專利名稱：：透明質酸鈉的純化方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及透明質酸鈉的純化方法和由該純化方法獲得的透明質酸鈉。目前已知的有不含鏈球菌溶血素的無溶血性的透明質酸鈉(特公平3-78116)；對于人多形核白細胞的趨化性低且在家兔的眼內給與時對細胞的侵害性低的透明質酸鈉(特公平6-8323)；不含熱源物質的高純度透明質酸鈉(特開昭62-501471)等。透明質酸鈉的工業(yè)制法已知有純化雞冠提取物的方法，以及純化由鏈球菌屬的菌株得到的發(fā)酵液而獲得透明質酸鈉的方法。作為除去透明質酸鈉中作為雜質存在的熱源物質等高分子量化合物的方法，已知有以下幾種方法用三氯乙酸、氯仿-異戊醇處理；酶處理的方法(特開昭60-24194)；離子交換樹脂處理法(特開昭63-12293)；吸附樹脂處理法(特開平2-103203)；十六烷基氯化吡啶鎓(特開昭60-133894)；用大量的水溶性有機溶劑等有選擇地使透明質酸鈉沉淀的方法(特開平2-268765)；將2-6萬厘沲粘度的溶液在pH6-10的溶液中通過帶正電的過濾器從而除去熱源物質的方法(特開平6-199656)等。上述這些方法雖然能夠提供無溶血性、無化學趨化性、熱源試驗呈陰性的透明質酸鈉，但為除去熱源物質必須要進行繁雜的操作。因此目前希望開發(fā)一種能夠容易地從透明質酸鈉除去熱源物質的純化方法。本發(fā)明的目的在于提供一種容易地獲得熱源物質含量低的高純度透明質酸鈉的純化方法以及由該純化方法獲得的透明質酸鈉。本發(fā)明提供一種透明質酸鈉的純化方法及由該純化方法獲得的透明質酸鈉，其特征在于，在含有透明質酸鈉的透明質酸鈉溶液中加入鹽和水溶性有機溶劑，使透明質酸鈉析出·沉降，抽出上清液，從而除去熱源物質。另外，本發(fā)明還提供另一種透明質酸鈉的純化方法和由該純化方法獲得的透明質酸鈉，其特征在于將含有透明質酸鈉的透明質酸鈉溶液通過帶正電的過濾器，再用與上述相同的方法除去熱源物質。另外，本發(fā)明還提供另外一種透明質酸鈉的純化方法和由該方法獲得的透明質酸鈉，其特征在于將由上述方法獲得的透明質酸鈉用50％(v/v)以上的水溶性有機溶劑洗滌，成為粉末狀后再進行真空干燥，由此進一步降低熱源物質。本發(fā)明中使用的透明質酸鈉可以來自微生物、動物等，與透明質酸鈉的分子量無關。透明質酸鈉例如可以舉出由玻璃體、臍帶、關節(jié)液、雞冠等分離得到的物質，以及由釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、馬鏈球菌(Streptococcusequi)、Streptococcusequismilis、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)、獸瘟鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)等微生物生產的物質。透明質酸鈉溶液優(yōu)選是含有0.001-1％(w/v)透明質酸鈉的水溶液，用于溶解透明質酸鈉的水，其中的熱源物質優(yōu)選低于0.01EU/ml。為除去該透明質酸鈉溶液中的雜菌或不溶物，也可用0.2-0.5μm的過濾器進行過濾處理。另外，為除去透明質酸鈉溶液中的熱源物質，也可以使用在特定的pH范圍帶正電的過濾器進行過濾處理。上述過濾器只要是在pH3-10的水溶液中帶正電的過濾器即可。優(yōu)選使用膜過濾器。作為上述的過濾器，優(yōu)選是由尼龍-66等聚酰胺樹脂作為一種成分組成的共聚物形成的膜孔徑為0.20-5.0μm的過濾器。該過濾器的具體例子可以舉出日本ポ-ル(株)制的ポジダイン過濾器(商品名)、プロフアイルIIプラス(商品名)等。使用該過濾器進行過濾處理時，為提高過濾速度，可以添加鹽或升高透明質酸鈉溶液的液溫。所說的鹽，其中的堿成分是由鋰、鈉、鉀等堿金屬離子，鎂、鈣等堿土金屬離子等，以及銨離子等構成的陽性成分，其中的酸成分是由氯、溴等鹵素離子，硫酸、硝酸等無機酸，以及甲酸、乙酸等有機酸的酸根構成的陰性成分，優(yōu)選鈉鹽。鹽可以單獨或組合使用。具體的鹽例如可以舉出氯化鈉、硫酸鈉、醋酸鈉等。相對于透明質酸溶液添加0.1-30％(w/v)的鹽。透明質酸溶液的液溫可以升溫至80℃。在進行了上述過濾器過濾處理的透明質酸鈉溶液中或在未進行該處理的透明質酸鈉溶液中加入鹽和水溶性有機溶劑。可以單獨使用或組合使用上述記載的鹽。相對于透明質酸溶液，優(yōu)選加入1-30(w/v)的鹽。水溶性有機溶劑的添加量是要使透明質酸鈉的最終濃度為30-90％(v/v)，這樣可以使透明質酸鈉析出。作為水溶性有機溶劑，只要是可溶于水的有機溶劑即可使用，具體可以舉出甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇等醇類，丙酮等酮類，二甲氧基乙烷、四氫呋喃、二噁烷等醚類，乙腈等。這些水溶性有機溶劑可單獨或混合使用。另外，使用的水溶性有機溶劑優(yōu)選熱源物質含量低的。通過向透明質酸鈉溶液中加入水溶性有機溶劑，從析出、沉降的透明質酸鈉中高效率地除去熱源物質，為使透明質酸鈉充分地沉降，通常在添加水溶性有機溶劑后放置2小時以上，使透明質酸鈉沉降。此時，沉降的透明質酸鈉成為凝膠狀的比容小的半透明狀態(tài)。從透明質酸鈉沉降后的溶液中除去上清液，從而除去熱源物質。另外，除去上清液后殘留的透明質酸鈉，可利用以下方法進一步除去熱源物質。在除去上清液的凝膠狀的上述透明質酸鈉中添加50-100％(v/v)的水溶性有機溶劑，洗滌。利用該操作使上述透明質酸鈉從凝膠狀成為粉末狀。根據需要，在該粉末狀的透明質酸鈉中再加入50-100％(v/v)的水溶性有機溶劑，洗滌后真空干燥，獲得熱源物質含量為0.0015-0.003EU/mg以下的透明質酸鈉。熱源物質的測定如下進行，將透明質酸鈉溶于熱源物質含量低于0.006EU/ml的水中，使透明質酸鈉的濃度為2g/l，使用トキシカラ-系統(tǒng)(生化學工業(yè)社制)，按照附帶的操作手冊進行比色分析。以下給出本發(fā)明的實施例。實施例1將熱源物質含量0.02EU/mg的透明質酸鈉25g溶于熱源物質含量低于0.01EU/ml的10升水中，用0.45μm的微孔過濾器進行進行過濾處理，得到濾液。在上述濾液中加入氯化鈉使氯化鈉的濃度達到58.5g/l，之后加入乙醇使乙醇的濃度為50或44％(v/v)。上述溶液放置5小時，使透明質酸鈉析出、沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。用80％的乙醇水溶液洗滌上述沉降物，之后再用100％乙醇洗滌。真空干燥上述洗滌物，得到20g純化的透明質酸鈉。表1給出上述得到的透明質酸鈉中的熱源物質的含量。表1實施例2將熱源物質含量0.02EU/mg的透明質酸鈉25g溶于熱源物質含量低于0.01EU/ml的10升水中，之后用0.45μm的微孔過濾器過濾，得到濾液。在上述濾液中加入氯化鈉使氯化鈉的濃度為58.5g/l，之后加入丙酮使丙酮濃度為50、44或41％(v/v)。上述溶液放置約5小時，使透明質酸鈉析出、沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。用80％丙酮洗滌上述沉淀物，用100％丙酮洗滌。表2給出上述得到的透明質酸鈉中的熱源物質含量。表2</tables>實施例3將獸瘟鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)NCTC7023[J.Gen.Microbiol.，15，485-491(1956)]用腦、心臟浸劑肉湯瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥社制)在37℃下培養(yǎng)16小時，得到的菌體接種到300ml種培養(yǎng)基(pH7.0)上，所說的種培養(yǎng)基由1％葡萄糖、1.5％胨、0.5％酵母提取物、1％玉米浸漬液、0.3％谷氨酸一鈉、0.2％磷酸氫二鉀、0.05％硫酸鎂、0.1％硫代硫酸鈉、2％碳酸鈣組成，37℃下振蕩培養(yǎng)16小時。將上述種培養(yǎng)液150ml接種到裝有3升發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.2)的容積為5升的發(fā)酵罐中，所說發(fā)酵培養(yǎng)基由2.5％葡萄糖、1.5％胨、0.5％酵母提取物、0.5％玉米浸漬液、0.2％磷酸氫二鉀、0.005％硫酸鎂、0.1％硫代硫酸鈉組成。接種后在37℃、通氣量0.3vvm、pH7.0條件下培養(yǎng)26小時，得到透明質酸培養(yǎng)液。將上述透明質酸培養(yǎng)液3升用去離子水稀釋至20升，加入200g碳，室溫攪拌1小時后，用努采漏斗過濾，得到20升碳處理液。使上述碳處理液以5升/小時的流速連續(xù)流過大網絡型陰離子交換樹脂DiaionHPA-75(三菱化學社制)2.5升和凝膠型強酸性陽離子交換樹脂SK1B(三菱化學社制)1.25升，得到20升色譜處理液。將上述處理液用氫氧化鈉調節(jié)pH為7.0，加入200g碳，室溫下攪拌1小時。攪拌后用努采漏斗過濾，得到的濾液用0.45μm的微孔過濾器過濾，得到20升的濾液。該濾液的熱源物質含量相對于透明質酸鈉為0.04EU/mg。在上述濾液中加入1.2kg氯化鈉，加入14升丙酮。放置約5小時使透明質酸鈉析出沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。上述沉淀物用80％丙酮洗滌后用100％丙酮洗滌。真空干燥上述洗滌物，得到11.5g純化透明質酸鈉。表3給出上述獲得的透明質酸鈉中的熱源物質含量。表3</tables>實施例4將來自雞冠的熱源物質含量為0.02EU/mg的透明質酸鈉25g溶于熱源物質含量低于0.01EU/ml的10升水中，之后用0.45μm微孔過濾器過濾，得到濾液。在上述濾液中加入氯化鈉使其濃度達到58.5g/l，然后加入丙酮使丙酮濃度為41％(v/v)。上述溶液放置約5小時，使透明質酸鈉析出、沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。該沉降物用80％丙酮洗滌后再用100％丙酮洗滌。真空干燥上述洗滌物，獲得20g純化透明質酸鈉。表4給出上述得到的透明質酸鈉中的熱源物質含量。表4</tables>實施例5將熱源物質含量0.02EU/mg、分子量230萬的透明質酸鈉25g溶于10升熱源物質含量0.01EU/ml以下的水中。在上述溶液中加入氯化鈉使其濃度達到10g/l。使用在pH3-10的范圍帶正電的微孔過濾器[絕對過濾精度0.45μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン過濾器(商品名)]，過濾溫度25℃，過濾處理上述透明質酸溶液，得到濾液。在上述濾液中加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度達到58.5g/l后，加入乙醇，使乙醇濃度為44％(v/v)。該溶液放置約5小時，使透明質酸鈉析出、沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。用80％乙醇的水溶液洗滌上述沉降物后，用100％乙醇洗滌。真空干燥該洗滌物獲得20g的純化透明質酸鈉。表5給出獲得的透明質酸鈉中的熱源物質含量。表5</tables>實施例6將熱源物質含量0.02EU/mg、分子量60萬的透明質酸鈉50g溶于10升熱源物質含量低于0.01EU/ml的水中。在上述溶液中加入氯化鈉，使氯化鈉的深度達到10g/l。使用在pH3-10的范圍帶正電的膜過濾器[絕對過濾精度0.45μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン過濾器(商品名)]，過濾溫度25℃，過濾處理上述透明質酸溶液，得到濾液。在該濾液中加入氯化鈉，使氯化鈉濃度達到58.5g/l，之后加入乙醇，使乙醇濃度達到44％(v/v)。該溶液放置約5小時使透明質酸鈉析出、沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。用80％乙醇洗滌上述沉降物后用100％乙醇洗滌。真空干燥上述洗滌物，得到40g純化透明質酸鈉。表6給出上述獲得的透明質酸鈉中的熱源物質含量。表6</tables>實施例7將獸瘟鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)NCTC7023[J.Gen.Microbiol.，15，485-491(1956)]在腦、心臟浸劑瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥社制)中于37℃下培養(yǎng)16小時，所得菌體接種到300ml種培養(yǎng)基(pH7.0)中，37℃下振蕩培養(yǎng)16小時，上述種培養(yǎng)基由1％葡萄糖、1.5％胨，0.5％酵母提取物、1％玉米浸漬液、0.3％谷氨酸一鈉、0.2％磷酸氫二鉀、0.05％硫酸鎂、0.1％硫代硫酸鈉、2％碳酸鈣組成。將上述種培養(yǎng)液150ml接種到裝有3升發(fā)酵培養(yǎng)基(Ph7.2)的容積為5升的發(fā)酵罐中，所說的發(fā)酵培養(yǎng)基由2.5％葡萄糖、1.5％胨、0.5％酵母提取物、0.5％玉米浸漬液、0.2％磷酸氫二鉀、0.005％硫酸鎂、0.1％硫代硫酸鈉組成。接種后在37℃、通氣量0.3vvm、pH7.0的條件下培養(yǎng)26小時，得到透明質酸培養(yǎng)液。將3升上述的透明質酸培養(yǎng)液用去離子水稀釋成20升，加入200g碳，室溫下攪拌1小時后，用努采漏斗過濾，得到20升碳處理液。使上述碳處理液以5升/小時的流速連續(xù)流過大網絡型陰離子交換樹脂DiaionHPA-75(三菱化學社制)2.5升和凝膠型強酸性陽離子交換樹脂SK1B(三菱化學社制)1.25升，得到20升色譜處理液。將上述處理液用氫氧化鈉調節(jié)pH為7.0，之后加入200g碳，室溫下攪拌1小時，用努采漏斗過濾，得到濾液。在上述濾液中加入氯化鈉，使氯化鈉濃度達到10g/l。使用在pH3-10的范圍帶正電的膜過濾器[絕對過濾精度0.45μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン過濾器(商品名)]，過濾溫度25℃，過濾處理該透明質酸溶液，得到18升濾液。上述濾液中的熱源物質含量為0.01EU/mg(相對于透明質酸鈉)。在上述濾液中加入1.1kg的氯化鈉，加入14升的乙醇。放置約5小時，使透明質酸鈉析出、沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。將沉降物用80％乙醇洗滌后再用100％乙醇洗滌。真空干燥上述洗滌物，得到10.0g純化透明質酸鈉。用極限粘度法分析該透明質酸鈉的分子量，為20萬。表7給出上述得到的透明質酸鈉中的熱源物質含量。表7實施例8將來自雞冠的熱源物質含量為0.02EU/mg、分子量100萬的透明質酸鈉50g溶于10升熱源物質含量為0.01EU/ml以下的水中。在該溶液中加入氯化鈉，使氯化鈉濃度達到10g/l。使用在pH3-10的范圍帶正電的膜過濾器[絕對過濾精度0.45μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン過濾器(商品名)]，過濾溫度25℃，過濾處理該透明質酸溶液，得到濾液。在上述濾液中加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度達到58.5g/l后，加入丙酮，使丙酮濃度為41％(v/v)。上述溶液放置約5小時，使透明質酸鈉析出、沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。將上述沉淀物用80％丙酮洗滌后再用100％丙酮洗滌。真空干燥上述洗滌物，得到40g純化透明質酸鈉。表8給出上述得到的透明質酸鈉中的熱源物質含量。表8實施例9將熱源物質含量0.1EU/mg、分子量230萬的透明質酸鈉10g溶于10升熱源物質含量低于0.01EU/ml的水中。在上述溶液中加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度達到10g/l。使用在pH3-10的范圍帶正電的微孔過濾器[絕對過濾精度0.2μm，日本ポ-ル(株)制的ポジダイン過濾器(商品名)]，過濾溫度25℃，過濾處理該透明質酸溶液，得到濾液。在上述濾液中加入氯化鈉，使氯化鈉的濃度達到58.5g/l，之后加入乙醇，使乙醇濃度為44％(v/v)。上述溶液放置約5小時，使透明質酸鈉析出、沉降，除去該溶液的上清液，得到透明質酸鈉的沉降物。用80％乙醇洗滌上述沉降物后用100％乙醇洗滌。真空干燥上述洗滌物，得到2g純化透明質酸鈉。表9給出上述得到的透明質酸鈉中的熱源物質含量。表9</tables>利用本發(fā)明可以提供容易地獲得熱源物質含量低、高純度的透明質酸鈉的純化方法，以及由該方法獲得的透明質酸鈉。權利要求1.透明質酸鈉的純化方法，其特征在于，在含有透明質酸鈉的透明質酸鈉溶液中加入鹽和水溶性有機溶劑，使透明質酸鈉析出、沉降，通過抽出上清液從而除去熱源物質。2.權利要求1記載的純化方法，其中在透明質酸鈉溶液中含有0.001-1％(w/v)的透明質酸鈉。3.權利要求1記載的純化方法，其中的透明質酸鈉是來自雞冠或微生物的透明質酸鈉。4.權利要求3記載的純化方法，其中的微生物是屬于鏈球菌(Streptoccus)屬的微生物。5.權利要求4記載的純化方法，其中屬于鏈球菌(Streptoccus)屬的微生物是獸瘟鏈球菌(Streptoccuszooepidemicus)NCTC7023。6.權利要求1記載的純化方法，其中鹽的添加量是1-30％(w/v)。7.權利要求1或6記載的純化方法，其中的鹽是鈉鹽。8.權利要求7記載的純化方法，其中的鈉鹽選自氯化鈉、硫酸鈉和醋酸鈉。9.權利要求1記載的純化方法，其中水溶性有機溶劑的添加量是30-45％(v/v)。10.權利要求1記載的純化方法，其中的水溶性有機溶劑是甲醇、乙醇或丙酮。11.權利要求1或2記載的純化方法，其中含有透明質酸鈉的透明質酸鈉溶液是經過處理的透明質酸鈉溶液，所說的處理是使透明質酸鈉溶液通過在pH3-10的溶液中帶正電的微孔過濾器。12.權利要求11記載的純化方法，其中帶正電的微孔過濾器的孔徑為0.20-5.0μm。13.權利要求11記載的純化方法，其中透明質酸鈉溶液含有鹽。14.權利要求13記載的純化方法，其中鹽的添加量是0.1-30％(w/v)。15.權利要求13或14記載的純化方法，其中的鹽是鈉鹽。16.權利要求15記載的純化方法，其中的鈉鹽選自氯化鈉、硫酸鈉和醋酸鈉。17.透明質酸鈉的純化方法，其特征在于，在由上述權利要求1-16中任一項記載的純化方法獲得的透明質酸鈉中加入50-100％(v/v)的水溶性有機溶劑，洗滌透明質酸鈉后真空干燥。18.由權利要求1-17中任一項記載的純化方法得到的透明質酸鈉。19.熱源物質含量低于0.003EU/mg的透明質酸鈉。全文摘要本發(fā)明提供了能夠容易地獲得熱源物質含量低且純度高的透明質酸鈉的純化方法,以及由該純化方法獲得的透明質酸鈉。本發(fā)明的純化方法的特征在于在含有透明質酸鈉的溶液中或是在含有透明質酸鈉的溶液通過帶正電的過濾器后的濾液中,加入鹽和水溶性有機溶劑,使透明質酸鈉析出沉降,通過抽出上清液從而除去熱源物質。文檔編號C08B37/08GK1195027SQ9810588公開日1998年10月7日申請日期1998年3月25日優(yōu)先權日1997年3月27日發(fā)明者菅繁紀,室井健一,木下格,后藤讓治申請人:協和發(fā)酵工業(yè)株式會社