一種提高aa-2g轉(zhuǎn)化率的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高AA-2G轉(zhuǎn)化率的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，屬于基因工 程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素C(VC)是一種人體自身不能合成的水溶性維生素，參與體內(nèi)很多的生理活 動(dòng)，如促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的合成，參與芳香氨基酸的代謝，促 進(jìn)鐵的吸收及參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)，在維持和促進(jìn)人體健康中扮演著重要的角色。 另外，維生素C還能促進(jìn)膠原蛋白的合成，還原已形成的黑素，對(duì)保持皮膚彈性、美白、除皺 有一定的作用。廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。但是VC二位碳的羥基極不穩(wěn)定，非 常容易氧化降解而限制了其應(yīng)用。2-O-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸（AA-2G)是一種維生 素C的糖類(lèi)衍生物，是最穩(wěn)定、性能最佳的VC替代品，近些年主要作為一種美白添加劑應(yīng)用 于多種品牌的尚端化妝品中。
[0003] 目前，全世界應(yīng)用于化妝品中的AA-2G均由日本林原公司一家提供，其在市場(chǎng)上 占有壟斷的地位。AA-2G的價(jià)格約為3000元/kg，大概是維生素C的100多倍，可見(jiàn)其市場(chǎng) 價(jià)值。我國(guó)是維生素C生產(chǎn)大國(guó)，國(guó)內(nèi)VC生產(chǎn)企業(yè)擁有超過(guò)全球80%產(chǎn)能，然而我國(guó)VC 產(chǎn)品四分之三用于出口，內(nèi)銷(xiāo)部分主要用于醫(yī)藥，品種較單調(diào)。我國(guó)對(duì)AA-2G的研宄也有報(bào) 道，但僅屬于初步的探索階段，尚未達(dá)到工業(yè)化水平。因此挖掘優(yōu)化適合生產(chǎn)AA-2G的糖基 轉(zhuǎn)移酶對(duì)于推動(dòng)我國(guó)AA-2G的工業(yè)化具有十分重要的意義。
[0004] 本發(fā)明所使用的來(lái)源于BacillusstearothermophilusN02環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移 酶CGTase雖然在轉(zhuǎn)化過(guò)程中能夠?qū)崿F(xiàn)AA-2G的生產(chǎn)，但其后提取工藝仍不可缺少。如何提 高底物轉(zhuǎn)化率，節(jié)約成本，簡(jiǎn)化后提取工藝將成為環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的研宄方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體，包 括含有一個(gè)或兩個(gè)相對(duì)于BacillusstearothermophilusN02環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性 氨基酸殘基的取代，與親本相比有更高的AA-2G轉(zhuǎn)化效率。
[0006] 所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的親本基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Bacillus stearothermophilusN02環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶一致（登錄號(hào)X59042. 1)。
[0007] 所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的親本基因編碼的成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述。
[0008] 所述突變體相對(duì)于氨基酸序列為SEQIDNO. 1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)生 了一個(gè)或兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變。
[0009] 所述突變與CGTase產(chǎn)AA-2G的轉(zhuǎn)化率相關(guān)。
[0010] 所述發(fā)生突變的氨基酸位點(diǎn)是第228位的賴氨酸或第367位的天冬氨酸。
[0011] 所述突變體是將SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列中第228位的賴氨酸（Lys)突變 為精氨酸（Arg)，命名為K228R，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0012] 所述突變體是將SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列中第367位的天冬氨酸（Asp)突 變成絲氨酸（Ser)，命名為D367S所示。
[0013] 所述突變體是將SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列的第228位的賴氨酸（Lys)突變 為精氨酸（Arg)，同時(shí)將第367位的天冬氨酸（Asp)突變成絲氨酸（Ser)，得到的突變體命 名為K228R/D367S。
[0014] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體 的制備方法，包括如下步驟：
[0015] (1)在BacillusstearothermophilusN02環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的 基礎(chǔ)上確定突變位點(diǎn)；設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，以攜帶環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的載 體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變；構(gòu)建含突變體的質(zhì)粒載體；
[0016] (2)將突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞；
[0017] (3)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并純化環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體K228R、 D367S、D367S/K228R。
[0018] 所述質(zhì)粒載體為pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一種。
[0019] 所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌和真菌細(xì)胞，其也為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 所述的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌。
[0021] 本發(fā)明應(yīng)用與AA-2G的生產(chǎn)，最適溫度為35°C，最適pH為5.0。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 AA-2G產(chǎn)量的提高，在最優(yōu)的酶轉(zhuǎn)化條件下，突變體酶K228R、D367S、D367S/K228R生產(chǎn) 八八-26的產(chǎn)率分別達(dá)到42%、40%、45%，是野生酶生產(chǎn)4八-26轉(zhuǎn)化率的1.17、1.11、1.25 倍。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 :重組菌構(gòu)建
[0023]根據(jù)NCBI上登錄的cgt基因序列（NCBI序列號(hào)X59042. 1)，采用化學(xué)合成法合成 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列cgt。用于構(gòu)建大腸桿菌的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有17啟 動(dòng)子。將pET20b(+)質(zhì)粒和含有cgt基因的質(zhì)粒分別進(jìn)行NcoI和HindIII雙酶切，酶切 產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37°C培 養(yǎng)培養(yǎng)8h，挑轉(zhuǎn)化子在含有100mg/L氨芐青霉素液體的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶 切驗(yàn)證得到表達(dá)質(zhì)粒cgt/pET20b(+)。
[0024] 將質(zhì)粒cgt/pET20b⑴轉(zhuǎn)化E.coliBL21 (DE3)宿主菌，涂布含氨芐青霉素 (10011^/1)的1^平板，371：培養(yǎng)811，命名為〇 8^^￡了2013(+)/^.(3〇118121(0￡3)。挑單菌落 到含有100mg/L氨芐青霉素液體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，保存甘油管。
[0025] 實(shí)施例2:突變體的制備
[0026] (1)單突變
[0027] 來(lái)源于B.stearothermophilus N02的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的兩種突變體酶 K228R.D367S：
[0028] 根據(jù)B. stearothermophilus N02環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因序列（NCBI序列 號(hào)X59042. 1)，分別設(shè)計(jì)并合成引入K228R、D367S突變的引物，對(duì)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基 因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)定DNA編碼序列，分別鑒別出第228位的Lys密碼子變成Arg密碼子， 第367位的Asp密碼子變成Ser密碼子。將突變體基因置于適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體并導(dǎo)入枯草芽 孢桿菌、大腸桿菌或短小芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到單突變環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。單突變 K228R、D367S的定點(diǎn)突變：利用快速PCR技術(shù)，以表達(dá)載體cgt/pET20b(+)為模板，
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，相對(duì)于氨基酸序列為SEQ ID NO. 1 所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)生了一個(gè)或兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變；所述突變與環(huán)糊精葡 萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)2-0-a -D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸的轉(zhuǎn)化率相關(guān)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述發(fā)生突變的氨基酸位點(diǎn)是第228位 的賴氨酸或第367位的天冬氨酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變是將第228位的賴氨酸突變?yōu)?精氨酸，突變體的氨基酸序列是SEQ ID N0. 2所示的序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變是將第367位的天冬氨酸突變 成絲氨酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變是將第228位的賴氨酸突變?yōu)?精氨酸，同時(shí)將第367位的天冬氨酸突變成絲氨酸，得到的突變體命名為K228R/D367S。
6. 表達(dá)權(quán)利要求1-5任一所述突變體的基因工程菌。
7. -種權(quán)利要求1所述突變體的制備方法，包括如下步驟： (1) 在Bacillus stearothermophilus N02環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的基礎(chǔ) 上確定突變位點(diǎn)； (2) 設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，以攜帶環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的載體為模板進(jìn)行 定點(diǎn)突變并構(gòu)建含突變體的質(zhì)粒載體； (3) 將突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞；挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并純化環(huán)糊精葡萄 糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述質(zhì)粒載體為pUC系列，pET系列， 或pGEX中的任意一種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌或真菌細(xì)胞；所 述的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌。
10. 權(quán)利要求1-5任一所述的突變體在AA-2G生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高AA-2G轉(zhuǎn)化率的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明是將嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus NO2)的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性中心附近第228位的賴氨酸突變?yōu)榫彼岬玫酵蛔凅wK228R，第367位的天冬氨酸突變成絲氨酸得到突變體D367S，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行雙突變得到突變體D367S/K228R。突變體實(shí)現(xiàn)了AA-2G轉(zhuǎn)化效率的提高，具有較高的工業(yè)價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12N15-63, C12R1-07, C12N9-10, C12P19-60
【公開(kāi)號(hào)】CN104531629
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410779194
【發(fā)明人】吳敬, 宿玲恰, 陳晟, 熊艷軍
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月16日