一種麥芽糖淀粉酶的突變體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種麥芽糖淀粉酶的突變體及其制備方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 麥芽糖是由兩個(gè)葡萄糖單位經(jīng)a-1，4糖苷鍵連接組成的還原性二糖，化學(xué)名稱 是4-0-D-六環(huán)葡萄糖基-D-六環(huán)葡萄糖。其甜度柔和，又因低粘度、低吸濕性及良好的熱 穩(wěn)定性特點(diǎn)，可作為食品增甜劑取代葡萄糖和蔗糖，在食品工業(yè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。 工業(yè)上麥芽糖的制備，是以淀粉質(zhì)為原料，經(jīng)過(guò)淀粉酶，麥芽（或淀粉酶，真菌淀粉 酶）水解工藝，制得一種以麥芽糖為主（40%-60%)的糖漿，若麥芽糖含量超過(guò)45% (最 好在50%以上），則被稱為高麥芽糖漿。在食品工業(yè)中高麥芽糖漿的用途之一是制作糕點(diǎn)、 糖果等產(chǎn)品。糖漿熬煮溫度遠(yuǎn)高于飴糖，一般超過(guò)140°C。麥芽糖含量大于70%，甚至高達(dá) 90%以上，則被稱為超高麥芽糖漿。麥芽糖相比葡萄糖可避免血糖升高，對(duì)于應(yīng)用于抗體、 疫苗等的制備具有優(yōu)于葡萄糖的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。因此超高純度的麥芽糖漿在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用也 引起了越來(lái)越多的關(guān)注。
[0003] 當(dāng)前麥芽糖生產(chǎn)工藝已較為成熟，使用a-淀粉酶和淀粉酶生產(chǎn)麥芽糖時(shí)，產(chǎn) 物中麥芽糖含量可高達(dá)90%，葡萄糖、三糖、四糖以及部分低聚糖和糊精是主要的轉(zhuǎn)化副產(chǎn) 物。其中糊精和部分低聚糖，可通過(guò)乙醇沉淀去除。超高純度麥芽糖的制備，則要通過(guò)色譜 分離和結(jié)晶等方法獲得。由于麥芽糖黏度大、難結(jié)晶，通常要求結(jié)晶原料中麥芽糖純度在 90%以上，因此色譜分離的純度，對(duì)麥芽糖結(jié)晶起著至關(guān)重要的作用。色譜分離基本可去除 葡萄糖和五糖及以上的小分子糖類(lèi)，對(duì)麥芽糖純度影響較小。但產(chǎn)物中的三糖和四糖由于 與麥芽糖性質(zhì)較為相近，往往成為分離純化中的主要雜質(zhì)，不僅直接降低了產(chǎn)品純度，還給 麥芽糖結(jié)晶性、糖漿粘度以及最終產(chǎn)品的水分含量帶來(lái)很大不利影響，使麥芽糖最終收率 大大降低。
[0004] 麥芽糖淀粉酶具有小分子糖水解活性，可水解三糖、四糖等小分子糖，形成葡萄糖 和麥芽糖，因此在超高麥芽糖生產(chǎn)中通常與a-淀粉酶、淀粉酶和普魯蘭酶等復(fù)配使 用以降低副產(chǎn)物比例，使麥芽糖更利于結(jié)晶。據(jù)報(bào)道，來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)的麥芽糖淀粉酶具有較高的最適反應(yīng)溫度和較低的最適pH反應(yīng)條 件，可滿足較為苛刻的工業(yè)生產(chǎn)條件，將產(chǎn)物中麥芽糖比例提高至92%，在工業(yè)上有極大的 應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。但發(fā)明人在前期應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，由于該酶同時(shí)具有的水解活性和轉(zhuǎn)苷活性，在水解 小分子糖的過(guò)程中，又會(huì)轉(zhuǎn)苷產(chǎn)生新的三糖和四糖等。生產(chǎn)中為了減少副產(chǎn)物的生成，往往 需要延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間使水解反應(yīng)達(dá)到平衡，一方面導(dǎo)致生產(chǎn)周期長(zhǎng)、效率低，另一方面反應(yīng)時(shí) 間的延長(zhǎng)，又容易導(dǎo)致生成的麥芽糖被重新利用形成轉(zhuǎn)苷副產(chǎn)物。
[0005] 因此，本發(fā)明利用蛋白質(zhì)工程和酶工程手段，降低該酶轉(zhuǎn)苷活性，減少轉(zhuǎn)化體系中 的副產(chǎn)物比例，使具有更高的麥芽糖生產(chǎn)效率，賦予其在工業(yè)上更好的應(yīng)用性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種麥芽糖淀粉酶的突變體，該突變體是B.stearothermophilus 的麥芽糖淀粉酶轉(zhuǎn)苷活性中心相關(guān)的氨基酸殘基的取代，與其親代的麥芽糖淀粉酶相比， 其對(duì)麥芽糖具有更快的轉(zhuǎn)化效率以及更少的轉(zhuǎn)化副產(chǎn)物。
[0007] 所述B. stearothermophilus麥芽糖淀粉酶的親本氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的 B. stearothermophilus麥芽糖淀粉酶氨基酸序列一致（登錄號(hào)：AAA22233. 1)。
[0008] 所述的突變體是將親本麥芽糖淀粉酶基因中第177位的色氨酸（Trp)分別突變成 了苯丙氨酸（Phe)和酪氨酸（Tyr)，分別命名為W177F和W177Y。
[0009] 本發(fā)明突變體酶W177F和W177Y分別用于麥芽糖生產(chǎn)時(shí)，在相同酶轉(zhuǎn)化條件下，添 加突變體酶W177F在12h達(dá)到反應(yīng)平衡，麥芽糖含量由90. 49%提高為95. 79 %，反應(yīng)體系 中已不含三糖和四糖；添加突變體酶W177Y在8h達(dá)到反應(yīng)平衡，麥芽糖含量由90. 49%提 高為96. 10%，反應(yīng)體系中已不含三糖和四糖。而添加野生酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)麥芽糖，8h時(shí)麥芽糖 含量為93. 20 %，三糖和四糖含量分別為4. 10 %和0. 50% ;12h時(shí)麥芽糖含量為94. 61%， 三糖和四糖含量分別為2. 57 %和0. 22%;反應(yīng)至30h時(shí)仍未達(dá)到平衡，此時(shí)麥芽糖含量為 95. 45%，三糖和四糖含量分別為0. 67%和0. 35%。由此可見(jiàn)，添加突變體酶生產(chǎn)麥芽糖， 可將反應(yīng)體系中的三糖和四糖完全降解。添加野生酶的反應(yīng)體系中，三糖含量隨反應(yīng)進(jìn)行 逐漸降低為〇. 67%;四糖在12h時(shí)達(dá)最低值0. 22%，但隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，又呈現(xiàn)出重新生 成的趨勢(shì)。因此突變體酶W177F和W177Y在麥芽糖生產(chǎn)應(yīng)用中，不僅可以大大縮短反應(yīng)平 衡時(shí)間，提高麥芽糖生產(chǎn)效率，同時(shí)完全降解了副產(chǎn)物中的主要雜質(zhì)三糖和四糖，簡(jiǎn)化了色 譜分離純化過(guò)程，在高純度結(jié)晶麥芽糖的生產(chǎn)中具有潛在應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1野生型麥芽糖淀粉酶和突變體（W177F和W177Y)生產(chǎn)麥芽糖過(guò)程中麥芽糖含 量變化
[0011] 圖2野生型麥芽糖淀粉酶和突變體（W177F和W177Y)生產(chǎn)麥芽糖過(guò)程中麥芽三糖 含量變化
[0012] 圖3野生型麥芽糖淀粉酶和突變體（W177F和W177Y)生產(chǎn)麥芽糖過(guò)程中麥芽四糖 含量變化
[0013] 圖4野生型麥芽糖淀粉酶和突變體（W177F和W177Y)的最適溫度
[0014] 圖5野生型麥芽糖淀粉酶和突變體（W177F和W177Y)的60°C溫度穩(wěn)定性
[0015] 圖6野生型麥芽糖淀粉酶和突變體（W177F和W177Y)的最適pH
[0016] 圖7野生型麥芽糖淀粉酶和突變體（W177F和W177Y)的pH穩(wěn)定性
[0017] 圖8金屬離子對(duì)野生型麥芽糖淀粉酶和突變體（W177F和W177Y)比活力的影響
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1 :本例說(shuō)明野生麥芽糖淀粉酶的制備。
[0019] (1)麥芽糖淀粉酶重組菌的構(gòu)建
[0020] 根據(jù)NCBI上的amyM氨基酸序列（NCBI編號(hào)：AAA22233. 1)，將NCBI上的amyM基 因序列（NCBI編號(hào)：M36539)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，采用化學(xué)全合成方法合成麥芽糖淀粉酶的基 因序列amyM。用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET24a(+)。將pET24a(+)質(zhì)粒和帶有amyM基因的質(zhì)粒分別進(jìn)行NcoI和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用T4連接酶連 接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg/L卡那霉素 的LB平板，經(jīng)37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，平板上挑取2個(gè)單菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8h后抽提質(zhì)粒驗(yàn) 證，結(jié)果正確，得到富集的amyM/pET24a質(zhì)粒。將質(zhì)粒amyM/pET24a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子在LB液體培養(yǎng)基（含100mg/L卡那霉素）中37°C培養(yǎng)過(guò)夜，保存 甘油管，命名為amyM/pET24a/BL21 (DE3)。
[0021] (2)麥芽糖淀粉酶的表達(dá)與純化
[0022] 從甘油管接種amyM/pET24a/BL21 (DE3)于LB液體培養(yǎng)基（含100mg/L卡那霉素） 生長(zhǎng)8h，按5%接種量將種子接入TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基（含100mg/L卡那霉素）。大腸桿菌 在37°C培養(yǎng)2h后，加入0.OlmM終濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵48h 后，將發(fā)酵液于4°C、8000rpm離心10min除菌體，收集發(fā)酵上清。
[0023] 在上清液中緩慢加入50%(NH4)2S04,4°C放置過(guò)夜，4°C、8000rpm離心20min，收集 沉淀。用pH7.5的20mM梓檬酸緩沖液復(fù)溶沉淀后，在20mM梓檬酸緩沖液中透析過(guò)夜。期 間更換2-3次緩沖液。通過(guò)0.22y m膜過(guò)濾后制成上樣樣品，采用avant蛋白純化儀進(jìn)行重 組蛋白的純化。陰離子交換色譜純化步驟：（1)平衡：用5倍體積的20mM緩沖液平衡DEAE 陰離子交換色譜柱；（2)上樣：預(yù)先處理好的樣品以lmL/min的流速上樣；（3)洗脫：流速 lmL/min進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分步收集含麥芽糖淀粉酶活力的洗脫液。得到 純化的野生麥芽糖淀粉酶。
[0024] 實(shí)施例2 :本例說(shuō)明麥芽糖淀粉酶突變體制備。
[0025] (1)定點(diǎn)突變
[0026] 在B.stearothermophilus來(lái)源的麥芽糖淀粉酶與環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulansstrain251)來(lái)源的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase)序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上， 對(duì)麥芽糖淀粉酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，發(fā)現(xiàn)了麥芽糖淀粉酶中與轉(zhuǎn)苷活性可能相 關(guān)的氨基酸位點(diǎn)Trpl77,Phel88,Ala229,Tyr258。將麥芽糖淀粉酶中第177位的色氨酸 (Trp)分別突變成組氨酸（His)和天冬酰氨（Asn)，分別標(biāo)記為W177H，W177N;將麥芽糖淀 粉酶中第188位的苯丙氨酸（Phe)突變成酪氨酸（Tyr)，標(biāo)記為F188Y;將麥芽糖淀粉酶中 第229位的丙氨酸（Ala)分別突變成纈氨酸（Val)、蘇氨酸（Thr)和亮氨酸（Leu)，分別標(biāo) 記為A229V、A229T和A229L;將麥芽糖淀粉酶中第258位酪氨酸（Tyr)分別突變成天冬酰 氨（Asn)和谷氨酰氨（Gin)，分別標(biāo)記為Y258N和Y258Q。
[0027] 引入W177H突變的定點(diǎn)突變引物為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種麥芽糖淀粉酶的突變體，其特征在于，所述麥芽糖淀粉酶的親本氨基酸序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為AAA22233. 1的嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶一致，所述突變是 將第177位色氨酸突變?yōu)楸奖彼?，命名為W177F。
2. -種麥芽糖淀粉酶的突變體，其特征在于，所述麥芽糖淀粉酶的親本氨基酸序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為AAA22233. 1的嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶一致，所述突變是 將第177位色氨酸突變?yōu)槔野彼?，命名為W177Y。
3. 權(quán)利要求1、權(quán)利要求2所述的突變體的制備方法，包括如下步驟： 1) 在嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶氨基酸序列的基礎(chǔ)上確定突變位點(diǎn)；設(shè)計(jì)定點(diǎn) 突變的突變引物，以攜帶麥芽糖淀粉酶基因的載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變并構(gòu)建含突變體的 質(zhì)粒載體； 2) 將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞； 3) 挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并純化麥芽糖淀粉酶突變體； 所述質(zhì)粒載體為PUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一種；所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌和真 菌細(xì)胞；所述細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)菌或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
【專利摘要】一種麥芽糖淀粉酶的突變體及其制備方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。是將嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)來(lái)源的麥芽糖淀粉酶轉(zhuǎn)苷活性中心的氨基酸殘基的取代，與其親代的麥芽糖淀粉酶相比，其對(duì)麥芽糖具有更高的轉(zhuǎn)化效率以及更少的轉(zhuǎn)化副產(chǎn)物。所述B.stearothermophilus麥芽糖淀粉酶突變體，至少以下性質(zhì)之一發(fā)生改變：1)生產(chǎn)周期縮短；2)產(chǎn)物比例提高。這些突變體比野生型麥芽糖淀粉酶更適合用于麥芽糖生產(chǎn)過(guò)程。
【IPC分類(lèi)】C12N15-56, C12N9-28, C12R1-07, C12N15-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104531636
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510025813
【發(fā)明人】吳敬, 段緒果, 孫燁橙, 王蕾
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月19日