菌體細(xì)胞的破碎方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種菌體細(xì)胞的破碎方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大多數(shù)的大腸桿菌基因工程菌屬于胞內(nèi)酶，因此需要先破碎菌體細(xì)胞才能使其胞內(nèi)的酶釋出，進(jìn)而利用該酶的生物催化性能，現(xiàn)有技術(shù)中，破碎菌體細(xì)胞的方法有很多種，按照外加作用力的施加與否大體上可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類:機(jī)械法主要有壓榨法(固體剪切作用)和高壓勻漿法(液體剪切作用)；非機(jī)械法主要有化學(xué)法、自溶法、酶解法以及凍融法等。實(shí)際生產(chǎn)中，無論是采用哪種破碎方法都需要確保對目標(biāo)產(chǎn)物酶的活性影響降至最低，目前，適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的破碎技術(shù)主要是機(jī)械法，然而其剪切力高，易造成敏感性酶的失活，另外，化學(xué)法破碎菌體細(xì)胞主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)小規(guī)模應(yīng)用，且該方法易引入雜質(zhì)，而酶解法成本又較高，因此這兩種方法也不適于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，相比而言，經(jīng)生產(chǎn)驗(yàn)證，凍融法更適用于破碎菌體細(xì)胞的大規(guī)模應(yīng)用，但是，凍融法破碎菌體細(xì)胞普遍采用冷藏庫進(jìn)行冷凍破碎，具體來說，就是將待破碎的菌體細(xì)胞置于冷藏庫先冷藏，再融解，這樣菌體細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高，即可引起細(xì)胞溶脹破碎，但是該方法不僅耗費(fèi)大量人力，而且破碎成本高，因此，尋求一種成本低、能夠快速實(shí)現(xiàn)菌體細(xì)胞破碎的方法，這對于利用菌體細(xì)胞內(nèi)的酶實(shí)現(xiàn)催化來說至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種成本低、能夠有效保證酶活的菌體細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化破碎方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種菌體細(xì)胞的破碎方法，其步驟如下:
[0005]a)冷凍:收集菌體發(fā)酵液，泵入片冰機(jī)的分水盤，分水盤上的菌體發(fā)酵液灑落在片冰機(jī)內(nèi)的結(jié)冰面上結(jié)成冰層；
[0006]b)融解破碎:菌液冰片通過冰刀從結(jié)冰面上刮離并落入冰倉先在-5?_90°C條件下冷凍l-10h，再在10-60°c條件下融解，即得破碎的菌體細(xì)胞液。
[0007]上述技術(shù)方案應(yīng)用片冰機(jī)破碎菌體細(xì)胞，其產(chǎn)生的有益效果在于:通過片冰機(jī)將菌體發(fā)酵液進(jìn)行冷凍，使得菌體發(fā)酵液與片冰機(jī)內(nèi)的結(jié)冰面進(jìn)行大面積接觸，如此不僅實(shí)現(xiàn)了菌體發(fā)酵液的快速制冰形成片狀的冰層，而且得到的冰層菌體發(fā)酵液極易融解，有效提高了菌體細(xì)胞的破碎效率，具體的，經(jīng)申請人分析驗(yàn)證，將冰層狀的菌體發(fā)酵液先置于冰倉冷凍1-10h，然后再進(jìn)行融解處理，這樣使得酶活能夠得到顯著提升。
[0008]實(shí)際上，本申請所述的片冰機(jī)也就是現(xiàn)有技術(shù)中常見的片冰機(jī)，其制成的片冰廣泛用來冷凍食品。本申請公開的上述方法在實(shí)際應(yīng)用時，根據(jù)菌體細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的不同，可以選擇一次或者反復(fù)多次將菌體細(xì)胞進(jìn)行上述的冷凍和凍融步驟，比如，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，針對細(xì)胞壁比較脆弱的革蘭氏陰性菌來說，其菌體發(fā)酵液通過一次冷凍和融解即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請采用片冰機(jī)進(jìn)行冷凍的方法成本低，能夠有效保證菌體細(xì)胞內(nèi)酶的釋出，另外，本申請公開的技術(shù)方案是菌體發(fā)酵液的冷凍和融解步驟分別在片冰機(jī)和冰倉內(nèi)進(jìn)行，這樣可以防止冷凍裝置內(nèi)部的溫度上下起伏，影響冷凍裝置的使用效果。
[0009]作為進(jìn)一步的方案:所述步驟a還包括以下步驟:先將收集的菌體發(fā)酵液在不超過50°C條件下濃縮10-100倍，然后將得到的濃縮菌液泵入片冰機(jī)結(jié)成冰片，分離或過濾濃縮菌體發(fā)酵液的裝置為膜、離心機(jī)中的一種。具體的，膜過濾條件:溫度控制在50°C以下，膜孔徑為50nm_0.8 μπι，壓力為0.1-0.5Mpa ;離心機(jī)離心條件:分離因數(shù)在6000-12000之間，溫度控制在40°C以下。因菌體發(fā)酵液過濾或者離心得到的清液中主要為菌體雜蛋白，因此在進(jìn)行菌體細(xì)胞破碎前可先將其中的雜蛋白去除并噴霧干燥制成飼料蛋白，而將濃縮的菌體發(fā)酵液進(jìn)行冷凍和融解處理，這樣可以有效提高菌體細(xì)胞的破碎效率。
[0010]進(jìn)一步的，步驟a的片冰機(jī)中的制冰劑溫度為-5 50°C,制冰系統(tǒng)溫度為_5—-50°C;步驟a中發(fā)酵液泵入分水盤的方式采用軟管泵。采用軟管泵作為輸送菌體發(fā)酵液的管體可以避免普通離心泵的剪切力對酶的破壞，如此可確保酶活保留率高達(dá)99%。
[0011]更為具體的方案:所述步驟b中片冰機(jī)的結(jié)冰面上包含冰狀和液狀的菌體發(fā)酵液，其中冰狀的菌體發(fā)酵液從片冰機(jī)的落冰口落入冰倉，液狀的菌體發(fā)酵液落至片冰機(jī)的接水盤并回流至分水盤上重新進(jìn)行凍融破碎處理?，F(xiàn)有技術(shù)的片冰機(jī)主要是用來將水制成片冰用于冷凍食品，而考慮其使用效果，對于少量未結(jié)成冰的水來說，其落入儲冰倉之前就會經(jīng)濾水板流入接水盤，再經(jīng)過管道輸送重新到達(dá)分水盤進(jìn)行制冰，基于片冰機(jī)的上述功能，本申請可將結(jié)冰面上冰狀和液狀的菌體發(fā)酵液沿不同的路徑送出，前者直接進(jìn)入冰倉冷凍待融解，后者回送至分水盤處重新冷凍，如此可以有效保證菌體細(xì)胞的破碎率，進(jìn)而提高菌體發(fā)酵液的酶催化性能。
[0012]進(jìn)一步的，所述步驟b中冰層狀的菌體發(fā)酵液的厚度不超過10mm。冰倉內(nèi)冰層狀的菌體發(fā)酵液先用0-10°C冷凍水進(jìn)行換熱，再用25-35?循環(huán)水換熱，這樣利用小溫差換熱可防止冰片粘連在一起，難以溶解；溶解后期，通水使片冰溫度升到-5°C至0°C，加速溶解。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下通過1-3實(shí)施例對本發(fā)明公開的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明:
[0014]實(shí)施例1:菌體細(xì)胞的破碎
[0015]a)發(fā)酵液預(yù)處理:收集5m3的L-天冬氨酸-α -脫羧酶發(fā)酵液，采用分離因數(shù)為9000的蝶式離心機(jī)進(jìn)行離心分離，獲得250kg濃縮的菌體發(fā)酵液，離心分離得到的清液通過噴霧干燥制成飼料蛋白，所述的L-天冬氨酸- α -脫羧酶發(fā)酵液申請人采用假單孢菌培養(yǎng)得到，該發(fā)酵液是申請人用來催化L-天冬氨酸以合成L-丙氨酸產(chǎn)品，具體的，所述的假單孢菌屬于革蘭氏陰性菌；
[0016]b)冷凍:將濃縮的菌體發(fā)酵液泵入片冰機(jī)的分水盤，分水盤上的菌體發(fā)酵液通過灑水管灑落在片冰機(jī)內(nèi)的結(jié)冰面上結(jié)成厚度為3_的冰層，其中片冰機(jī)內(nèi)制冰劑的制冰溫度為_35°C，制冰系統(tǒng)溫度為_30°C，具體的，所述的制冰劑為R22型；
[0017]c)融解破碎:冰層狀的菌體發(fā)酵液通過冰刀從結(jié)冰面上刮離并落入冰倉，先在-20°C條件下冷凍3h，再在20°C的水循環(huán)條件下融解，即得破碎的菌體細(xì)胞液。經(jīng)檢測，該菌體細(xì)胞液的破碎率達(dá)95%，酶活保留率達(dá)97%。
[0018]實(shí)施例2:菌體細(xì)胞的破碎
[0019]a)發(fā)酵液預(yù)處理:收集5m3的L-天冬氨酸-β -脫羧酶發(fā)酵液，采用孔徑10nm的陶瓷膜進(jìn)行菌體分離，獲得500kg濃縮的菌體發(fā)酵液，過濾分離得到的清液通過噴霧干燥制成飼料蛋白；
[0020]b)冷凍:將濃縮的菌體發(fā)酵液泵入片冰機(jī)的分水盤，分水盤上的菌體發(fā)酵液通過灑水管灑落在片冰機(jī)內(nèi)的結(jié)冰面上結(jié)成厚度為5_的冰層，其中片冰機(jī)內(nèi)制冰劑的制冰溫度為-20°C，制冰系統(tǒng)溫度為-40°C，具體的，所述的制冰劑為R22型；
[0021]c)融解破碎:冰層狀的菌體發(fā)酵液通過冰刀從結(jié)冰面上刮離并落入冰倉，先在_30°C條件下冷凍2h，再在30°C的水循環(huán)條件下融解，即得破碎的菌體細(xì)胞液。經(jīng)檢測，該菌體細(xì)胞液的破碎率達(dá)96%，酶活保留率達(dá)98%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種菌體細(xì)胞的破碎方法，其步驟如下: a)冷凍:收集菌體發(fā)酵液，泵入片冰機(jī)的分水盤，分水盤上的菌體發(fā)酵液灑落在片冰機(jī)內(nèi)的結(jié)冰面上結(jié)成冰層； b)融解破碎:菌液冰片通過冰刀從結(jié)冰面上刮離并落入冰倉先在-5?-90°C條件下冷凍Ι-lOh，再在10-60°C條件下融解，即得破碎的菌體細(xì)胞液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌體細(xì)胞的破碎方法，其特征在于:所述步驟a還包括以下步驟:先將收集的菌體發(fā)酵液在不超過50°C條件下濃縮10-100倍，然后將得到的濃縮菌液泵入片冰機(jī)結(jié)成冰片，分離或過濾濃縮菌體發(fā)酵液的裝置為膜、離心機(jī)中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述菌體細(xì)胞的破碎方法，其特征在于:膜過濾條件:溫度控制在500C以下，膜孔徑為50nm-0.8 μ m，壓力為0.1-0.5Mpa。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述分離或過濾濃縮菌體發(fā)酵液的裝置，其特征在于:離心機(jī)離心條件:分離因數(shù)在6000-12000之間，溫度控制在40°C以下。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述菌體細(xì)胞的破碎方法，其特征在于:步驟a的片冰機(jī)中的制冰劑溫度為_5--50 °C，制冰系統(tǒng)溫度為-5--50 °C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌體細(xì)胞的破碎方法，其特征在于:步驟a中發(fā)酵液泵入分水盤的方式采用軟管泵。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述菌體細(xì)胞的破碎方法，其特征在于:所述步驟b中片冰機(jī)的結(jié)冰面上包含冰狀和液狀的菌體發(fā)酵液，其中冰狀的菌體發(fā)酵液從片冰機(jī)的落冰口落入冰倉，液狀的菌體發(fā)酵液落至片冰機(jī)的接水盤并回流至分水盤上重新進(jìn)行凍融破碎處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述菌體細(xì)胞的破碎方法，其特征在于:所述步驟b中冰層狀的菌體發(fā)酵液的厚度不超過10mm。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種菌體細(xì)胞的破碎方法，其步驟如下：a)冷凍：收集菌體發(fā)酵液，泵入片冰機(jī)的分水盤，分水盤上的菌體發(fā)酵液灑落在片冰機(jī)內(nèi)的結(jié)冰面上結(jié)成冰層；b)融解破碎：菌液冰片通過冰刀從結(jié)冰面上刮離并落入冰倉先在-5～-90℃條件下冷凍1-10h，再在10-60℃條件下融解，即得破碎的菌體細(xì)胞液。本發(fā)明通過片冰機(jī)將菌體發(fā)酵液進(jìn)行冷凍，使得菌體發(fā)酵液與片冰機(jī)內(nèi)的結(jié)冰面進(jìn)行大面積接觸，實(shí)現(xiàn)了菌體發(fā)酵液快速制成冰片且極易融解，首次將片冰機(jī)應(yīng)用于生物發(fā)酵行業(yè)，有效提高了菌體細(xì)胞的破碎效率，破碎率達(dá)95％，酶活保留率達(dá)97％。
【IPC分類】C12N1-06
【公開號】CN104531531
【申請?zhí)枴緾N201410766776
【發(fā)明人】郭恒華, 張冬竹, 吳照和, 劉潔, 唐思青, 劉洋
【申請人】安徽華恒生物科技股份有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月11日