(0.14g)。在經(jīng)過血漿培育120、時后，共軛體A1釋放出10％喜樹堿。
實(shí)施例6N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰胺，20—O—[N—甲基丙烯酰甘氨?！狶—苯基丙酰胺基—L—亮氨酰甘氨酰]喜樹堿和N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰甘氨酰胺的共聚物(A2X＝96，Y＝2.2，Z＝1.8) N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰胺和N—甲基丙烯酰甘氨酸對硝基苯酯的共聚物(0.15g，含有2.7×103當(dāng)量的對硝基苯酯)和按照在實(shí)施例3中描述的那樣所制備的20—O—(甘氨?！狶—亮氨?！狶—苯基丙酰胺基)喜樹堿(7b，20mg)在干燥二甲亞砜(1ml)中進(jìn)行反應(yīng)，然后與1—氨基—2—丙醇進(jìn)行反應(yīng)(都按照在實(shí)施例6中描述的那樣)，得到含4.8％W/W喜樹堿的標(biāo)題共軛體A2(0.14g)。在經(jīng)過血漿培育60小時之后，共軛體A2釋放100％的喜樹堿。
實(shí)施例7N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰胺，9—氨基—20—O—[N—甲基丙烯酰甘氨?！狶—苯基丙酰胺基—L—亮氨酰甘氨酰]喜樹堿和N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰甘氨酰胺的共聚物(A3X＝96，Y＝3，Z＝1)
按照在實(shí)施例5中所描述的那樣，通過讓N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰胺和N—甲基丙烯酰甘氨酸對硝基苯酯的共聚物(0.15g，含有2.7×10-3當(dāng)量的對硝基苯酯)和按照在實(shí)施例4中描述的那樣所制備的9—氨基—20—O—(甘氨?！狶—亮氨酰—L—苯基丙酰胺基)喜樹堿(7C，20mg)在干燥二甲亞砜(1ml)中進(jìn)行反應(yīng)，然后與1—氨基—2—丙醇進(jìn)行反應(yīng)而制備出標(biāo)題共軛體。收率0.14g，含有6.3％W/W9—氨基—喜樹堿。在經(jīng)過血漿培育50小時之后，共軛體A3釋放出100％的喜樹堿。
權(quán)利要求
1.一種聚合共軛體，它主要由以下單元組成(i)60—99摩爾％由通式1表示的N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰胺單元 (ii)1—40摩爾％由通式2表示的20—O—(N—甲基丙烯酰甘氨?！被；?喜樹堿單元 其中[A]是具有由至少三個原子隔開的各端氨基和羰基的間隔基，O—CPT表示喜樹堿殘基，喜樹堿的C—20羥基連接到間隔基[A]的端羰基；和(iii)0—10％摩爾％由通或3表示的N—甲基丙烯酰甘氨酸或N—(2—羥基—丙基)甲基丙烯酰甘氨酰胺單元 其中Z表示羥基或結(jié)構(gòu)式為—NH—CH2—CH(OH)—CH3的殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的共軛體，其中間隔基[A]選自Ala-Gly，Phe-Gly，Phe-Phe，Leu-Gly，Val-Ala，Phe-Ala，Leu-Phe，Leu-Ala，Phe-Leu-Gly，Phe-Phe-Leu，Leu-Leu-Gly，Phe-Tyr-Ala，Phe-Gly-Phe，Phe-Phe-Gly和Phe-Leu-Gly-Phe。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的共軛體，其中司隔基[A]是結(jié)構(gòu)式為—NH—Y—CO的基團(tuán)，這里Y是C3—C6直鏈或支鏈烷基；或結(jié)構(gòu)式為 Ala-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Phe-NH-Y-CO-，Leu-Gly-NH-Y-CO-，Val-Ala-NH-Y-CO-，Phe-Ala-NH-Y-CO-，Leu-Phe-NH-Y-CO-，Leu-Ala-NH-Y-CO-，Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-，Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-，Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO，Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-，Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO-，或Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO-的基團(tuán)，這里Y具有與以上同樣的意義。
4.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的共軛體，其中O—CPT表示通式6的喜樹堿殘基 這里R1表示氫、羥基、硝基或氨基或者連接到A環(huán)上兩相鄰碳原子上的亞甲二氧基。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的共軛體，其中存在1—10摩爾％的該通式2單元。
6.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的共軛體，其中喜樹堿的含量是1—10％(W/W)。
7.一種制備按照權(quán)利要求1所定義的聚合共軛體的方法，該方法包括讓通式7的20—O—酰氨基—喜樹堿衍生物H[A]—O—CPT 7其中[A]和O—CPT與權(quán)利要求1中所定義的相同，與主要由以下單元組成的聚合物進(jìn)行反應(yīng)(i)60—99摩爾％由通式1表示的N—(2—羥基丙基)甲基丙烯酰胺單元 和(iv)40—1摩爾％由通式4表示的N—甲基丙烯酰甘氨酸單元 其中R2是(a)活性酯殘基或(b)羥基；以及可以用1—氨基—2—丙醇置換剩余活性酯基。
8.按照權(quán)利要求7定義的通式7的20—O—酰氨基—喜樹堿衍生物。
9.一種制備按照權(quán)利要求7中所定義的通式7的20—O—酰氨基—喜樹堿衍生物的方法，該方法包括讓喜樹堿與通式8的N—保護(hù)了的一氨酰基衍生物R3—[A]—P 8其中[A]是具有與權(quán)利要求1中相同的定義，R3表示氨基保護(hù)基和P是活性酯殘基，在活化劑存在下縮合，得到由通式9表示的N—保護(hù)了的—20—O—(酰氨基)化合物R3—[A]—[O—CPT] 9其中R3和[A]具有與以上相同的定義，O—CPT具有與權(quán)利要求1中相同的定義；以及從所得化合物中脫除N—保護(hù)基。
10.藥物組合物，它包括藥理上可接受的稀釋劑或載體及作為活性成分的、按照在權(quán)利要求1—6中任一項(xiàng)要求的聚合共軛體。
全文摘要
一種聚合共軛體，它主要由以下單元組成(i)60-99摩爾％由通式1表示的N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺，(ii)1-40摩爾％由通式2表示的20-O-(N-甲基丙烯酰甘氨酰-氨酰)喜樹堿單元，其中[A]是具有由至少三個原子隔開的各端氨基和羰基的間隔基，O-CPT表示喜樹堿殘基，喜樹堿的C-20羥基連接到間隔基[A]的端羰基；和(iii)0-10％摩爾％由通或3表示的N-甲基丙烯酰甘氨酸或N-(2-羥基-丙基)甲基丙烯酰甘氨酰胺單元，其中Z表示羥基或通式為-NH-CH
文檔編號C08F220/36GK1115564SQ94190775
公開日1996年1月24日 申請日期1994年9月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月8日
發(fā)明者F·安格魯希, A·蘇拉托 申請人:藥制品公司