一種功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑的制備方法，屬于酶生物催化有機(jī)合成領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前，脂肪酸酯類食用香精如己酸乙酯等大多以化學(xué)法合成為主，即通過強(qiáng)酸性物質(zhì)如硫酸催化酯化制備得到，一方面，該合成技術(shù)使用有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸催化劑等有毒物質(zhì)，在產(chǎn)品中有有害殘留成分存在；其次，該技術(shù)還存在著副反應(yīng)多、醇消耗量大、產(chǎn)品色澤深、能耗高、設(shè)備腐蝕嚴(yán)重、環(huán)境污染等缺點(diǎn)，在當(dāng)今食品安全及環(huán)境保護(hù)日趨嚴(yán)格的形勢下，亟待尋求綠色合成技術(shù)。作為一種新興的生物酶法催化酯化制備技術(shù)，因其具有反應(yīng)條件溫和、催化高效專一、醇用量小、產(chǎn)物易分離、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛重視，被認(rèn)為是取代化學(xué)法生產(chǎn)脂肪酸酯的綠色工藝，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。而與此同時，生物酶也存在價格高、易失活、游離酶在反應(yīng)過程中容易結(jié)塊、不易回收、重復(fù)使用率低等缺點(diǎn)。為此，當(dāng)前研宄多采用各種不同的技術(shù)手段將生物酶固定在某種載體上，以維持更高的酶活性，提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用率。目前，常用的固定化方法主要有包埋法、吸附法、共價結(jié)合法和化學(xué)交聯(lián)法。其中包埋法、吸附法存在著酶易脫落、酶活性低、重復(fù)使用率低等問題，而化學(xué)交聯(lián)法則通常反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)比較劇烈，酶分子的活性位點(diǎn)容易遭到破壞，固定化酶活性降低。所謂共價結(jié)合法，是指利用載體表面的活性基團(tuán)與酶分子的功能活性基團(tuán)形成共價鍵牢固連接，以使酶固定化的一種方法。該技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前國內(nèi)外的研宄熱點(diǎn)，其具有挑戰(zhàn)性的技術(shù)途徑是需要尋找盡可能溫和的共價鍵合反應(yīng)物，在反應(yīng)時避免酶的失活，另外需要尋找適宜的負(fù)載材料，盡可能提高負(fù)載率和催化活性。凹凸棒土在我國蘊(yùn)藏量十分豐富，價廉易得，它為一種晶質(zhì)水合鎂鋁硅酸鹽礦物，具有獨(dú)特的層鏈狀結(jié)構(gòu)特征，晶體呈針狀、纖維狀或纖維集合狀，具有很好的吸附、脫色能力和耐高溫、抗鹽堿等性能，并具有獨(dú)特的分散性、不易沉淀結(jié)塊的膠體性狀。凹凸棒土內(nèi)部有多種孔道，其外比表面積和內(nèi)比表面積都非常大，具有優(yōu)異的吸附性和催化性能，可用作催化劑的載體、烯烴聚合的催化劑等，其催化性能表現(xiàn)為，當(dāng)某種反應(yīng)物質(zhì)寄附于凹凸棒土晶體內(nèi)部的大孔穴表面上時，可以產(chǎn)生協(xié)同催化效應(yīng)，其反應(yīng)速度得到加快，且反應(yīng)生成物又可以從坡縷石粘土內(nèi)部擴(kuò)散釋放出來，而凹凸棒土晶體格架不被破壞。本發(fā)明選擇凹凸棒土作為酶固定載體，通過協(xié)同催化作用，提升酶催化效能，對拓展酶催化酯化技術(shù)應(yīng)用及開發(fā)凹凸棒土功能材料市場有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明運(yùn)用共價結(jié)合法固定脂肪酶技術(shù)，通過選取高比表面積多孔天然材料凹凸棒土作為載體，對凹凸棒土表面進(jìn)行活性修飾，即在載體表面引入能夠與酶發(fā)生特異性共價反應(yīng)的功能化活性基團(tuán)，并在溫和條件下實(shí)現(xiàn)與酶的鍵合固定，并通過協(xié)同催化效應(yīng)，提高酶的活性和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，并提高其穩(wěn)定性。此制備技術(shù)可以應(yīng)用于脂肪酸酯類酶催化合成生產(chǎn)，其轉(zhuǎn)化率高，后處理簡單，可重復(fù)利用，環(huán)保無污染，生產(chǎn)成本降低，應(yīng)有較好的應(yīng)用前景。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑的制備方法，具體步驟為:
[0005]I)功能化活性凹凸棒土的制備
[0006]a.酸活化凹凸棒土的制備
[0007]步驟:將I份質(zhì)量的凹凸棒土加至15-20份2-6mol/L鹽酸或硫酸溶液中，于30-60°C攪拌20min-lh，超聲分散15min-30min，靜置；離心沉淀分離后用去離子水洗，至洗液pH值為中性；將酸改性后的凹凸棒土在200-300°C下，加熱45min-lh，冷卻，即制得酸活化凹凸棒土，密閉干燥保存，備用。
[0008]b.功能化活性凹凸棒土的制備
[0009]步驟:將上述所得酸活化凹凸棒土加至pH為2的鹽酸溶液中，于30_50°C攪拌20min-30min，超聲分散20min_30min ;再將上述分散液加到過量的2-(3，4- 二羥基苯基)乙胺水溶液中，劇烈攪拌0.5-lh，使2-(3，4- 二羥基苯基)乙胺與酸活化凹凸棒土表面充分螯合；將試液離心分離，所得固體用去離子水反復(fù)洗滌，直至洗滌液PH呈中性；再在80-90°C下真空干燥24h，得到表面活性基團(tuán)修飾的功能化活性凹凸棒土(記為Al)。
[0010]2)功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑的制備
[0011]步驟:將上述300mg Al 加入到 10mL Tris-HCl 緩沖液(50mmol/L，pH 7.0)中，超聲分散15min-20min后，向上述溶液中加入15mL 50%的戊二醛溶液，室溫下攪拌，活化2-3h后，離心分離，所得固體產(chǎn)物用去離子水洗滌；再將上述產(chǎn)物加到含300mg脂肪酶的200mL Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L,pH 7.0)中，在4°C下反應(yīng)12_24h后，離心分離，洗滌，得到固定化酶催化劑顆粒，冷凍干燥后儲存于-20°C下備用，記為BI。
[0012]本發(fā)明的有益效果:通過應(yīng)用本發(fā)明制備所得的功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑可用于脂肪酸酯的催化合成，具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、醇用量小、產(chǎn)物易分離、綠色環(huán)保等特點(diǎn)；該方法適于多種酶的固定化，所制得的固定化脂肪酶催化劑不易失活，不易脫落，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，重復(fù)使用率高，降低了生產(chǎn)成本，特別適于食用香精類脂肪酸酯的合成，有較好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1:
[0014]I)功能化活性凹凸棒土的制備
[0015]a.酸活化凹凸棒土的制備
[0016]步驟:將1g質(zhì)量的凹凸棒土加至200g 5mol/L鹽酸溶液中，于40°C攪拌45min，超聲分散30min，靜置；離心沉淀分離后用去離子水洗，至洗液pH值為中性；將酸改性后的凹凸棒土在250°C下，加熱Ih ;冷卻，即制得酸活化凹凸棒土，密閉干燥保存，備用。
[0017]b.功能化活性凹凸棒土的制備
[0018]步驟:將2g上述所得酸活化凹凸棒土加至pH為2的50mL鹽酸溶液中，于50°C攪拌30min，超聲分散30min ;再將上述分散液加到50mL 5% 2-(3, 4- 二羥基苯基)乙胺水溶液中，劇烈攪拌lh，使2-(3，4- 二羥基苯基)乙胺與酸活化凹凸棒土表面充分螯合；將試液離心分離，所得固體用去離子水反復(fù)洗滌，直至洗滌液pH呈中性；再在90°C下真空干燥24h，得到表面活性基團(tuán)修飾的功能化活性凹凸棒土(記為A2)。
[0019]2)功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑的制備
[0020]步驟:將上述300mg A2 加入到 10mL Tris-HCl 緩沖液(50mmol/L，pH 7.0)中，超聲分散20min后，向上述溶液中加入15mL 50%的戊二醛溶液，室溫下攪拌，活化3h后，離心分離，所得固體產(chǎn)物用去離子水洗滌；再將上述產(chǎn)物加到含300mg Pseudomonas cl.脂肪酶(實(shí)驗室制)的200mL Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.0)中，在4°C下反應(yīng)18h后，離心分離，洗滌，得到固定化酶催化劑顆粒，冷凍干燥后儲存于-20°C下備用，記為B2。
[0021]應(yīng)用案例:功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑用于催化合成己酸乙酯，合成工藝如下:
[0022]在具塞錐形瓶中加入20mL正己燒，加入己酸、無水乙醇溶解，配成0.3mol/L己酸/無水乙醇反應(yīng)復(fù)合物，其中己酸:無水乙醇摩爾比為1:1.3 ;加入適量(按酶活計)功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑(B2)，加入適量水，混合均勻；置于35°C恒溫水浴震蕩器中反應(yīng)，一定時間后加入2g分子篩；反應(yīng)20h后濾去催化劑和分子篩，用0.lmol/LNa2C03溶液洗滌反應(yīng)液，再用去離子水洗滌，減壓蒸餾，脫去溶劑，得己酸乙酯，轉(zhuǎn)化率94%。固定化脂肪酶可重復(fù)回用，保持高催化活性。
【主權(quán)項】
1.一種功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)功能化活性凹凸棒土的制備 a.酸活化凹凸棒土的制備 步驟:將I份質(zhì)量的凹凸棒土加至15-20份2-6mol/L鹽酸或硫酸溶液中，于30-60°C攪拌20min-lh，超聲分散15min-30min，靜置；離心沉淀分離后用去離子水洗，至洗液pH值為中性；將酸改性后的凹凸棒土在200-300°C下，加熱45min-lh，冷卻，即制得酸活化凹凸棒土，密閉干燥保存，備用。 b.功能化活性凹凸棒土的制備 步驟:將上述所得酸活化凹凸棒土加至PH為2的鹽酸溶液中，于30-50°C攪拌20min-30min，超聲分散20min-30min ;再將上述分散液加到過量的具特殊功能基團(tuán)的有機(jī)胺類水溶液中，劇烈攪拌0.5-lh，使有機(jī)胺與酸活化凹凸棒土表面充分螯合；將試液離心分離，所得固體用去離子水反復(fù)洗滌，直至洗滌液pH呈中性；再在80-90 0C下真空干燥24h，得到表面活性基團(tuán)修飾的功能化活性凹凸棒土。 2)功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑的制備 步驟:將上述功能化活性凹凸棒土加入到一定體積的Tris-HCl緩沖液中，超聲分散15min-20min后，向上述溶液中加入配比量的戊二醛溶液，室溫下攪拌，活化2_3h后，離心分離，所得固體產(chǎn)物用去離子水洗滌；再將上述產(chǎn)物加到含脂肪酶的Tris-HCl緩沖液中，在4°C下反應(yīng)12-24h后，離心分離，洗滌，得到功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑。
【專利摘要】一種功能化活性凹凸棒土固定酶催化劑的制備方法，通過選取高比表面積多孔天然材料凹凸棒土作為載體，對凹凸棒土表面進(jìn)行活性修飾，在載體表面引入能夠與酶發(fā)生特異性共價反應(yīng)的功能化活性基團(tuán)，并在溫和條件下實(shí)現(xiàn)與酶的鍵合固定，并通過協(xié)同催化效應(yīng)，提高酶的活性和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，并提高其穩(wěn)定性。此制備技術(shù)可以應(yīng)用于脂肪酸酯類酶催化合成生產(chǎn)，其轉(zhuǎn)化率高，后處理簡單，可重復(fù)利用，環(huán)保無污染，生產(chǎn)成本降低，應(yīng)有較好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N11-14
【公開號】CN104531665
【申請?zhí)枴緾N201410743905
【發(fā)明人】魏林娟
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月8日