專利名稱：硫酸糖的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用作藥物、糖鏈工程學研究試劑、化妝品等的源自海藻的硫酸糖和硫酸多糖。
現(xiàn)有技術已知屬于褐藻類的海藻含有硫酸多糖，已有報道其中硫酸巖藻糖是其基本構成糖組分的巖藻多糖的結構隨著該褐藻類型的不同而有很大不同。
已有報道，源自硫酸多糖的硫酸糖隨著褐藻類型的不同而有很大不同。
本發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的是，提供用作試劑、藥物等的具有新結構的硫酸糖和硫酸多糖。解決該問題的手段為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者們已經對源自褐藻的硫酸多糖進行了充分研究，已經建立了制備其中下述式[Ⅰ]所示硫酸糖是其基本構成糖組分的硫酸多糖(在下文中稱為“本發(fā)明硫酸多糖”)和所述硫酸糖的方法，并完成了本發(fā)明。
簡言之，本發(fā)明涉及下述式[Ⅰ]所示硫酸糖，或以所述硫酸糖作為其基本構成糖組分的硫酸多糖以及它們的鹽。 其中R是OH或OSO3H；且n是1-5的整數(shù)。
本發(fā)明第二個發(fā)明涉及制備被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖的方法，其特征在于，包括在非破壞性條件下將硫酸多糖與多陽離子物質的交聯(lián)物從藻類物質中提取出來的步驟。
本發(fā)明第三個發(fā)明涉及制備被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖的方法，其特征在于，將具有比硫酸多糖溶液pH高的等電點的多陽離子物質加到所述溶液中。
本發(fā)明第四個發(fā)明涉及增強硫酸多糖粘彈性的方法，其特征在于，將多陽離子物質加到硫酸多糖中。
本發(fā)明第五個發(fā)明涉及含有至少一種具有低粘彈性的硫酸多糖和多陽離子物質的組合物。
本發(fā)明第六個發(fā)明涉及藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑含有被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖作為有效成分。
本發(fā)明第七個特征涉及潤滑劑，其特征在于，所述潤滑劑含有被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖作為有效成分。
本發(fā)明第八個特征涉及化妝品，其特征在于，所述化妝品含有被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖作為有效成分。
附圖的簡要說明附

圖1表示的是硫酸糖的質譜結果。
附圖2表示的是硫酸糖的1H-NMR光譜。
附圖3表示的是硫酸糖的1C-NMR光譜。
附圖4表示的是no.67級分的1H-NMR光譜。
附圖5表示的是本發(fā)明硫酸多糖的1H-NMR光譜。
附圖6表示的是本發(fā)明硫酸多糖的IP光譜。
實施本發(fā)明的最佳方式下面將具體闡明本發(fā)明。
對于本發(fā)明所用的褐藻類型沒有特別限制，只要其含有本發(fā)明硫酸多糖即可。屬于昆布目的海藻例如Kjellmaniella crassifolia、海帶(Laminaria japonica)、Undaria pinnatifida、鵝掌菜(Eckloniakurome)、Eisenia bicyclis、Ecklonia cava、巨藻(giant kelp)、Lessonia nigrescens等是特別優(yōu)選的原料，這是因為它們含有大量本發(fā)明硫酸多糖。
在制備本發(fā)明硫酸多糖過程中，使用含水溶劑從褐藻中提取到了硫酸多糖。用于提取的海藻可以是未加工藻類物質，或者可以在提取前將褐藻干燥或制成干燥粉末。
此外，當用60-100％醇、丙酮等洗滌干燥的藻類物質時，可顯著減輕有色物質對本發(fā)明硫酸多糖的污染，因此，這有利于隨后進行的本發(fā)明硫酸多糖的制備。
依據(jù)本發(fā)明從褐藻中提取硫酸多糖優(yōu)選在乙醇存在下進行，可用含水溶劑、優(yōu)選在5-40％乙醇存在下、更優(yōu)選在8-15％乙醇存在下選擇性地提取本發(fā)明硫酸多糖。
此外，當在從褐藻中提取本發(fā)明硫酸多糖的過程中使用能與藻酸形成沉淀的無機鹽例如氯化鈣或乙酸鈣時，可顯著減輕藻酸的混入，對于其后進行的純化，這是有利的。
提取本發(fā)明硫酸多糖所采用的溫度優(yōu)選為50℃或50℃以下，在15-30℃是有利的。
提取所采用的pH可與溫度有關，但是，因為本發(fā)明硫酸多糖對酸和堿不穩(wěn)定，因此優(yōu)選在約pH6-8的中性范圍內進行提取。
提取可在攪拌下進行，但是在非剪切條件下進行是最有利的，由此可高效率地制備本發(fā)明硫酸多糖。
上述褐藻提取物經常被雜質例如中性糖和蛋白質污染。利用其中分子量約為100000或100000以下的分子被排除的超濾法可容易地將中性糖除去。在除去蛋白質時，用蛋白質酶等處理是有效的。
在制備是得自本發(fā)明硫酸多糖的低分子物質的本發(fā)明硫酸糖時，用能通過選擇性地作用于本發(fā)明硫酸多糖而釋放出本發(fā)明硫酸糖的內硫酸多糖降解酶處理本發(fā)明硫酸多糖。對于所述內硫酸多糖降解酶無特別限定，其實例是由Alteromonas sp.SN-1009(FERM BP-5747)產生的內硫酸多糖降解酶(在下文實施例1-(1)中提及)。
用上述內硫酸多糖降解酶處理后，所得反應產物可直接使用，但是當用作藥物或試劑時，建議從反應溶液中純化本發(fā)明硫酸糖?？刹捎贸瑸V進行純化，或使用陰離子交換樹脂、疏水色譜用樹脂、凝膠過濾樹脂等進行純化。
可從通過用上述內硫酸多糖降解酶直接處理未加工褐藻而獲得的降解產物純化本發(fā)明硫酸糖，或者可從通過用上述內硫酸多糖降解酶處理干燥的海藻、醇洗海藻、含有本發(fā)明硫酸多糖的物質等而獲得的降解產物純化本發(fā)明硫酸糖。當在上述酶反應中結合從反應溶液中分離本發(fā)明硫酸糖的步驟時，可改善制備本發(fā)明硫酸糖的效率。
本發(fā)明硫酸糖的實例是其中在式[Ⅰ]中n是1-5的多種硫酸糖，并且根據(jù)用上述內硫酸多糖降解酶處理本發(fā)明硫酸多糖的酶作用條件，可制備具有不同分子量的硫酸多糖。每一所得硫酸多糖可通過上述純化手段從利用例如凝膠過濾或超濾將硫酸糖進行分子量分級而獲得的分級產物中純化。凝膠過濾的實例是，使用Cellulofine GCL-300來制備分子量為例如25000以上、＜10000-25000、＜5000-10000等的分級部分，另一實例是使用Cellulofine GCL-90將分子量為20000或20000以下的部分分離成分子量為例如＜15000-20000、＜10000-15000、＜5000-10000等的分級部分。
對于超濾，可以使用超濾膜和超濾用中空纖維制品。例如，分子量為30000或30000以下和分子量為6000或6000以下的分級部分可分別用FE10-FUS0382和FE-FUS-653(二者皆由Daicel制造)制得。當聯(lián)合使用凝膠過濾和超濾時，可制得任意分子量的分級部分，并且可從所制得的分級部分中分離到所需硫酸糖。因此，本發(fā)明硫酸糖也包括其中在式[Ⅰ]中n大于等于5的硫酸糖。
對于本發(fā)明硫酸多糖和硫酸糖的鹽，它們是可藥用鹽，并且可通過常規(guī)方法制得。
通過本發(fā)明制得的硫酸多糖或其鹽具有非常高的巖藻糖殘基含量及其硫酸化度，并可用作研究含有硫酸巖藻糖的多糖的結構的試劑，還可用作研究含有硫酸巖藻糖的多糖的生理功能的試劑。
對于本發(fā)明硫酸多糖和本發(fā)明硫酸糖中的硫酸酯基團，硫酸酯基團的數(shù)目可隨硫酸多糖提取條件和硫酸糖制備條件的不同而不同。例如，硫酸酯基團的酯鍵在酸性條件下通常很弱，而鍵和在巖藻糖2-位和3-位上的硫酸酯在堿性情況下很弱。因此，對于本發(fā)明硫酸多糖和本發(fā)明硫酸糖中的硫酸酯基團數(shù)目無特別限定，但是通過設定適宜條件，任一硫酸酯基團含量都是可能的。
由于巖藻糖殘基中的甲基，本發(fā)明硫酸糖、硫酸多糖或它們的鹽還表現(xiàn)出疏水性，因此其對多種堿性有機物質和蛋白質都具有高度親和力。因此，本發(fā)明硫酸糖、硫酸多糖或它們的鹽不僅具有高度持水能力，還由于其疏水性而對例如角質層具有高度親和力，因此本發(fā)明硫酸糖、硫酸多糖或它們的鹽可用作化妝物質。
本發(fā)明硫酸糖、硫酸多糖或它們的鹽可通過與適用于美容劑的任意物質混合來使用。通常情況下，本發(fā)明硫酸糖、硫酸多糖或它們的鹽可通過與水、醇、脂肪/油、脂肪酸、甘油、無機鹽、防腐劑、表面活性劑、維生素、氨基酸、糖等物質混合而作為洗劑、洗面奶、霜劑等來使用。
含有本發(fā)明硫酸多糖的物質是從屬于褐藻例如Kjellmaniellacrassifolia、海帶(Laminaria japonica)、Undaria pinnatifida、鵝掌菜(Ecklonia kurome)、巨藻(giant kelp)、Lessonia nigrescens等的未加工或干燥的海藻、或者通過用含有60％或60％以上有機溶劑的溶液洗滌上述海藻而獲得的產物(所有這些物質在下文中都稱為“海藻原料”)中提取的。水、鹽例如氯化鉀和氯化鈉的水溶液、和/或有機溶劑例如40％或40％以下乙醇等可用作提取液。例如，在50℃或50℃以下溫度或在攪拌下，將上述海藻材料浸泡在上述提取液中以制備含有本發(fā)明硫酸多糖的物質。對于含有本發(fā)明硫酸多糖的物質無特別限定，只要其含有其中本發(fā)明硫酸糖是基本構成糖組分的硫酸多糖即可，在所得含有本發(fā)明硫酸多糖的物質中，除了本發(fā)明硫酸多糖以外，還有可能含有多糖、藻酸、氨基酸、糖醇、脂肪/油、無機鹽、蛋白質等。由于本發(fā)明硫酸多糖的生理活性，含有本發(fā)明硫酸多糖的物質表現(xiàn)出病毒感染抑制活性、受精抑制活性、抗炎活性、抑制血管內皮瘤增厚活性、抑制血栓形成活性、清除血脂活性、降低血清膽固醇的活性、抗過敏活性等，因此可用作藥物。由于本發(fā)明硫酸多糖的生理活性，含有本發(fā)明硫酸多糖的物質表現(xiàn)出潤濕活性、抑制黑色素染料合成活性等，因此可用作美容劑。在含有本發(fā)明硫酸多糖的物質中含有的本發(fā)明硫酸多糖的實例是，含有巖藻糖作為其構成糖和約2分子硫酸酯基團/巖藻糖分子的硫酸多糖。所述硫酸多糖的硫酸酯基團可以與海水或提取物中存在的陽離子例如鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子等(作為抗衡離子)結合。從海藻中提取的所述硫酸多糖通常與源自海藻且具有強粘彈性的蛋白質交聯(lián)，因此通過凝膠過濾法測定分子量是不合適的。然而，當在高濃度鹽例如1M或1M以上的氯化鈉存在下攪拌1小時或更長時間時，交聯(lián)鍵可裂解，就能測定所述硫酸多糖的分子量。當使用支鏈淀粉作為標準物時，測定的分子量約為10000000。
含有本發(fā)明硫酸多糖的物質還包括如下所述制得的被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖。因此，被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖是通過包括下述步驟的方法制得的在非破壞性條件下將硫酸多糖與多陽離子物質的交聯(lián)物從海藻中提取出來，或者提取出所述硫酸多糖的溶液，然后向其中加入具有比所述硫酸多糖溶液pH高的等電點的多陽離子物質。
硫酸多糖性質的實例有吸水性、持水性、粘性、纖維形成性、以及粘彈性，這些性質隨從原料中提取條件的微小不同而有很大不同。雖然這些性質使得它們非常適于用作化妝品、潤滑劑和濕潤劑，但是難以以良好再現(xiàn)性制備這些硫酸多糖，并難以控制它們的性質。
因此，當把硫酸多糖用作化妝品、潤滑劑、濕潤劑或一些類型藥物時，由于不能獲得良好使用感覺和再現(xiàn)這些性質，會給它們的上市帶來嚴重問題，除非在吸水性、持水性、粘彈性等方面有良好再現(xiàn)性。然而，依據(jù)本發(fā)明，能提供含有其中吸水性、持水性、粘彈性等是穩(wěn)定的本發(fā)明硫酸多糖的物質，所述物質的制備方法和應用。
因此，本發(fā)明者們已經對本發(fā)明硫酸多糖和多陽離子物質例如蛋白質之間的相互作用進行了充分研究，并已發(fā)現(xiàn)，當硫酸多糖在一定條件下與多陽離子物質共存時，粘彈性有顯著增加。
本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，包含在褐藻中的硫酸多糖以其天然形式與包含在褐藻中的蛋白質交聯(lián)，并且可以獲得含有具有高粘彈性、同時在一定條件下保持其交聯(lián)的硫酸多糖的物質。
對于本發(fā)明硫酸多糖無特別限定，其實例有含有硫酸巖藻糖的多糖、硫酸葡聚糖、角叉菜膠、肝素、硫酸鼠李糖和硫酸軟骨素。
對于本發(fā)明中的多陽離子物質沒有特別限定，例如可以使用蛋白質、多肽、多胺、聚乙二胺、聚葡萄胺、聚半乳糖胺等多陽離子物質。
當在下述條件下將硫酸多糖與多陽離子物質進行交聯(lián)時，可顯著提高硫酸多糖的粘彈性pH比所用硫酸多糖的等電點高，pH比所用多陽離子物質的等電點低，共存電解質的濃度足夠低以使硫酸多糖與多陽離子物質的交聯(lián)不被破壞，并且多陽離子物質的加入量比將硫酸多糖所有電荷都抵消所需的量要少。
當使用具有相當高等電點的蛋白質例如明膠或膠原來作為多陽離子物質時，就有許多正電荷，并且它們易于與硫酸多糖交聯(lián)，因此，就容易給出粘彈性。然而，甚至當?shù)鞍踪|具有相當?shù)偷牡入婞c時，如果使硫酸多糖溶液的pH低于所用蛋白質的等電點時，也能給硫酸多糖提供類似于使用明膠和膠原所給出的強粘彈性。
可用藻類物質制備依據(jù)本發(fā)明被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖。例如，對于包含在褐藻中的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖，其提取效率與性質隨提取方法的不同而有很大不同。
如果只是為了在短時間內獲得大量含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖，當把藻類物質粉碎、并在加熱或攪拌下用水或酸、鹽、堿等的水溶液提取時，可容易地提取到含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖。
然而，由此制得的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖具有較小分子量，并且與在藻類物質中存在的形式相比，幾乎沒有表現(xiàn)出任何粘彈性。因此，當用于化妝品時，雖然可以獲得作為硫酸多糖的效果，但是沒有任何特性例如粘性和光滑性，并且也幾乎不能用作潤滑劑。
然而，當在不高于50℃的溫度下、或優(yōu)選在不高于約30℃的溫度下、將攪拌速度設定為幾乎不產生剪切力例如使具有強粘彈性的提取物質不從藻類物質中分離出來，把藻類物質浸泡在近中性的水或水溶液中時，就可能提取出與該藻類物質中的蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖。
與蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖本身具有類似于新鮮雞蛋蛋白質的性質，即粘彈性。
能相當容易地將蛋白質與含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖之間的交聯(lián)分開。當將與蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖攪拌時，液體沿著攪拌軸卷起(魏森貝格效應)，但是當在剪切力很強的情況下長時間攪拌時，粘彈性就降低了，并且液體表面在與攪拌軸接觸的區(qū)域變得相當空。此外，可通過加熱、加入高濃度鹽、用蛋白質酶處理來將蛋白質與含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖之間的交聯(lián)分開，由此粘彈性就消失了。
按上述方法制備的、與蛋白質交聯(lián)的、含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的強粘彈性并不是含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖所固有的性質，而是當把含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖與蛋白質交聯(lián)時所獲得的性質。
因此，可將失去其粘彈性的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的粘彈性復原，當把多陽離子物質例如蛋白質加到所述含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖中時，可容易地將粘彈性復原。通過改變加入多陽離子物質例如蛋白質的量，還能將粘彈性調至任意程度。因此，本發(fā)明提供了加強硫酸多糖的粘彈性的方法，其特征在于，將多陽離子物質加到硫酸多糖中。
例如，當在下述條件下進行混合時，即其中pH比多陽離子物質例如蛋白質的等電點稍低，并且多陽離子物質以能使得硫酸多糖例如含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的電荷沒有被抵消的量加入，在多陽離子物質例如蛋白質的混合量與含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的溶液的粘彈性之間有正相關。
不言而喻，當硫酸多糖例如含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的溶液的pH比加入的多陽離子物質的等電點低很多，或者多陽離子物質的加入量非常高以至于其抵銷了含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的電荷時，就會形成沉淀，并且使粘彈性降低。
對于用于制備與蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的海藻來說無特別限定，只要含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖，可使用任意種類的褐藻，例如Kjellmaniella crassifolia、Kjellmaniella gyrate(tangleflake)、海帶(Laminaria japonica)、Ecklonia cava、Eisenia bicyclis、Undaria pinnatifida、海蘊(Nemacystus decipens)、Cladosiphonokamuranus等。
褐藻可以以任意形式使用，例如未加工海藻、干燥的海藻、鹽化海藻等。
在依據(jù)本發(fā)明提取與蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖之前，當用約60-100％醇洗滌海藻時，可除去海藻粘附的鹽、色素等。在依據(jù)本發(fā)明提取與蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的過程中，可使用多種溶劑例如水、鹽水、含醇水等。然而，鹽具有將含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖與蛋白質之間的交聯(lián)打開的作用，從而導致粘彈性降低，因此，鹽的濃度優(yōu)選為100mM或100mM以下。至于醇，優(yōu)選使用30％或30％以下的醇。
提取溫度優(yōu)選為50℃或50℃以下，在5-30℃是有利的。在提取期間，可并進行攪拌，但是如果不將提取溶液攪拌，則需要進行長時間提取。當進行攪拌時，應當將攪拌速度選定為，使與蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的粘彈性不能低于必要以上。然而，剪切力的強度對粘彈性的影響比攪拌速度對粘彈性的影響大很多，因此，優(yōu)選在低攪拌速度、非剪切條件下進行提取。
可通過加入多陽離子物質例如明膠或膠原來將由攪拌導致的減小的粘彈性復原。
因此，當把多陽離子物質加到具有低粘彈性的硫酸多糖中時，可增強該硫酸多糖的粘彈性，并且可以提供含有至少一種具有低粘彈性的硫酸多糖和多陽離子物質作為構成組分的組合物。所述組合物作為具有強粘彈性的組合物具有多種用途，包括用作化妝品和潤滑劑。
對于被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖，可使用由此獲得的提取物，或在進一步純化后使用。
含有本發(fā)明被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖作為有效成分的藥物制劑例如口內制劑可這樣制得，即使用本發(fā)明被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖作為活性組分，并與已知藥物載體混合。
當唾液分泌不足以致于口干并且開口和閉口很困難時，把本發(fā)明口內制劑置于個體口中可顯著改善癥狀。
此外，本發(fā)明被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖可用作潤滑劑。本發(fā)明這種潤滑劑非常平滑，具有良好潤滑作用，當把各種醫(yī)療器械或藥物插入肛門或陰道時，其表現(xiàn)出非常好的潤滑作用。其還可以在性交或按摩期間用作潤滑劑。
本發(fā)明被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖可通過與可用作美容劑的任意物質混合來使用。通常情況下，將其與水、醇、脂肪/油、脂肪酸、甘油、無機鹽、防腐劑、表面活性劑、維生素、氨基酸、糖等物質混合而作為洗劑、洗面奶、霜劑等來使用。
當本發(fā)明被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖用作化妝品時，由于其粘彈性它在使用時表現(xiàn)出光滑和良好感覺，并且當涂在皮膚上時，其粘質物被立即吸附到皮膚上。因此，涂敷后沒有任何粘性，對于化妝來說這是非?？扇〉奶匦?。當把含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖用作硫酸多糖時，上述優(yōu)選特征是特別顯著的。
本發(fā)明硫酸糖和本發(fā)明硫酸多糖可用作抗原?？赏ㄟ^常規(guī)方法制備抗體，例如，用本發(fā)明硫酸糖或本發(fā)明硫酸多糖與佐劑一起使動物例如兔子免疫，由此可制得多克隆抗體。單克隆抗體可這樣制得，將黑素瘤細胞與產生抗體的B細胞(將抗原免疫以選擇能產生所需抗體的雜交瘤)融合，然后把所述細胞培養(yǎng)。由此制得的抗體可用于純化本發(fā)明硫酸糖或本發(fā)明硫酸多糖。其還可用于在海藻中鑒定本發(fā)明硫酸多糖。例如，當使用本發(fā)明抗體時，可容易地測得本發(fā)明硫酸多糖在海藻提取物中的含量，因此能高效地制備含有高含量本發(fā)明硫酸多糖的提取物。因此，我們發(fā)現(xiàn)，在例如Kjellmaniella crassifolia、Lessonia nigrescens、海帶(Laminaria japonica)等的提取物中含有高含量的本發(fā)明硫酸多糖，所以在工業(yè)上能高效地制備硫酸多糖。此外，能識別本發(fā)明硫酸糖或本發(fā)明硫酸多糖的抗體可用于搞清楚本發(fā)明硫酸糖或本發(fā)明硫酸多糖的生理功能。因此，例如，其可用于分析本發(fā)明硫酸糖或本發(fā)明硫酸多糖的抑制受精功能、抑制病毒感染功能、體內新陳代謝功能等。
本發(fā)明硫酸糖可用作糖鏈工程學用物質，當通過日本特公平5-65108中公開的方法將其進行2-氨基吡啶化以制備其2-氨基吡啶基衍生物時，就能提供非常適于用作糖鏈工程學用物質的物質。
此外，能制備含有本發(fā)明硫酸糖和/或本發(fā)明硫酸多糖作為有效成分的制劑，例如抗腫瘤劑、癌轉移抑制劑、抗病毒劑、受精抑制劑、抗炎劑、內膜增生抑制劑、血栓形成抑制劑、血脂清除劑、血清膽固醇降低劑等藥物。這些藥物可用于治療或預防需要將這些藥物給藥的疾病。含有本發(fā)明硫酸多糖的物質也可以用于制備這些藥物。本發(fā)明還能提供具有上述生理活性的食品或飲料，其中包含選自本發(fā)明硫酸糖、本發(fā)明硫酸多糖、和含有本發(fā)明硫酸多糖的物質，或將所述物質稀釋在所述食品或飲料中，或將所述物質加到所述食品和飲料中。此外，本發(fā)明還能提供包含選自本發(fā)明硫酸糖、本發(fā)明硫酸多糖、和含有本發(fā)明硫酸多糖的物質的化妝品。
實施例下面通過下述實施例來更具體地舉例說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不僅限于這些實施例所覆蓋的范圍。實施例1(1)將Alteromonas sp.SN-1009(FERM BP-5747)接種到含有600ml培養(yǎng)基(在120℃滅菌20分鐘)(pH8.2)的兩升錐形瓶中，其中所述培養(yǎng)基由含有0.25％葡萄糖、1.0％胨和0.05％酵母提取物的人造海水(Jamarin Laboratory出產)組成，在25℃培養(yǎng)26小時，以生成接種培養(yǎng)基。將由含有1．0％胨、0.02％酵母提取物、0.2％在下述實施例中提及的硫酸多糖、和0.01％防沫劑(KM70，由Shin-Etsu ChemicalIndustry出產)的人造海水(pH8.0)組成的培養(yǎng)基置于30升廣口瓶發(fā)酵器中，并在120℃滅菌20分鐘。冷卻后，將600毫升上述制備的接種培養(yǎng)基接種，并在換氣10升/分鐘和250rpm的攪拌下于24℃培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)基離心，以給出細胞和上清液。把所得上清液通過裝配有排除分子量為10000的中空纖維的超濾系統(tǒng)濃縮，并用硫酸銨(85％飽和度)鹽析，通過離心分離收集所得沉淀物，并用含有1/10濃度人造海水的Tris-HCl緩沖液(pH8.2)透析，以獲得能選擇性地作用于本發(fā)明硫酸多糖的600ml內硫酸多糖降解酶。
(2)用裝配有具有直徑為1mm網(wǎng)眼的篩網(wǎng)的剪切碾磨機(由MasukoSangyo出產)將干燥的Kjellmaniella crassifolia(2kg)粉碎，把所得海帶碎片懸浮在20升80％乙醇中，并在25℃攪拌3小時，用濾紙過濾，把殘余物充分洗滌。將所得殘余物懸浮在含有上述實施例1-(1)中制備的內硫酸多糖降解酶、10％乙醇、100mM氯化鈉、50mM氯化鈣和50mM咪唑的20升緩沖液(pH8.2)中，把所得懸浮液在25℃攪拌48小時。將懸浮液通過具有32μm網(wǎng)眼的不銹鋼金屬絲網(wǎng)過濾，并用含有50mM氯化鈣的10％乙醇洗滌。將所得殘余物再懸浮在10升含50mM氯化鈣的10％乙醇中，攪拌3小時，通過不銹鋼金屬絲網(wǎng)過濾，然后洗滌。之后，將所得殘余物在同一條件下再次懸浮，攪拌16小時，并通過直徑為32μm的不銹鋼金屬絲網(wǎng)過濾，然后洗滌。
收集所得濾液和洗滌液，并流過裝配有排除分子量為3000的中空纖維的超濾系統(tǒng)，以分離成濾液和非濾液。
用旋轉蒸發(fā)儀將濾液濃縮至約3升，并離心以獲得上清液。用裝配有排除分子量為300的膜的電透析器將所得上清液脫鹽，向其中加入乙酸鈣以使乙酸鈣濃度為0.1M，通過離心除去生成的沉淀物。把上清液置于用50mM乙酸鈣預平衡的DEAE-Cellulofine(樹脂量4升)，用50mM乙酸鈣和50mM氯化鈉充分洗滌，并用梯度為50mM-800mM的氯化鈉洗脫。每管洗脫收集500ml洗脫液。通過乙酸纖維膜電泳法(《分析生物化學》(Analytical Biochemistry)，37，197-202(1970))分析收集部分，結果發(fā)現(xiàn)，其中硫酸鈉濃度約為0.4M(no.63級分附近)的洗脫下來的硫酸糖是均質的。此外，在約0.6M(no.67級分附近)濃度洗脫下來的硫酸糖在電泳方面幾乎是均質的。
因此，首先將no.63級分濃縮至150ml，向其中加入氯化鈉以使氯化鈉濃度為4M，置于用4M氯化鈉預平衡的Phenyl-Cellulofine(樹脂量200ml)，用4M氯化鈉充分洗滌。收集未吸附的硫酸糖部分，用裝配有排除分子量為300的膜的電透析器進行脫鹽，獲得了505ml脫鹽溶液。
將40ml所得脫鹽溶液置于用含有10％乙醇的0.2M氯化鈉預平衡的Cellulofine GCL-90柱(4.1cm×87cm)以進行凝膠過濾。以每級分9.2ml的速度進行收集。
通過苯酚-硫酸法(《分析化學》(Analytical Chemistry)，28，350(1956))來測定所有級分中糖的總量。
結果是，硫酸糖形成了峰值，收集所述峰值的中間部分(nos.63-70級分)，用裝配有排除分子量為300的膜的電透析器進行脫鹽，并冷凍干燥，獲得了112mg本發(fā)明硫酸糖干燥產物。
把該干燥產物部分進行糖組成分析和質譜分析。
此外，通過常規(guī)方法將10mg該干燥產物用重水取代，并進行NMR分析。
糖組成分析結果是，所得硫酸糖僅由巖藻糖構成。
用APⅠ-Ⅲ質譜儀(Perkin-Elmer Sciex)測得的硫酸糖的質譜結果如附圖1所示，分析結果如下。因此，附圖1是表明硫酸糖質譜結果的圖，其中縱坐標表示相對強度(％)，橫坐標表示m/z值。
對于分子量，當所有硫酸酯基團都呈鈉鹽形式時，結果是2264±1。因此，既然硫酸糖的構成糖僅是巖藻糖，已經發(fā)現(xiàn)，有7個巖藻糖分子和12個硫酸酯基團結合在一起，所有硫酸酯基團都呈鈉鹽形式，并且理論分子量為2265。
因此，當以“M”表示該物質時，附圖1中主要信號的賦值如下m/z 1109.09---[M-2Na+]2-(計算值1109.5)731.45---[M-3Na+]3-(計算值732)542.75---[M-4Na+]4-(計算值543.25)430.05---[M-5Na+]5-(計算值430)結果是，該物質是由7個巖藻糖分子和12個硫酸酯基團構成的低聚糖。
然后，為了測定巖藻糖的結合形式以及與硫酸酯基團的結合位點，用核磁共振儀(JNM-α500；由Nippon Denshi出產)進行NMR分析。通過HMBC法分析構成糖的結合形式，HMBC法是1H-檢測異核探測法。對于1H-NMR賦值，使用DQF-COSY法和HOHAHA法，對于13C-NMR賦值，使用HSQC法。
NMR的賦值結果如下，本發(fā)明硫酸糖的1H-NMR光譜和13C-NMR光譜分別如附圖2和附圖3所示。對于在1H-NMR中的化學位移，二氧雜環(huán)己烷的化學位移值為3.53ppm，對于13C-NMR，二氧雜環(huán)己烷的化學位移值為66.5ppm。二者都是在60℃進行測定的。因此，附圖2是表示本發(fā)明硫酸多糖1H-NMR光譜的圖，附圖3是表明本發(fā)明硫酸糖13C-NMR光譜的圖。在附圖2和附圖3中，縱坐標和橫坐標分別表示信號強度和化學位移值(ppm)。
1H-NMR(D2O)δ5.30(1H，d，J=3.1Hz，A-1-H)，5.23(1H，d，J=3.4Hz，B-1-H)，5.20(1H，d，J=3.4Hz，E-1-H)，5.19(1H，d，J=3.7Hz，F(xiàn)-1-H)，5.18(1H，d，J=2.8Hz，C-1-H)，5.16(1H，br-s，D-1-H)，5.09(1H，d，J=4.3Hz，G-1-H)，4.72(1H，d，J=2.4Hz，B-4-H)，4.67(1H，t，J=2.3Hz，A-4-H)，4.65(1H，m，E-4-H)，4.64(1H，m，D-4-H)，4.62(1H，m，C-4-H)，4.49(1H，d，J=3.1Hz，F(xiàn)-4-H)，4.37(1H，m，E-2-H)，4.36(1H，m，G-3-H)，4.35(1H，m，C-2-H)，4.33(1H，m，B-2-H)，4.32(1H，m，C-3-H)，4.30(1H，m，A-2-H)，4.27(1H，m，F(xiàn)-2-H)，4.27(1H，m，F(xiàn)-5-H)，4.25(1H，m，D-5-H)，4.24(1H，m，C-5-H)，4.21(1H，m，E-5-H)，4.18(1H，m，B-3-H)，4.18(1H，m，F(xiàn)-3-H)，4.17(1H，m，A-3-H)，4.17(1H，m，E-3-H)，4.16(1H，m，D-3-H)，4.14(1H，m，A-5-H)，4.10(1H，m，B-5-H)，3.98(1H，m，D-2-H)，3.97(1H，m，G-4-H)，3.96(1H，m，G-5-H)，3.78(1H，d-d，J=4.3，10.4Hz，G-2-H)，1.34(3H，d，J=7.OHz，H3of D-5-CH3)，1.15(3H，d，J=6.7Hz，H3of E-5-CH3)，1.12(3H，d，J=6.7Hz，H3of A-5-CH3)，1.11(3H，d，J=6.7Hz，H3of C-5-CH3)，1.08(3H，d，J=6.7Hz，H3of B-5-CH3)，1.06(3H，d，J=6．4Hz，H3of F-5-CH3)，1.04(3H，d，J=6.7Hz，H3of G-5-CH3)13C-NMR(D2O)δ99.2(G-1-C)，98.9(C-1-C)，98.3(B-1-C)，97.1(E-1-C)，94.6(F-1-C)，89.3(A-1-C)，89.3(D-1-C)，81.3(F-4-C)，80.6(B-4-C)，78.6(A-4-C)，77.9(G-3-C)，77.5(C-4-C)，77.4(E-4-C)，75．9(B-3-C)，75.4(A-2-C)，74.8(F-2-C)，74.5(B-2-C)，74.2(D-3-C)，73.9(A-3-C)，73.9(D-2-C)，73.6(C-2-C)，73.0(D-4-C)，73.0(E-2-C)，70.9(C-3-C)，70.6(D-5-C)，70.1(G-4-C)，69.9(E-3-C)，68.0(B-5-C)，67.5(A-5-C)，67．5(E-5-C)，66.9(C-5-C)，66.7(G-5-C)，66.5(F-3-C)，66.3(F-5-C)，65.6(G-2-C)，16.0(C of C-5-CH3)，15.9(C of B-5-CH3)，15.8(C ofE-5-CH3)，15.8(C of F-5-CH3)，15.4(C of G-5-CH3)，15.3(C ofA-5-CH3)，13.1(C of D-5-CH3)
NMR峰的賦值的編號如下述式[Ⅱ]所示。 從上述結果中可知，該物質是式[Ⅲ]所示硫酸糖。 (3)按照與no.63級分完全相同的方式將在實施例1-(2)中提及的DEAE-Cellulofine的no.67級分純化，以獲得冷凍干燥產物。
HPLC的分析結果是，所得產物是具有比no.63更高分子量的硫酸多糖，依據(jù)NMR分析結果，其光譜與no.63幾乎相同。
附圖4表示的是no.67的1H-NMR光譜，其中使用重水作為溶劑，并且在1H-NMR中的化學位移以其中二氧雜環(huán)己烷的化學位移值是3.53ppm的方式表示。在60℃進行測定。因此，附圖4是表示no.67的1H-NMR光譜的圖，其中縱坐標表示的是信號強度，橫坐標表示的是化學位移值(ppm)。
結果強烈地表明，no.67具有其中幾個no.63分子被結合的結構。因此，用在實施例1-(1)中提及的內硫酸多糖降解酶將no.67降解，并通過HPLC分析該降解產物，因此有許多反應產物被洗脫至與實施例1-(2)中提及的DEAE-Cellulofine的no.63中獲得的硫酸多糖相同的位置。
HPLC的分析條件如下柱Shodex SB 802.5柱溫25℃溶液含有5mM疊氮化鈉的50mM氯化鈉檢測示差折射率檢測器(Shodex RI-71)。
當用支鏈淀粉(由Showa Denko出產)作為標準物、通過凝膠過濾法測定上述no.67和no.63的分子量時，no.63具有基于支鏈淀粉的約8500的分子量，no.67具有約26000的分子量，由此發(fā)現(xiàn)no.67是no.63硫酸糖的三聚體。
對于7個糖殘基的重復結合位點，詳細地檢查no.67級分的1H-NMR光譜，結果發(fā)現(xiàn)在式[Ⅱ]中F巖藻糖的3位通過α-(1→3)鍵結合。
按類似方式制備式[Ⅲ]所示硫酸糖的五聚體，即本發(fā)明硫酸多糖降解產物中的硫酸糖(在式[Ⅰ]中n=5)。實施例2(1)用裝配有具有直徑為1mm網(wǎng)眼的篩網(wǎng)的剪切碾磨機(由MasukoSangyo出產)將干燥的Kjellmaniella crassifolia(2kg)粉碎，把所得海帶碎片懸浮在20升80％乙醇中，并在25℃攪拌3小時，用濾紙過濾，把殘余物充分洗滌。將所得殘余物懸浮在含有50mM氯化鈉并加熱至95℃的40升20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中，在偶爾攪拌下將該懸浮液在95℃加熱2小時以提取硫酸多糖。
將提取物中的懸浮物過濾，獲得了濾液，將過濾后的殘余物用3.5升100mM氯化鈉洗滌，獲得了另一份濾液。
將這兩份濾液合并，冷卻至30℃，加入3000單位的藻酸裂合酶(由Nagase Seikagaku Kogyo出產)，然后加入4升乙醇，將該混合物在25℃攪拌24小時。離心，把所得上清液通過裝配有排除分子量為100000的中空纖維的超濾系統(tǒng)濃縮至4升，然后用含有10％乙醇的100mM氯化鈉繼續(xù)進行超濾，直至不再有有色物質被濾出為止。
將在非濾液中形成的沉淀物通過離心除去，把上清液冷卻至5℃，并用0.5N鹽酸將pH調節(jié)至pH2.0，通過離心將由蛋白質等組成的沉淀物除去，用1N氫氧化鈉將所得上清液的pH迅速調至pH8.0。
然后用裝配有排除分子量為100000的中空纖維的超濾系統(tǒng)進行超濾，將溶劑用pH為8.0的20mM氯化鈉完全替代，然后再次將pH調節(jié)至8.0，進行離心，冷凍干燥，制得了約95g硫酸多糖。
(2)將10克實施例2-(1)中提及的干燥的硫酸多糖溶解在含有100mM氯化鈉、50mM氯化鈣和50mM咪唑的緩沖液(pH8.0)中，向其中加入20ml在實施例1-(1)中提及的內硫酸多糖降解酶，把該混合物在25℃反應24小時，用排除分子量為3500的透析管將反應溶液全透析，將該透析液(低分子量物質)濃縮，并通過裝配有排除分子量為300的膜的電透析器脫鹽，將一部分脫鹽液用Cellulofine GCL-90(4.1×87cm)進行凝膠過濾。每管收集10ml。
通過乙酸纖維膜電泳法和HPLC分析接近no.63的級分，結果發(fā)現(xiàn)，其表現(xiàn)出與實施例1-(2)提及的具有結構[Ⅲ]的硫酸糖相同的特征。因此，式[Ⅲ]所示硫酸糖是由硫酸多糖制得的。按類似方式制備式[Ⅲ]所示硫酸多糖的三聚體和五聚體，即在式[Ⅰ]中n分別是3和5的硫酸糖。實施例3按下述方式制備溶液(10升)，即將實施例2-(1)中提及的硫酸多糖溶解在含有100mM氯化鈉、50mM氯化鈣和50mM咪唑的緩沖液(pH8.0)中，其中使該硫酸多糖的濃度為5g/升。將30ml在實施例1-(1)中提及的內硫酸多糖降解酶加到2升所述硫酸多糖溶液中，用裝配有排除分子量為3000的中空纖維的超濾系統(tǒng)處理該混合物，并在25℃進行操作，過濾速度為200ml/小時。在操作期間，將上述硫酸多糖溶液以與濾液相同的量加到該酶反應溶液中。加入硫酸多糖溶液后，僅加入上述緩沖液。
之后，進行與實施例1-(2)中相同的操作將濾液濃縮和離心，將所得上清液脫鹽，通過乙酸鈣形成了沉淀物，通過離心獲得了上清液。按照與實施例1-(2)中相同的方式，用DEAE-Cellulofine純化所得上清液，以制備式[Ⅲ]所示硫酸糖。實施例4將Kjellmaniella crassifolia(500g)切成碎片，用10升80％乙醇洗滌，在50升含有1mM氯化鉀的10％乙醇中于25℃攪拌3天，通過具有32μm網(wǎng)眼的不銹鋼金屬絲網(wǎng)過濾，以獲得本發(fā)明硫酸多糖提取物。
將100ml所示提取物置于排除分子量為12000的透析管中，用5升水透析2次。將未透析部分冷凍干燥，以獲得本發(fā)明硫酸多糖，并測定本發(fā)明硫酸多糖的1H-NMR光譜(附圖5)和紅外光譜(IR)(附圖6)。因此，附圖5是表示本發(fā)明硫酸多糖1H-NMR光譜的圖，其中縱坐標是表示信號強度，橫坐標是表示化學位移值(ppm)。使用重水作為溶劑，對于1H-NMR中的化學位移，HOD的化學位移值表示為4.65ppm。附圖6是表示通過KBr法測定的本發(fā)明硫酸多糖IR光譜的圖，其中縱坐標表示的是透光度(％)，橫坐標表示的是波數(shù)(cm-1)。IR光譜是用FTIR-8000PC紅外分光光度計(由Shimadzu)測定的。
如附圖5所示，本發(fā)明硫酸多糖的1H-NMR光譜與附圖4所示的硫酸糖的1H-NMR光譜幾乎相同。因此，本發(fā)明硫酸多糖是其中式[Ⅰ]所示硫酸糖是其基本構成糖的硫酸多糖。
將4M氯化鈉加到本發(fā)明硫酸多糖提取物中，將混合物在劇烈攪拌下混合，將終濃度調節(jié)為1M氯化鈉溶液，通過HPLC分析來測定本發(fā)明硫酸多糖的分子量。本發(fā)明硫酸多糖具有基于標準物支鏈淀粉的約13000000的平均分子量。HPLC條件如下儀器L-6200型HPLC(Hitachi出產)柱Shodex SB-806HQ(8×300mm)(Showa Denko出產)洗脫液50mM氯化鈉檢測示差折射率檢測器，Shodex RI-71(Showa Denko出產)柱溫25℃當用在實施例1-(1)中提及的內硫酸多糖降解酶處理本發(fā)明硫酸多糖溶液時，檢測到了式[Ⅰ]所示硫酸糖。實施例5將Kjellmaniella crassifolia(500g)切成碎片，用10升80％乙醇洗滌，在內徑為40cm的容器中，在50升含有1mM氯化鉀的10％乙醇中于25℃以200rpm的速度攪拌2天，以提取本發(fā)明被海藻蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖。提取物具有強粘彈性，并表現(xiàn)出其中提取物沿著攪拌軸卷起的魏森貝格效應。含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖在Kjellmaniella crassifolia中的含量一般最多是占干燥海藻的約5％，因此，含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖在該提取物中的含量最多為0.05％。
然而，市售的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖的水溶液(Fucoidan；Sigma出產)不僅在0.05％濃度不表現(xiàn)出任何粘彈性，而且即使在高達2％的濃度也是如此，并且表現(xiàn)出與本發(fā)明與蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖完全不同的特征。
當通過蛋白質分析儀(Bio-Rad制造)測定該提取物的蛋白質含量時，結果發(fā)現(xiàn)是7.5μg/ml。
當用Activenase E(一種蛋白質酶，Kaken Pharmaceutical出產)以0.1mg/ml濃度處理該提取物時，提取物的粘彈性有顯著下降。
此外，當用10μl含有由Alteromonas sp.SN-1009(FERM BP-5747)生產的含有硫酸巖藻糖的多糖內降解酶的溶液處理5ml該提取物時，粘彈性完全消失了。
從上述結果可知，引起褐藻提取物粘彈性的物質是與蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖，并且當在特定條件下提取褐藻的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖時，可高效率地提取到本發(fā)明被蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖。
當把所得提取物涂敷在皮膚上時，首先注意到強的粘性，但是當將其輕微摩擦時，粘性就被吸附到皮膚中，使得沒有任何粘著性，并且皮膚潤濕了，因此該提取物非常適于用作皮膚養(yǎng)護化妝品。實施例6
(1)將Kjellmaniella crassifolia(50 g)切成碎片，用2升80％乙醇洗滌，在內徑為20cm的容器中，在5升含有1mM氯化鉀和0.075％對羥基苯甲酸乙酯的水溶液中于25℃以200rpm的速度攪拌2天，以提取本發(fā)明被蛋白質交聯(lián)的含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖。
該提取物具有強粘彈性，并表現(xiàn)出其中提取物沿著攪拌軸卷起的魏森貝格效應。該提取物的性質與實施例5提取物相同。對于其皮膚對乙醇敏感的人來說，該提取物是有效的化妝品。
(2)用裝配有具有直徑為1mm網(wǎng)眼的篩網(wǎng)的剪切碾磨機(由MasukoSangyo出產)將干燥的Kjellmaniella crassifolia(2kg)粉碎，把所得海帶碎片懸浮在20升80％乙醇中，把所得懸浮液在25℃攪拌3小時，用濾紙過濾，把殘余物充分洗滌。將所得殘余物懸浮在含有50mM氯化鈉并加熱至95℃的40升20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中，在偶爾攪拌下將該懸浮液在95℃加熱2小時以提取含有硫酸巖藻糖的硫酸多糖。
將提取物中的懸浮物過濾，獲得了濾液，將過濾后的殘余物用3.5升100mM氯化鈉洗滌，獲得了另一份濾液。將由此制得的提取物冷卻至25℃。與實施例5和實施例6-(1)中提及的提取物相比，該提取物含有更多的含硫酸巖藻糖的硫酸多糖，但是沒有表現(xiàn)出粘彈性。此外，甚至通過裝配有排除分子量為100000的中空纖維的超濾系統(tǒng)全脫鹽后，該提取物也沒有表現(xiàn)出強粘彈性，雖然其表現(xiàn)出對硫酸多糖呈特異性的粘性。因此，已經發(fā)現(xiàn)，當提取溫度太高時，不能制得本發(fā)明與蛋白質交聯(lián)的含硫酸巖藻糖的硫酸多糖。
(3)將Kjellmaniella crassifolia(500g)切成碎片，用10升80％乙醇洗滌，在內徑為40cm的容器中，在50升含有1mM氯化鉀的10％乙醇中于25℃以800rpm的速度攪拌2天，以提取含硫酸巖藻糖的硫酸多糖。該提取物的粘彈性很弱，而且在攪拌期間，沒有觀察到魏森貝格效應。當涂敷在皮膚上時，雖然該提取物表現(xiàn)出對含硫酸巖藻糖的硫酸多糖呈特異性的潤濕作用，但是其具有很小的對本發(fā)明與蛋白質交聯(lián)的含硫酸巖藻糖的硫酸多糖呈特異性的粘性，并且實際使用時的感覺完全不同。然而，其中含有的蛋白質的濃度為7.5μg/ml，與實施例5提取物中的蛋白質濃度相同。因此，已經發(fā)現(xiàn)，當攪拌速度太快時，或者換句話說，當攪拌施加的剪切力太大時，蛋白質與含硫酸巖藻糖的硫酸多糖之間的交聯(lián)被破壞了。
(4)當把實施例6-(1)中獲得的提取物在內徑為20cm的容器中以600rpm的速度在室溫攪拌18小時時，相對粘彈性從2.0降到了1.2。當把不同量的1％明膠水溶液加到粘彈性降低的含硫酸巖藻糖的硫酸多糖中時，粘彈性復原了。粘彈性與明膠終濃度之間的關系如下表1所示。
在下表1中，以相對值表示粘彈性。因此，當測試溶液通過重力從內徑為2mm的硅氧烷管垂直流下，并且通過玻璃棒將流到距離出口約1-5cm的測試溶液沿水平方向推動時，將在沒有切斷流動液情況下所能推動的最大距離(cm)定義為相對粘彈性。從測試溶液的液面到測試溶液出口的距離為20-21cm，水的相對粘彈性為0。
表1

從上述結果可知，通過強剪切力攪拌，本發(fā)明與褐藻蛋白質交聯(lián)的含硫酸巖藻糖的硫酸多糖的粘彈性降低了，但是當在適當pH或在適當鹽濃度條件下加入適當量明膠時，可將粘彈性復原，由此可獲得粘彈性產物。粘彈性產物具有表現(xiàn)出透明凍膠狀外觀的類溶膠性狀。
當加入的明膠的量太多時，粘彈性消失了，因此，已經發(fā)現(xiàn)，明膠增加或減少的量取決于含硫酸巖藻糖的硫酸多糖的量。實施例7當把實施例5提取物涂到其中唾液分泌不足以致于口非常干燥并難以開口和閉口、而且沒有任何制劑能改善該癥狀的80歲女士的口中時，口干燥、嘴唇裂口等得到了改善，并且開口和閉口的困難也得到了很大改善。此外，甚至當該提取物涂敷3個月或更長的連續(xù)時間時，該效果也維持下來。實施例8(1)將Kjellmaniella crassifolia(500g)切成碎片，用10升80％乙醇洗滌，在內徑為40cm的容器中，在50升含有1mM氯化鉀的10％乙醇中于25℃以120rpm的速度攪拌2天，以提取含硫酸巖藻糖的硫酸多糖。該提取物具有強的粘彈性，而且表現(xiàn)出其中提取物沿著攪拌軸卷動的魏森貝格效應。將該提取物通過具有32μm網(wǎng)眼的不銹鋼金屬絲網(wǎng)過濾，制備具有強粘彈性的含硫酸巖藻糖的硫酸多糖的溶液。
在攪拌下，將1升棕櫚油溶液(將1g棕櫚油(Kao出產，化妝用棕櫚油)溶解在1升乙醇中)加到46升含有含硫酸巖藻糖的硫酸多糖的溶液中，然后向其中加入1升甘油，以制備化妝洗劑。所得化妝洗劑既表現(xiàn)出潤濕作用(由于含硫酸巖藻糖的硫酸多糖的強粘彈性)，又表現(xiàn)出抗干作用(由于棕櫚油的作用)，其中棕櫚油是均勻分散，并不加入洗滌劑，因此所述化妝洗劑具有很好的使用感覺，沒有油粘性，并具有良好展開性。
按照類似方法，用椰子油(Kao出產，化妝用椰子油)代替棕櫚油制備另一化妝洗劑，結果發(fā)現(xiàn)所得化妝洗劑也具有良好使用感覺。
(2)將明膠和香料加到實施例6-(3)提取物中使其終濃度為0.02％，由此制得了含有明膠的化妝洗劑。以類似方式通過加入膠原制得了含有膠原的化妝洗劑。每一化妝溶液都含有具有高粘彈性的含硫酸巖藻糖的硫酸多糖，向其中加入蛋白質所導致的協(xié)同結果是，該化妝洗劑具有優(yōu)良潤濕性能和良好的展開性。
這樣，當使用上述化妝洗劑時，由于其粘彈性，使得使用感覺良好并具有光滑觸摸感，此外，當以適當量涂敷在皮膚上時，其表現(xiàn)出粘性被迅速吸附到皮膚中的性質。另外，其使用后無任何粘著性，作為化妝品這是非常有益的性質。實施例9將在實施例4中制備的本發(fā)明硫酸多糖提取物用作化妝洗劑。當涂敷在皮膚上時，由于具有光滑觸摸感使得其使用感覺良好，并且粘性被皮膚立即吸附。此外，其使用后無任何粘著性，作為化妝品這是非常有益的性質。另外，當使用該化妝洗劑時，其具有使面部和手背上的斑點顏色變淺的作用。
本發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明提供了用作藥物或糖鏈工程學研究試劑的的硫酸糖、硫酸多糖或它們的鹽。所述硫酸糖、硫酸多糖或它們的鹽由于具有持水性能等而非常適于用作化妝物質。
本發(fā)明還提供了具有高粘彈性的硫酸多糖及其制備方法。此外，本發(fā)明也提供了含有所述高粘彈性硫酸多糖的藥物制劑和化妝品。本發(fā)明藥物可用作例如口內制劑。另外，本發(fā)明高粘彈性硫酸多糖不僅具有優(yōu)良的持水性能和潤滑性，還由于其疏水性而對皮膚角質層具有高親和力，并且與皮膚有良好相容性，尤其是，本發(fā)明高粘彈性含硫酸巖藻糖的硫酸多糖非常適于用作化妝用素材。
權利要求
1．下述式[Ⅰ]所示硫酸糖，或以所述硫酸糖作為其基本構成糖組分的硫酸多糖以及它們的鹽， 其中R是OH或OSO3H；且n是1-5的整數(shù)。
2．權利要求1的硫酸多糖，其中所述硫酸多糖可從屬于昆布目的海藻中獲得。
3．權利要求1或2的硫酸多糖，其中所述硫酸多糖被多陽離子物質交聯(lián)。
4．權利要求3的硫酸多糖，其中所述多陽離子物質是蛋白質。
5．權利要求4的硫酸多糖，其中蛋白質是源自藻類的蛋白質和/或源自藻類的蛋白質以外的蛋白質。
6．權利要求5的硫酸多糖，其中所述蛋白質是膠原和/或明膠。
7．制備被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖的方法，其特征在于，所述方法包括在非破壞性條件下將硫酸多糖與多陽離子物質的交聯(lián)物從藻類物質中提取出來的步驟。
8．制備被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖的方法，其特征在于，將具有比硫酸多糖溶液pH高的等電點的多陽離子物質加到所述硫酸多糖溶液中。
9．增強硫酸多糖粘彈性的方法，其特征在于，將多陽離子物質加到硫酸多糖中。
10．含有至少一種具有低粘彈性的硫酸多糖和多陽離子物質的組合物。
11．藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑含有被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖作為有效成分。
12．權利要求11的藥物制劑，所述藥物制劑是口內制劑。
13．潤滑劑，其特征在于，所述潤滑劑含有被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖作為有效成分。
14．化妝品，其特征在于，所述化妝品含有被多陽離子物質交聯(lián)的硫酸多糖作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供了下述式(Ⅰ)所示硫酸糖,或以所述硫酸糖作為其基本構成糖組分的硫酸多糖以及它們的鹽,其中:R是OH或OSO
文檔編號C08B37/00GK1287558SQ99801901
公開日2001年3月14日 申請日期1999年2月10日 優(yōu)先權日1998年2月17日
發(fā)明者酒井武, 木村瞳, 片山薰, 嶼中一夫, 豬飼勝重, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社