一種重組畢赤酵母表達外源蛋白過程的專家控制系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組畢赤酵母表達外源蛋白過程的專家控制系統(tǒng)，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 國內(nèi)外有關(guān)誘導階段重組畢赤酵母優(yōu)化和控制的研宄報道主要集中于單變量 (因素）控制強化目標蛋白的合成積累，而對發(fā)酵過程的整體優(yōu)化（發(fā)酵性能提高+緩解 操作能耗）基本沒有考慮。但在畢赤酵母表達蛋白體系中，幾個重要的控制變量，溫度、DO、 山梨醇流加速度（共混誘導）等與細胞生理狀態(tài)間存在非常復雜的關(guān)系，單靠優(yōu)化控制一 個操作變量是難以取得滿意效果的。只有在分析各操作變量對發(fā)酵性能的單獨影響的基礎 上，對它們進行合理的耦聯(lián)、組合和復合控制，才可能使整個表達體系以適度的代謝/能量 供給水平、高能量再生效率、較低的細胞衰亡速度的方式操作運轉(zhuǎn)，真正實現(xiàn)蛋白的高效生 產(chǎn)表達。針對畢赤酵母誘導生產(chǎn)外源蛋白過程一類的、多控制/狀態(tài)變量、控制變量間存在 相互干涉、控制變量和被控（狀態(tài)）變量之間定量關(guān)系不明、性能指標難以獨立控制的復雜 過程，專家控制系統(tǒng)是一個解決問題的有效手段。專家控制系統(tǒng)是一個內(nèi)含有專家知識與 經(jīng)驗的智能型計算機控制系統(tǒng)，它通過構(gòu)建、實施和調(diào)整專家指令和規(guī)則，可以解決復合型 優(yōu)化控制過程的有關(guān)問題。
[0003] 在畢赤酵母發(fā)酵中，低溫誘導和山梨醇/甲醇共混誘導公認的作用就是抑制蛋白 酶的分泌、減少目標蛋白的降解、緩解細胞衰亡。另外，低溫（20°C )誘導可以改變甲醇代 謝中的代謝流分布、加大蛋白合成支路的碳代謝通量、提高能量（ATP)再生效率和目標蛋 白的濃度。而山梨醇/甲醇共混誘導緩解了甲醇作為唯一能源對細胞工作運轉(zhuǎn)所造成的壓 力、有益于緩解目標蛋白的降解和提高細胞合成蛋白的活性，同時還對醇氧化酶具有一定 程度的可逆性抑制作用、可以對甲醇消耗速度進行適度調(diào)控。本發(fā)明以節(jié)能的方式將發(fā)酵 溫度、山梨醇流加速度、溶氧同時在線控制于最優(yōu)水平，提高外源蛋白產(chǎn)量、降低操作成本 和能耗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 畢赤酵母誘導期的甲醇代謝和目標蛋白合成是一個非常復雜的過程，單靠優(yōu)化控 制一個操作變量是難以取得滿意效果的，本發(fā)明提出了一種重組畢赤酵母表達外源蛋白過 程的專家控制系統(tǒng)，發(fā)酵過程多變量在線計量和控制圖如圖1所示。其中，狀態(tài)變量甲醇濃 度通過甲醇在線測量電極（濃度水平固定）單獨控制。專家型復合控制系統(tǒng)對采集的狀態(tài) 數(shù)據(jù)進行在線計量得到NADH消耗速率r (e)_、ATP再生效率R，并對NADH消耗速率r?_、 ATP再生效率R和溶氧濃度DO這三個狀態(tài)變量進行邏輯分析，從而對山梨醇流加速度rSQK、 溫度T和攪拌轉(zhuǎn)速r Ae三個操作變量進行調(diào)節(jié)。
[0005] 本發(fā)明提供一種重組畢赤酵母表達外源蛋白過程的專家控制系統(tǒng)，所述控制系統(tǒng) 包括發(fā)酵裝置、信息采集裝置、控制裝置、執(zhí)行裝置；所述信息采集裝置包括甲醇在線測量 電極、尾氣分析儀、溶氧電極、溫度檢測電極、甲醇稱重裝置、山梨醇稱重裝置；所述信息采 集裝置將采集的信息傳給控制裝置；控制裝置對信息進行計算和邏輯處理后，控制執(zhí)行裝 置；所述執(zhí)行裝置包括山梨醇流加裝置、甲醇流加裝置、控溫裝置、攪拌電機。
[0006] 所述信息采集裝置采集甲醇濃度、攝氧率OUR、二氧化碳釋放率CER、溶氧濃度DO、 攪拌轉(zhuǎn)速r Ae、發(fā)酵液溫度T、甲醇消耗速度、山梨醇流加速度rSOT。
[0007] 所述攝氧率OUR、二氧化碳釋放率CER通過尾氣分析儀分析得到。
[0008] 所述甲醇消耗速度r_和山梨醇流加速度r SOT，在本發(fā)明的一種實施方式中，是通 過電子天平在線計量流加瓶的重量損失得到。
[0009] 所述甲醇濃度通過甲醇在線測量電極檢測，在本發(fā)明的一種實施方式中，是由控 制器單獨控制甲醇流加裝置，使發(fā)酵液中甲醇濃度處于固定水平。
[0010] 所述甲醇濃度，在本發(fā)明的一種實施方式中控制在5-15g/L。
[0011] 所述控制裝置在線計量狀態(tài)變量NADH消耗速率r?_H、ATP再生效率R并經(jīng)邏輯 分析后控制執(zhí)行裝置，從而控制山梨醇流加速度r SOT、溫度T和攪拌轉(zhuǎn)速rAe三個操作變量。
[0012] 所述控制裝置在線計量狀態(tài)變量NADH消耗速率r(e)NADH、ATP再生效率R，在線計量 方法如公式（1)、（2)、（3)、（4)所示：
【主權(quán)項】
1. 一種重組畢赤酵母表達外源蛋白過程的專家控制系統(tǒng)，所述控制系統(tǒng)包括發(fā)酵裝 置、信息采集裝置、控制裝置、執(zhí)行裝置；所述信息采集裝置包括甲醇在線測量電極、尾氣分 析儀、溶氧電極、溫度檢測電極、甲醇稱重裝置、山梨醇稱重裝置；所述信息采集裝置將采集 的信息傳給控制裝置；控制裝置對信息進行計算和邏輯處理后，控制執(zhí)行裝置；所述執(zhí)行 裝置包括山梨醇流加裝置、甲醇流加裝置、控溫裝置、攪拌電機。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的專家控制系統(tǒng)，其特征在于，所述信息采集裝置采集甲醇濃 度、攝氧率OUR、二氧化碳釋放率CER、溶氧濃度D0、攪拌轉(zhuǎn)速r Ae、發(fā)酵液溫度T、甲醇消耗速 度ι·ΜΛΙ、山梨醇流加速度rSOT。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的專家控制系統(tǒng)，其特征在于，所述控制裝置在線計量狀態(tài)變 量NADH消耗速率r?_、ATP再生效率R并經(jīng)邏輯分析后控制執(zhí)行裝置，從而控制山梨醇流 加速度溫度T和攪拌轉(zhuǎn)速r Ae三個操作變量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的專家控制系統(tǒng)，其特征在于，所述控制裝置在線計量狀態(tài) 變量NADH消耗速率r(e)_ H、ATP再生效率R，在線計量方法如下：
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的專家控制系統(tǒng)，其特征在于，所述控制裝置對NADH消耗 速率r(G)_、ATP再生效率R和溶氧濃度DO三個狀態(tài)變量進行分析；所述溶氧濃度DO劃分 成"高"、"中"和"低" 3個不同水平，其中大于60 %代表"高"、20-60 %代表"中"、小于20 % 代表"低";所述NADH消耗速率劃分成"高"、"中"和"低" 3個不同水平，ATP再生效 率R劃分成"高"、"低"2個不同水平；其中r?NADH& mmol/L/h為單位計，大于90代表"高"、 60-90代表"中"、小于60代表"低"且ATP再生效率R大于90 %代表"高"、小于90 %代表 "低"，或者是，r(G)_為80-100代表"高"、60-80代表"中"、40-60代表"低"且ATP再生效 率R大于80 %代表"高"、60-80 %代表"低"。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的專家控制系統(tǒng)，其特征在于，所述控制裝置對三個狀態(tài)變量 NADH消耗速率r(G)_、ATP再生效率R、溶氧濃度DO進行邏輯處理，處理方法如下： 如果DO、R和r(G)NADH都高，那么增加 T和r SQK，同時降低rAe; 如果DO和R高，r(G)_H中，那么T和r SQK不變，同時降低r Ae; 如果DO和R高，r(G)_H低，那么T、r SQK和r AG都降低； 如果DO高，R低，r?_高，那么降低T，增加 r SQK，同時降低rAe; 如果DO高，R低，r?_中，那么降低T，r SQK不變，同時降低r Ae; 如果DO高，R低，r?_低，那么T、r SQK和r Ae都降低； 如果DO中，R和，那么增加 T和r SQK，同時rAe不變； 如果DO中，R高，ι·ω_Ηφ，那么T、r s。,和r AG都不變； 如果DO中，R高，r(G)NAIJg，那么降低T和r SQK，同時rAe不變； 如果DO中，R低，r?_高，那么降低T，增加 r SQK，同時rAe不變； 如果DO中，R低，r(G)_中，那么降低T，同時r ^和r Ae不變； 如果DO中，R和r (°_低，那么降低T和r SQK，同時rAe不變； 如果DO低，R和r(G)_H高，那么T、r SQK和r AG都增加； 如果DO低，R高，r?_中，那么T和r SQK不變，同時增加 r Ae; 如果DO低，R高，r(G)NADH低，那么降低T和r SQK，同時rAe; 如果DO和R低，r(G)NADH高，那么降低T，同時增加 r ^和r Ae; 如果DO和R低，r(G)_H中，那么降低T，r SQK不變，同時增加 r Ae; 如果DO、R和r(G)NADH都低，那么降低T和r SQK，同時增加 rAe。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或3或6所述的專家控制系統(tǒng)，其特征在于，所述三個操作變量的調(diào) 節(jié)量由以下公式計算得到： T (t) = T (0) (1+ δ 1 a ) Tfflin^ T (t) ^Tfflax (5)
其中δ2、33分別代表T、rSOT和rAe的更新步長，它們的范圍分別為l-5、0.05-0. 5 和10-50 ; (0)代表各控制變量的初始值且初始值不等于0,（t)代表各控制變量的t時刻的 值；α、β、γ分別代表溫度T、山梨醇流加速度r SOT和攪拌速度r Ae的調(diào)節(jié)方向，其中+1代 表增加，〇代表不變，-1代表降低。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的專家控制系統(tǒng)，其特征在于，所述專家控制系統(tǒng)的控制周期 為 0· 1-0. 5h。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的專家控制系統(tǒng)，其特征在于，所述δ ηδ2、δ3分別為1、〇.1、 10 或者 1、0· 15、20。
10. 權(quán)利要求1所述專家控制系統(tǒng)在重組畢赤酵母表達外源蛋白過程中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組畢赤酵母表達外源蛋白過程的專家控制系統(tǒng)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。畢赤酵母表達外源蛋白時，幾個重要的控制變量如溫度、DO、山梨醇流加速度(共混誘導)等與細胞生理狀態(tài)間存在非常復雜的關(guān)系。針對這種控制變量相互干擾、控制變量和被控變量間定量關(guān)系不明、性能指標難以獨立控制的復雜過程，本發(fā)明提出了一種專家控制策略。專家控制系統(tǒng)是一個內(nèi)含專家知識與經(jīng)驗的智能型計算機控制系統(tǒng)，它通過構(gòu)建、實施和調(diào)整專家指令和規(guī)則，解決復合型優(yōu)化控制過程的有關(guān)問題?？刂葡到y(tǒng)以節(jié)能的方式將發(fā)酵溫度、山梨醇流加速度、溶氧同時在線控制于最優(yōu)水平，提高目的蛋白活性和濃度、降低操作成本和能耗。
【IPC分類】C12P21-00, C12M1-38, C12M1-02, C12R1-865
【公開號】CN104531522
【申請?zhí)枴緾N201410767928
【發(fā)明人】高敏杰, 詹曉北, 史仲平, 丁健, 楊帥
【申請人】江南大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月12日