一種快速提取細菌dna的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種快速提取細菌DNA的方法。
【背景技術】
[0002] 食品安全一直以來都是社會各界的關注的重大問題，近年來，隨著各種食品安全 問題的不斷曝光，人們對食品安全的認識也在不斷提高。大多疾病的發(fā)生都和食品中的致 病微生物有關，而傳統(tǒng)的通過增菌、分離培養(yǎng)、生化反應與血清疑集等操作的方法已遠遠不 能難以滿足現(xiàn)代社會快速檢測的要求。實時熒光定量PCR法以其特異性強、穩(wěn)定性好、靈敏 度高、快速準確等優(yōu)點在食品微生物檢測領域得到廣泛的應用，模板DNA的提取是其中的 重要步驟之一，如何快速提取DNA模板是提高實時熒光定量PCR法檢測速度的關鍵。
[0003] 目前，DNA提取方法主要包括物理提取法、化學提取法和商用試劑盒等，物理提取 法包括超聲法、煮沸法等，超聲法對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌破碎率可達97%，但耗時 較長，且強度過于激烈，易使DNA斷裂。煮沸法快速、簡便，但難以保證DNA充分裂解，影響 檢測的靈敏度；化學提取法包括CTAB法和十二烷基磺酸鈉（SDS)法等，CTAB法是目前應用 較多的DNA提取方法，操作方法相對成熟，但該法提取DNA操作繁瑣、耗時長，且多次轉移， DNA易損失，操作過程中還要使用氯仿等有毒溶劑。十二烷基磺酸鈉（SDS)法被廣泛用于動 植物DNA的提取，但該方法對于多糖含量高的植物提取效果不佳，難以適應多種多樣的食 物基質中細菌DNA的提取，且操作繁瑣、耗時長，操作過程中使用苯酚、氯仿等有毒溶劑。商 用試劑盒法具有操作簡便、結果穩(wěn)定、高效的特點，但價格昂貴，成本較高。對于革蘭氏陽性 細菌，由于其細胞壁較厚，約20?80nm，一般的試劑盒方法中使用溶菌酶處理半個小時以 上才能進行有效的破壁。而溶菌酶需要低溫保存，對試劑盒的運輸與儲存要求較高。因此， 尋找一種簡單便捷、經(jīng)濟實惠、低毒低污染的快速提取方法意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種快速提取細菌DNA的方法。
[0005] 基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0006] 一種快速提取細菌DNA的方法，通過樣品增菌、低速離心使樣品與菌液分離、取上 清液加入裂解液、煮沸等步驟可將細菌的DNA分離出來，具體包括以下步驟：
[0007] (1)擴增樣品中的細菌數(shù)；
[0008] (2)將樣品進行低速離心使樣品與菌液分離；
[0009] (3)在分離后的上清液中加入5?10%體積分數(shù)的裂解液，煮沸l(wèi)Omin，所述裂解 液為用TE緩沖液配制的TritonX-100和Tween-20的混合液；
[0010] (4)然后高速離心2min，上清即為DNA溶液（_20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0011] 所述裂解液為1 % (體積分數(shù)）的TritonX-100和0? 5% (體積分數(shù)）的Tween-20 的混合液。
[0012] 所述TE緩沖液為 10mmol/LTris/HCl,lmmol/LEDTA,pH8. 0。
[0013] 所述擴增樣品中的細菌數(shù)具體是：吸取少量細菌，均勻混在保健食品原料粉末中， 靜置lOmin，加入營養(yǎng)肉湯，混合均勾，37°C培養(yǎng)18h。
[0014] 所述保健食品原料粉末為鈣粉。
[0015] 每克保健食品原料粉末中加入9ml的營養(yǎng)肉湯。
[0016] 所述低速離心的轉速為1000?3000rpm，高速離心的轉速為12000?15000rpm。
[0017] 所述細菌包括大腸桿菌（EscherichiaColi)、沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、志賀氏菌（Shigellaflexneri)等所有革蘭氏陰性菌和單增李斯特 菌（Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、豬鏈球菌 (Streptococcussuis)等所有革蘭氏陽性菌。
[0018] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：
[0019] (1)本發(fā)明采用增菌后低速離心的方法分離食品樣品基質與目標菌株，達到減少 食品基質對DNA提取過程干擾的作用。
[0020] (2)本發(fā)明適用于所有的細菌的DNA提取，包括革蘭氏陽性細菌，其中Triton X-100是一種非離子型表面活性劑，能溶解脂質，增加細胞膜的通透性，裂解細胞壁，和 Tween-20 -起能充分裂解細胞。
[0021] (3)本發(fā)明在化學裂解的基礎上與煮沸法相組合，和化學法相比，操作步驟簡單， 所需時間大大減少，可在20分鐘內(nèi)完成DNA提取過程；和物理法相比，DNA裂解更充分；和 試劑盒法相比，不需要溶菌酶的輔助裂解作用，擯棄了苯酚、氯仿等有毒溶劑的使用對環(huán)境 友好，卻具有相同的靈敏度檢出限，經(jīng)濟成本也大大降低。
【附圖說明】
[0022] 圖1為實施例1中菌株的實時熒光PCR擴增曲線。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術進行。
[0024] 實施例1
[0025] 1、分別取100yl大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，志賀氏 菌、豬鏈球菌（菌株全部為華南理工大學輕工與食品學院食品安全檢測中心保藏菌）均勻 混在25g由無限極（中國）有限公司保健食品原料鈣粉中，靜置10min，加入225ml營養(yǎng)肉 湯增菌液，混合均勻，37°C培養(yǎng)18h。
[0026] 2、取150y1到1. 5ml的離心管中，2000g離心lmin，使樣品與菌液分離。將上清液 轉移至新的離心管中，取100U1上清液，加入10U1裂解液后，煮沸l(wèi)〇min。15000rpm高速 離心2min，上清即DNA溶液，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｋ隽呀庖簽? %的TritonX-100和0? 5% 的Tween-20的混合液，溶劑全部用TE緩沖液配置。
[0027] 3、參考文獻得到各種細菌的引物探針，見表1。實時熒光定量PCR采用20yl反應 體系，每 20y1 的PCR反應體系包含 10y1 2xPCR預混液（PremixExTaq(ProbeqPCR))， 0.2yl參比染料（ROXReferenceDyeII)，lylPCR上游引物，lyl下游引物，0.5yl探 針，2yl模板，用DEPC水補齊至20yl，于ABI7500RealTimePCRSystem進行實時熒光 PCR擴增。反應程序：預變性95°Clmin;擴增95°C5s，60°C40s(收集熒光），每個循環(huán)收集 一次焚光，共40個循環(huán)，焚光基團用FAM標記。
[0028] 4、檢測結果如圖1所示，待檢測的6種菌都顯示陽性擴增曲線。
[0029] 表1引物和探針序列
【主權項】
1. 一種快速提取細菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 擴增樣品中的細菌數(shù)； (2) 將樣品進行低速離心使樣品與菌液分離； (3) 在分離后的上清液中加入5?10%體積分數(shù)的裂解液，煮沸l(wèi)Omin，所述裂解液為 用TE緩沖液配制的Triton X-100和Tween-20的混合液； (4) 然后高速離心2min，上清即為DNA溶液。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液為1 %的Triton X-100和 0? 5%的Tween-20的混合液。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述擴增樣品中的細菌數(shù)具體是： 吸取細菌，均勻混在保健食品原料粉末中，靜置lOmin，加入營養(yǎng)肉湯，混合均勻，37°C培養(yǎng) 18h〇
4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述保健食品原料粉末為鈣粉。
5. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，每克保健食品原料粉末中加入9ml的營養(yǎng) 肉湯。
6. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述低速離心的轉速為1000? 3000rpm，高速離心的轉速為12000?15000rpm。
7. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述細菌為大腸桿菌（Escherichia Coli)、沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes)、 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、志賀氏菌（Shigella flexneri)、豬鏈球菌 (Streptococcus suis)〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速提取細菌DNA的方法，包括以下步驟:(1)擴增樣品中的細菌數(shù)；(2)將樣品進行低速離心使樣品與菌液分離；(3)在分離后的上清液中加入5～10％體積分數(shù)的裂解液，煮沸10min，所述裂解液為用TE緩沖液配制的Triton X-100和Tween-20的混合液；(4)然后高速離心2min，上清即為DNA溶液。本發(fā)明通過裂解液和煮沸法相結合，能夠達到快速提取DNA的目的。本發(fā)明具有操作步驟簡單、耗時少、DNA裂解更充分、經(jīng)濟成本低等優(yōu)點，滿足現(xiàn)代微生物快速檢測的需求。
【IPC分類】C12N15-10
【公開號】CN104531676
【申請?zhí)枴緾N201410764765
【發(fā)明人】肖性龍, 胡雙芳, 李蓉, 余以剛, 萬松華
【申請人】華南理工大學, 中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月11日