專利名稱：?；?環(huán)糊精的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及?；?環(huán)糊精及其制備方法和應(yīng)用。
環(huán)糊精是由6、7或8個(gè)α(1-4)-鍵相連的葡糖酐單元組成的環(huán)狀低聚糖的總稱。通過酶的作用轉(zhuǎn)化淀粉而制成的α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精它們的空腔(cavity)直徑是不同的，這些空腔通常能夠包結(jié)大量分子大小不同的疏水性外來分子。
然而，由于天然γ-環(huán)糊精(γ-CD)的溶解度只有18.7%(重量)，因此其在水中的溶解性相對較差，并且加溶能力也較低。例如，US4，764，604欄1最后一段，欄7/8表指出γ-CD只能在低濃度范圍內(nèi)加溶，而在較高濃度時(shí)其配合物往往會沉淀出來。US4，764，604同時(shí)還指出通過形成醚可以提高γ-CD的溶解性和改善加溶特性。人們知道甲基-γ-CD可溶于水并具有平均加溶性。雖然羥基丙基-γ-CD衍生物具有良好的溶血性，但它們的加溶性只是一般。如上述所例舉的那些γ-CD醚，它們的另一缺點(diǎn)是生物降解很困難。
本發(fā)明的目的是制備這樣一類有用的γ-CD衍生物，其加溶性好于羥丙基-γ-CD衍生物，具有良好的溶血性，易溶于水并且還容易被生物降解。
本發(fā)明的目的是通過下式(Ⅰ)?；h(huán)糊精而實(shí)現(xiàn)的
其中R為氫或R1，并且R1是相同或不同的，且為乙?；?、丙酰基、丁?；?、2-烷氧基乙?；?、2-氯乙?；?、2-氟乙?；?、2-N-乙酰氨基乙?；惗∠；虮；?，1HNMR光譜所測定的R1的DS為0.3-2.0。
在式(Ⅰ)中R1優(yōu)選乙?；?、丙酰基或丁?；?特別優(yōu)選乙?；?br> R1的DS優(yōu)選0.4-1.6，特別優(yōu)選0.6-1.4。
本發(fā)明環(huán)糊精衍生物上取代基的分布優(yōu)選是隨機(jī)的，優(yōu)選的是，在葡萄糖6位上的羥基被取代的數(shù)目小于90%，更優(yōu)選的是羥基被取代的數(shù)目小于85%，尤其優(yōu)選的是，羥基被取代的數(shù)目小于80%。
本發(fā)明的γ-環(huán)糊精衍生物在水中具有良好的溶解性，并同時(shí)兼有良好的加溶性和溶血性。另外，它們是可生物降解的，即由在自然界中及在胃腸中的酯酶和脂酶代謝轉(zhuǎn)化為γ-CD，已知γ-CD具有可接受的毒理學(xué)特性(G. Antlsperger， Minutes of the 6th International Symposium on Cyclodextrins，Chicago，21-24 April 1992，Editions de Sante，Paris，277)。
本發(fā)明的環(huán)糊精衍生物兼有良好的產(chǎn)品特性與毒理學(xué)特性，尤其是R1的DS為0.90-1.20的衍生物是特別合適的。
酰化環(huán)糊精混合物是以其平均取代度(DS值)表征的。DS值表明每一葡糖酐上平均鍵合的取代基數(shù)目。
DS值例如可以通過1H NMR光譜法在一適宜溶劑如二甲亞砜/三氟乙酸中測得。為了測定DS值，分別將酰基基團(tuán)(積分-ac)的信號和糖質(zhì)子(積分-su)的信號求積分，再分別除以酰基取代基中的質(zhì)子數(shù)或糖質(zhì)子數(shù)，然后建立它們彼此的關(guān)系式。
還可以從取代基的分布確定DS。以它們的結(jié)構(gòu)式為基礎(chǔ)，環(huán)糊精可以在2位、3位和/或6位上被取代。例如，通過將產(chǎn)物甲基化，然后水解為葡萄糖單元，再通過還原和乙?；饔脤⑺鼈冝D(zhuǎn)化為D-葡萄糖醇乙酸酯，可以確定DS值(P. Mischnick，Analysis of the Substitution Pattern of Chemically Modified Cyclodextrins in Dominique Duchene，New Trends in Cyclodextrins and Derivatives，Editions des Santes，Paris)由氣相色譜分餾能夠得出在具體環(huán)糊精衍生物中8種理論上可能的葡萄單元所占的摩爾比例，這8種葡萄糖單元如下所列
乙酰氧基數(shù)目 位置 D-葡萄糖醇乙酸酯3 S2,3,6 D-葡萄糖醇六乙酸酯2 S3,6 1,3,4,5,6-五-O-乙?；?2-一-O-甲基-D-葡萄糖醇2 S2,6 1,2,4,5,6-五-O-乙?；?3-一-O-甲基-D-葡萄糖醇2 S2,3 1,2,3,4,5-五-O-乙?；?6-一-O-甲基-D-葡萄糖醇1 S6 1,4,5,6-四-O-乙?；?2,3-二-O-甲基-D-葡萄糖醇1 S3 1,3,4,5-四-O-乙?；?2,6-二-O-甲基-D-葡萄糖醇1 S2 1,2,4,5-四-O-乙酰基-3,6-二-O-甲基-D-葡萄糖醇0 S0 1,4,5-三-O-乙?；?2,3,6-三-O-甲基-D-葡萄糖醇用測出的各葡萄糖單元的摩爾百分?jǐn)?shù)也可以計(jì)算得出每一位置上的平均取代度。在一具體位置上的取代基的平均概率X按如下所示X6(取代基在6位上的平均概率)進(jìn)行計(jì)算X6＝mol%S6+mol%S2，6+mol%S3，6+mol%S2，3，6用類似的方法可以計(jì)算出取代基在2位和3位上的平均取代度。借助取代基分布也可以確定取代度。
本發(fā)明還涉及一種制備酰化γ-環(huán)糊精衍生物的方法，在該方法中，γ-環(huán)糊精在堿性催化劑存在下與至少一種?；瘎┻M(jìn)行反應(yīng)。
本發(fā)明方法可以使用商品級質(zhì)量且含水量為0-16%的γ-環(huán)糊精。但是也可以按已知方法制備環(huán)糊精，如利用環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase E.C.2.4.1.19)在酶的作用下轉(zhuǎn)化淀粉來制備環(huán)糊精。由于成本的原因，優(yōu)選使用含水量為6-12%的γ-環(huán)糊精，這種γ-環(huán)糊精是可商購的(如可從Wacker-Chemie GmbH(Munich)獲得，牌號為GAMMA W8)。
所用酰化劑優(yōu)選為至少一種羧酸酐或一種羧酸。特別優(yōu)選使用乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、2-氯乙酸酐、2-氟乙酸酐、丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐，或相應(yīng)的羧酸，單獨(dú)或以任意混合物的形式使用。尤其優(yōu)選使用乙酸酐或乙酸。
作為催化劑，優(yōu)選使用羧酸酐的相應(yīng)酸的堿金屬鹽，例如乙酸鈉、乙酸鉀、丙酸鈉、丙酸鉀、丁酸鈉或丁酸鉀，和/或叔胺如三乙胺或吡啶，和/或堿性離子交換劑(如Rohm & Hass的Amberlite A21或Amberlite IRA-93)。特別優(yōu)選使用乙酸鈉。
本發(fā)明可以在不附加任何溶劑的情況下，用?；瘎┲苯舆M(jìn)行酰化反應(yīng)。
如果采用至少一種惰性溶劑進(jìn)行稀釋的話，對于產(chǎn)物的著色是有利的。所述的溶劑并非是指所有的反應(yīng)成分都需溶解在該溶劑中。反應(yīng)也可以在含一種或多種試劑的懸浮液或乳濁液中進(jìn)行。適用的惰性溶劑的實(shí)例有乙酸、丙酸、丁酸、甲酰胺、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺。N-甲基吡咯烷酮、DMPU(1，3-二甲基-3，4，5，6-四氫-2(1H)-嘧啶酮)、乙酰胺、甲基乙酰胺或二甲基乙酰胺。
當(dāng)采用羧酸酐作為?；瘎r(shí)，如果使用與該?；瘎┫鄳?yīng)的羧酸作為稀釋溶劑是特別有益的，也就是說，例如，當(dāng)采用乙酸酐作?；瘎r(shí)，如果用乙酸作為溶劑將是有益的。
每摩爾γ-環(huán)糊精優(yōu)選使用2-35mol、更優(yōu)選3-20mol、特別優(yōu)選5-15mol的酰化劑。在本文中，每種情況下所用的摩爾比是根據(jù)要求的取代程度和所用的環(huán)糊精的含水量而選擇的。
每摩爾γ-環(huán)糊精優(yōu)選使用0.01-5mol、特別是0.5-3mol的至少一種所說的催化劑。
γ-環(huán)糊精和反應(yīng)介質(zhì)所用量之比優(yōu)選為γ-CD比反應(yīng)介質(zhì)為1∶0.5-1∶10，更優(yōu)選1∶1-1∶6，所說的反應(yīng)介質(zhì)是指?；瘎┡c溶劑的總克數(shù)。反應(yīng)介質(zhì)最好是以基本上無水的形式采用。
為了制備本發(fā)明的γ-環(huán)糊精，把環(huán)糊精、?；瘎?、催化劑和反應(yīng)介質(zhì)按給定比例或同時(shí)或依次添加到一起。除去反應(yīng)中的水份有利于?；瘎┑慕Y(jié)合速率。
為了保持放熱反應(yīng)處于控制狀態(tài)下，優(yōu)選在升高的溫度(約80℃-120℃)下向其余組分的混合物中滴加?；瘎?br> 在升高的溫度(約80℃-150℃)下攪拌反應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物通常為一種懸浮液。一般說來，反應(yīng)結(jié)束時(shí)的特征是反應(yīng)混合物變澄清，這時(shí)開始時(shí)的懸浮液變?yōu)槿芤骸?br> 在部分真空條件下，蒸餾出揮發(fā)性成分，提取出水中的殘留物，再次于部分真空條件下蒸發(fā)該溶液。這些操作步驟優(yōu)選重復(fù)進(jìn)行幾次，如進(jìn)行三次。
將如此獲得的含有本發(fā)明的?；?環(huán)糊精的水溶液通過已知方法(如用沉淀法或滲析法除去鹽或溶劑殘留物)進(jìn)一步提純，再干燥(如冷凍干燥或噴霧干燥)。
因此，本發(fā)明的方法是一種簡單的無需復(fù)雜提純步驟的制備?；?環(huán)糊精的方法。本發(fā)明的方法可以僅在一步反應(yīng)步驟中，在催化劑存在下，通過使天然CD與酰化劑反應(yīng)直接制備?；疌D。
本發(fā)明的方法是先進(jìn)的，因?yàn)榘凑找酝w維素化學(xué)所采用的方法(如D.Blaser 等人的“Cellulose Esters”in Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry，5th Edition Ed. E. Gerhartz，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，1986，P419-459)，一般在開始時(shí)制得的?；a(chǎn)物產(chǎn)率高，隨后進(jìn)行水解，直到達(dá)到要求的取代度。
本發(fā)明方法由于避免了水解步驟從而避免了水解產(chǎn)物的生成，由此解決了提純問題。
本發(fā)明方法具有靈活性，一般通過簡單改變酰基給體即可使用。該方法是經(jīng)濟(jì)的。由于生成有作為化學(xué)計(jì)量付產(chǎn)物的易揮發(fā)性化合物，而這些付產(chǎn)物可以通過蒸餾這樣的簡單方法分離出去，該方法是催化操作的。本發(fā)明方法所達(dá)到的轉(zhuǎn)化是定量的。
如果需要，可以用已知方法，如利用沉淀法、離子交換色譜法、滲析法、柱色譜法或制備HPLC法進(jìn)一步提純環(huán)糊精衍生物。
本發(fā)明的環(huán)糊精衍生物適合于環(huán)糊精及其衍生物的所有已知應(yīng)用。
它們特別適合于-加溶水溶性差的化合物，如甾族化合物，-作為配制佐劑，優(yōu)選作為藥物、化妝品和農(nóng)業(yè)化學(xué)產(chǎn)品的佐劑，-用于穩(wěn)定光敏性、熱敏性或?qū)ρ趸饔妹舾械奈镔|(zhì)，-用于藥物活性化合物、農(nóng)業(yè)化學(xué)活性化合物如殺蟲劑和殺真菌劑，以及香味物質(zhì)的控制釋放，尤其是用于化妝品和家庭用品，-用于表面去油和清潔，-取代有機(jī)溶劑，尤其是從親油介質(zhì)中提取和分離物質(zhì)的過程中的有機(jī)溶劑，-作為助劑物質(zhì)，尤其在造紙、皮革和紡織工業(yè)中所用涂料和/或粘合介質(zhì)中的助劑物質(zhì)，-改變流變學(xué)特性，-作為相轉(zhuǎn)移催化劑，-掩蔽味道和氣味。
具體而言，乙?；?γ-環(huán)糊精(AC-γ-CD)特別適合用于藥物領(lǐng)域。例如，它們適用于加溶藥物活性化合物，如甾族化合物、生物堿、維生素、抗風(fēng)濕病化合物、強(qiáng)心甙或精神藥物如安定藥或神經(jīng)松弛劑。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明。
這些實(shí)施例中所描述的反應(yīng)過程是靠薄層色譜監(jiān)控的。在薄層色譜之前，如通過丙酮沉淀先分離出物質(zhì)。在這些實(shí)施例中所提到的DS值是用1H NMR光譜(溶劑二甲亞砜/三氟乙酸)測定的。
實(shí)施例1 制備乙?；?γ-CD(DS，1.17)將200g(135.4mmol)γ-CD(含水12.2%)和20g(244.3mmol)乙酸鈉懸浮于282ml的乙酸中，加熱此懸浮物至105℃。在大約1小時(shí)內(nèi)將141g(1382mmol)乙酸酐緩慢滴加到充分?jǐn)嚢韬蟮膽腋∥镏小Ｔ诖瞬竭^程中，把混合物的溫度升到回流溫度(117℃)。隨后在回流下煮沸該混合物，在此期間，反應(yīng)混合物緩慢變?yōu)槿芤骸４蠹s13小時(shí)后反應(yīng)完成。將混合物冷卻到室溫。
向反應(yīng)混合物中滴加50ml水。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(T＝80℃，100mmHg)基本上除去乙酸。然后將所得產(chǎn)物溶解于200ml水中，再進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。該步驟共進(jìn)行3次。最后，將產(chǎn)物溶解于400g水中。如此獲得的產(chǎn)物其DS為1.17。
實(shí)施例2制備乙?；?γ-CD(DS，0.83)按照實(shí)施例1的描述，使100g(67.7mmol)γ-CD(含水12.2%)、45g(44.1mmol)乙酸酐、220ml乙酸和10g(122.1mmol)乙酸鈉進(jìn)行反應(yīng)。大約14小時(shí)后反應(yīng)完成。然后按照實(shí)施例1的描述進(jìn)行進(jìn)一步處理。所得產(chǎn)物的DS為0.83。
實(shí)施例3制備乙酰基-γ-CD(DS，0.95)按照實(shí)施例1的描述，使200g(135.4mmol)γ-CD(含水12.4%)、130g(1274mmol)乙酸酐、382ml乙酸和20g(244.3mmol)乙酸鈉進(jìn)行反應(yīng)。大約16小時(shí)后反應(yīng)完成。然后按照實(shí)施例1的描述進(jìn)行進(jìn)一步處理。所得產(chǎn)物的DS為0.95。
實(shí)施例4制備乙酰基-γ-CD衍生物按照實(shí)施例1的描述制備DS值分別為1.11、1.00、1.36和0.90的乙?；?γ-CD衍生物。
(DS1.11∶100g(72.5mmol)γ-CD(含水量6%)，52.1g(511mmol)乙酸酐，180ml乙酸和6g(73mmol)乙酸鈉;117℃;24小時(shí))(DS1.00∶200g(134.1mmol)γ-CD(含水量13%)，82.1g(800mmol)乙酸酐，382ml乙酸和20g(243mmol)乙酸鈉;105℃;20小時(shí))(DS1.36∶200g(134.1mmol)γ-CD(含水量13%)，191.6g(1880mmol)乙酸酐，382ml乙酸和20g(243mmol)乙酸鈉;117℃;16小時(shí))(DS0.90∶100g(67.1mmol)γ-CD，55.5g(544mmol)乙酸酐，200ml乙酸和10g(122mmol)乙酸鈉;170℃;20小時(shí))實(shí)施例5制備乙?；?γ-CD(DS，0.95)把100g(73.08mmol)γ-CD(含水5.2%)和15g(244.3mmol)乙酸鈉懸浮于350ml乙酸中，將該混合物加熱到T＝117℃(回流溫度)。在回流下煮沸混合物，在此期間反應(yīng)混合物緩慢變?yōu)槿芤?約18.5小時(shí))。變澄清后繼續(xù)煮沸反應(yīng)混合物1小時(shí)。然后將混合物冷卻到室溫。
通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(T＝80℃，100mgHg)除去大部分乙酸。然后把所得產(chǎn)物溶于200ml水中，再進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。該方法共進(jìn)行三次。最后，把所得產(chǎn)物溶于400g水中。如此獲得的產(chǎn)物其DS為0.95。
實(shí)施例6制備丙?；?γ-CD(DS，0.85)按類似實(shí)施例1的方法，使100g(67.7mmol)γ-CD(含水量12.3%)、109.7g(843mmol)丙酸酐、6g(73.8mmol)乙酸鈉和100ml丙酸進(jìn)行反應(yīng)，然后處理。反應(yīng)溫度為140℃，反應(yīng)時(shí)間為15小時(shí)。
所得產(chǎn)物的DS值為0.85。
實(shí)施例7測定實(shí)施例1-5所得產(chǎn)物中取代基的分布把實(shí)施例1-5的樣品各稱5mg，分別放入4ml Reacti-Vial(反應(yīng)容器)中，再用移液管移入1ml磷酸三甲酯。如果需要，在超聲波浴中，將混合物溶解短的一段時(shí)間。
然后，加入100μl三氟甲磺酸甲酯和150μ12，6-二-叔丁基吡啶，在容器中裝上攪拌器，密封好;隨后使混合物在容器中放置反應(yīng)2小時(shí)，所說的容器是放置在50℃的水浴中的。用20ml雙蒸水洗滌所說的混合物并使之定量流入50ml的分液漏斗中，然后用5ml氯仿充分搖振提取一次。
把最下層相排入Reacti-Vial，在室溫下用N2氣蒸發(fā)到干燥。
水解向裝有經(jīng)過甲基化步驟的樣品的容器中加入三氟乙酸達(dá)到4ml刻度，密封，在110℃下加熱4小時(shí)。然后冷卻到60℃，用氮?dú)獯党鋈宜?至干燥)。用約25ml二氯甲烷處理殘留物3次，每次都用氮?dú)獯祾摺?br> 還原將0.25ml 0.5M的硼氫化鈉于NH4OH中的溶液加入到水解殘留物中，在60℃下加熱此混合物至少1小時(shí)。待冷卻后，通過添加冰醋酸來破壞過量試劑，直到搖振時(shí)不再有氣體放出。反復(fù)加入含有約2%乙酸的甲醇，然后用氮?dú)獯祾撸古鹚峄衔镆耘鹚峒柞サ男问脚懦?，六次填裝容器，最高達(dá)到4ml刻度，然后每次均將混合物濃縮至(幾乎)干燥。
?；鋮s后，加入25μl吡啶和200μl乙酸酐。將Reacti-Vial密封，放入100℃的干燥爐中3小時(shí)。
待冷卻后，小心加入大約1-2ml飽和的碳酸氫鈉溶液，然后迅速將容器密封起來。把1ml CHCl3和少量的NaHCO3溶液加入到第二個(gè)反應(yīng)容器中。將第一個(gè)容器中的溶液小心地倒入第二個(gè)容器中，密封此容器，搖振到一定的程度，通氣，然后搖勻。用移液管吸出水相，棄之。將第一個(gè)容器淋洗兩次。這樣，重復(fù)搖振提取過程約三次。把CaCl2加入到已經(jīng)過如此提純的氯仿中，如果需要，再另加少量CHCl3，用玻璃管尖取出溶液以便把其移入小玻璃試管中。然后進(jìn)行GC分析。
表1給出了取代基的分布。
表1取代基分布AC-γ-CD S0 S3 S2 S6實(shí)施例2 AC-γ-CD(0.83) 26.45% 3.45% 0.75% 57.55%實(shí)施例4 AC-γ-CD(0.90) 19.65% 3.70% 0.75% 60.70%實(shí)施例1 AC-γ-CD(1.17) 14.95% 2.85% 2.30% 57.45%實(shí)施例3 AC-γ-CD(0.95) 23.75% 2.65% 2.25% 55.00%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.11) 15.40% 3.00% 2.90% 49.05%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.0) 19.45% 3.05% 2.75% 50.70%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.36) 13.65% 3.35% 3.00% 38.50%實(shí)施例5 AC-γ-CD(0.95) 23.70% 2.70% 2.20% 56.40%取代基分布AC-γ-CD S2.3 S3.6 S2.6 S2.3.6實(shí)施例2 AC-γ-CD(0.83) 1.00% 7.35% 2.00% 1.35%實(shí)施例4 AC-γ-CD(0.90) 1.10% 9.55% 2.20% 2.35%實(shí)施例1 AC-γ-CD(1.17) 0.90% 10.40% 8.45% 2.60%實(shí)施例3 AC-γ-CD(0.95) 0.65% 7.50% 6.35% 1.85%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.11) 1.05% 11.80% 11.60% 5.15%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.0) 1.15% 10.00% 9.25% 3.80%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.36) 2.00% 15.05% 13.45% 10.95%實(shí)施例5 AC-γ-CD(0.95) 0.70% 7.00% 6.10% 1.40%
取代基分布AC-γ-CD X2 X3 X2.3 X6實(shí)施例2 AC-γ-CD(0.83) 5.10% 13.15% 18.25% 68.25%實(shí)施例4 AC-γ-CD(0.90) 6.40% 16.70% 23.10% 74.80%實(shí)施例1 AC-γ-CD(1.17) 14.25% 16.75% 31.00% 78.90%實(shí)施例3 AC-γ-CD(0.95) 11.10% 12.65% 23.75% 70.70%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.11) 20.70% 21.00% 41.70% 77.60%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.0) 16.95% 18.00% 34.95% 73.75%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.36) 29.40% 31.35% 60.75% 77.95%實(shí)施例5 AC-γ-CD(0.95) 10.40% 11.80% 22.20% 70.90%實(shí)施例8測定實(shí)施例1-5所制備產(chǎn)品的不同性能，并與現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品進(jìn)行比較。
測定項(xiàng)目為產(chǎn)品的水溶性、加溶能力、溶血活性，酶催降解性和生物降解性?，F(xiàn)有技術(shù)的代表產(chǎn)品為甲基-γ-環(huán)糊精(DS，1.8)(Me-γ-CD)和兩種羥丙基-γ-環(huán)糊精衍生物(DS，0.9;DS，0.6)(Hp-γ-CD)。
水溶性是在25℃下測定的。
為了測定對氫化可的松的加溶能力，制備濃度為30%的環(huán)糊精衍生物的水溶液，在25℃下與過量的氫化可的松一起搖振24小時(shí)。用膜過濾器(0.2μm)過濾分離出未溶解的產(chǎn)物。用HPLC測定濾液中的氫化可的松濃度。
為了測定加溶膽甾醇的能力，在所有情況下，均將40mg膽甾醇加入到1ml濃度為30%的環(huán)糊精衍生物的水溶液中，搖振混合物過夜。然后離心分離出沉淀物。
為了測定膽甾醇，制備下述溶液a)緩沖液將1.21g三羥甲基氨基甲烷緩沖劑、430mg膽酸的鈉鹽和100mg ABTS溶解于大約80ml的去離子水中，用1MHCl調(diào)節(jié)pH至7.7。再加入1.02gMg Cl2·6H2O和40U的過氧化物酶，并且0.1 MHCl將pH校正到7.7。在容量瓶中用去離子水將體積補(bǔ)充到100ml。
b)膽甾醇氧化酶溶液將15，000U的膽甾醇氧化酶(Sigma(815)(E. C. 1. 1. 3. 6))加入到1000ml的1M(NH4)2SO4中。
為了測定膽甾醇，用移液管把50μl樣品溶液，3ml緩沖液和20μl膽甾醇氧化酶溶液移入試管中，該試管用一種薄膜parafilm封住，搖振以使試劑充分混合，然后將此試管在37-40℃的水浴中溫育1小時(shí)。當(dāng)溶液適當(dāng)?shù)刈兿r(shí)，就立即用光度法(730nm)測定其中的膽甾醇含量。
按照EP-B-0149197中的描述測定溶血活性。
用下列混合物測定酶催降解性2.5ml的0.1M三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris-buffer)22.5ml的水10μl乙腈
200μl的乙酰基-γ-CD溶液(500mg/ml)100單位的酶利用Zahn-Wellens 試驗(yàn)(OECD Guidelines for testing of Chemicals 302B，Adopted by the Council on 17th July 1992)測定生物降解性。
水溶性、加溶結(jié)果、Zahn-Wellens試驗(yàn)(ZaWe-14d)結(jié)果以及溶血結(jié)果均列于表2中。
表2γ-衍生物的比較
實(shí)施例2 AC-γ-CD(0.83) 50.00% 46.6 1.09 98% 3.7%實(shí)施例4 AC-γ-CD(0.87) 24.50% 53.7 0.44 3.7%實(shí)施例4 AC-γ-CD(0.90) 29.90% 52.7 0.90 98% 6.0%實(shí)施例3 AC-γ-CD(0.95) >70% 52.5 0.70實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.0) >68% 52.4實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.11) >70% 50.2 0.37 9.1%實(shí)施例1 AC-γ-CD(1.17) >70% 49.5 0.30 8.6%實(shí)施例4 AC-γ-CD(1.36) >68% 39.6 0.13 16.0%實(shí)施例5 AC-γ-CD(0.95) >70% 53.4Hp-γ-CD(0.9) 28 0.04 25% >30%Hp-γ-CD(0.6) 41 0.10 >30%Me-γ-CD(1.8) 39.6 14% 14.9%乙?；?γ-CD可被下列酶降解-解脂酶(lipolase)100L(Novo Industri，Copenhagen)-脂肪酶，來源于胰腺(EC 3. 1. 1. 3)Sigma Chem.公司-酯酶，來源于豬肝，Boehringer Mannheim公司-脂肪酶，來源于黑曲霉，EC3. 1. 1. 3，F(xiàn)luka
權(quán)利要求
1.一種下式(Ⅰ)的酰化環(huán)糊精 其中R為氫或R1，并且R1是相同或不同的，且為乙酰基、丙?；?、丁?；?、2-烷氧基乙酰基、2-氯乙酰基、2-氯乙酰基、2-N-乙酰氨基乙酰基、異丁烯酰基或丙烯?；?，1H NMR光譜所測定的R1的DS為0.3-2.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的?；h(huán)糊精衍生物，其中式(Ⅰ)中的R1為乙?；⒈；蚨□；?，R1的DS為0.4-1.6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的?；h(huán)糊精衍生物，其中式(Ⅰ)中的R1為乙?；珼S為0.6-1.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的酰化環(huán)糊精衍生物，其中取代基的分布是隨機(jī)的，在葡萄糖6位上的羥基被取代的數(shù)目小于90%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的?；h(huán)糊精衍生物，其中在葡萄糖6位上的羥基被取代的數(shù)目小于85%。
6.一種制備?；?環(huán)糊精衍生物的方法，其特征在于使γ-環(huán)糊精在堿性催化劑的存在下與至少一種?；瘎┻M(jìn)行反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所用酰化劑為乙酸酐，丙酸酐、丁酸酐、2-氯乙酸酐、2-氟乙酸酐、丙烯酸酐或甲基丙烯酸酐，它們或單獨(dú)使用或以任意混合物的形式使用。
8.?；?γ-CD在藥物領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種下式(I)的?；h(huán)糊精其中R為氫或R1，并且R1是相同或不同的，且為乙?；?、丙?；?、丁?；?、2-烷氧基乙?；?、2-氯乙酰基、2-氟乙?；?-N-乙酰氨基乙?；惗∠；虮；?，用
文檔編號C08B37/16GK1112935SQ9510476
公開日1995年12月6日 申請日期1995年4月22日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月22日
發(fā)明者羅爾夫·希爾森科恩 申請人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)