特異識別豬H11位點(diǎn)的sgRNA及其編碼DNA和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及能夠特異識別豬H11位點(diǎn)的sgRNA及其 編碼DNA和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2010年，斯坦福大學(xué)的SimonHippenmeyer及其研宄團(tuán)隊(duì)在小鼠的第11號染色體 上分離并鑒定出了一個(gè)良好的基因插入位點(diǎn)，命名為hippll位點(diǎn)，簡稱H11位點(diǎn)。H11位點(diǎn) 位于Eif4enifl與Drgl兩個(gè)基因的間隙，與Eif4enifl基因的19號外顯子和Drgl基因的 9號外顯子相鄰，大小約5kb。H11位點(diǎn)由于位于兩個(gè)基因之間，因此安全性較高，無基因沉 默效應(yīng)，具有廣譜的細(xì)胞表達(dá)活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hippll位點(diǎn)定點(diǎn)基因修飾的小鼠與野生型小 鼠生長發(fā)育無區(qū)別。目前類似的還有R〇s26位點(diǎn)，但是該位點(diǎn)為一個(gè)基因，其啟動子為全身 性廣譜表達(dá)，難以做到組織特異性表達(dá)，然而H11位點(diǎn)則不存在類似的困難，由于其位于兩 基因之間，并且不存在啟動子，所以可以選擇實(shí)驗(yàn)所需的啟動子完成目的基因的時(shí)空特異 性表達(dá)，更好的達(dá)到任務(wù)目標(biāo)。如果在豬的基因組中定位hippll這樣安全有效的基因修飾 位點(diǎn)，將有利于穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因豬培育的技術(shù)體系。
[0003] ZFN和TALEN打靶技術(shù)是目前研宄較為成熟的兩種定點(diǎn)突變技術(shù)，但是這兩種技 術(shù)構(gòu)建程序較為繁瑣，每一個(gè)位點(diǎn)需要構(gòu)建一對相應(yīng)的核酸酶，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對特 異位點(diǎn)的識別靠小的crRNA的引導(dǎo)，CRISPR區(qū)可以有一系列的crRNA組成，每個(gè)針對特異 位點(diǎn)的crRNA只有幾十個(gè)堿基，整個(gè)載體較小，相對于ZFN和TALEN載體，更加容易構(gòu)建。
[0004] (CRISPR) /CRISPR-associated(Cas)是細(xì)菌和古細(xì)菌一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防 御機(jī)制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA來識別并剪切DNA以降解外來核酸分子。Cong等及 Mali等證明Cas9系統(tǒng)能在293T、K562、iPS等多種細(xì)胞中，進(jìn)行有效的靶向酶切，非同源重 組（NHEJ)、同源重組（HR)效率在3-25%之間，與TALEN酶切效果相當(dāng)。他們還證明，多個(gè) 靶點(diǎn)可以同時(shí)進(jìn)行靶向酶切。借助于這一技術(shù)，動植物基因功能研宄及育種等等都將得到 迅猛的發(fā)展。
[0005] 因此，尋求能高效的特異性識別豬的H11位點(diǎn)的序列，并借助Cas9酶對該位點(diǎn)進(jìn) 行高效的定點(diǎn)切割，將會為后面的針對豬H11位點(diǎn)高效定點(diǎn)整合實(shí)驗(yàn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了能高效特異識別豬H11位點(diǎn)sgRNA。本發(fā)明是利用編 碼sgRNA部分序列的短片段DNA構(gòu)建表達(dá)載體，該表達(dá)載體能夠表達(dá)出該sgRNA的識別染 色體上特定的DNA序列的片段序列，該sgRNA的部分序列能夠特異性地識別豬H11位點(diǎn)。 本發(fā)明還利用該sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶（即Cas9切刻酶）對豬H11位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確、高效 地靶向修飾。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 特異識別豬H11位點(diǎn)基因的SgRNA，由101個(gè)核苷酸組成，其中5'末端20nt的RNA 片段可以識別染色體上特定的DNA序列，其余81nt稱為骨架RNA片段。骨架RNA片段可形 成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與Cas9核酸酶結(jié)合，從而引導(dǎo)Cas9核酸酶切割靶標(biāo)DNA雙鏈，DNA雙鏈斷裂 后，細(xì)胞利用自身修復(fù)功能，使得靶標(biāo)位點(diǎn)附近的序列發(fā)生變化；
[0009] 其中識別染色體上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2):
[0010] 1)序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列；
[0011] 2)將所述1)的核苷酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且 具有與1)中的核苷酸序列具有同樣功能的核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述的編碼特異識別豬H11位點(diǎn)的sgRNA的DNA分子。
[0013] 上述的編碼特異識別豬H11位點(diǎn)的sgRNA的DNA分子包括但不限于編碼序列1) 的分子或序列2)分子。
[0014] 進(jìn)一步的，上述的編碼特異識別豬H11位點(diǎn)的sgRNA的DNA分子由編碼序列1的 分子甲或序列2分子乙組成。
[0015] 其中，上述DNA分子甲的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。
[0016] 其中，上述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列4所示。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述sgRNA在特異識別和靶向修飾豬HI1基因中的應(yīng) 用。
[0018] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是特異sgRNA在構(gòu)建豬H11基因突變庫中的應(yīng)用。所述的豬 H11基因，其基因組序列是如序列表中的序列5所示。
[0019] 本發(fā)明提供的特異識別豬H11基因的sgRNA，特異性強(qiáng)，能有效減少CRISPR/Cas9 系統(tǒng)存在的脫靶現(xiàn)象，進(jìn)而減少非特異性切割所引起的基因組非靶向位點(diǎn)的突變帶來的影 響。此外，本發(fā)明提供的編碼該sgRNA的DNA片段，能通過構(gòu)建Cas9-sgRNA表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn) 在細(xì)胞或個(gè)體水平上對豬HI1基因進(jìn)行敲除或修飾，以解析豬H111基因的功能、構(gòu)建豬HI1 基因突變庫，為培育優(yōu)良品系的豬提供前期技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0020] 圖1為測序檢測分析酶切載體結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本 發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0022] 實(shí)施例1sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0023] 1、在基因庫中調(diào)出豬的H11位點(diǎn)序列，其核苷酸序列如序列表中的序列5所示，根 據(jù)PAM序列選擇用于基因敲除的sgRNA靶點(diǎn)，PAM序列為NGG:
[0024] sgRNA靶位點(diǎn)位置 1 (命名為HI1-sgl) :GITCCTGGAAGTTTAGATCAGGG，相對應(yīng)的 sgRNA序列中識別該靶點(diǎn)的核苷酸序列如序列表中序列1所示；編碼該上述序列的DNA序 列如序列表中的序列3所示。
[0025] sgRNA靶位點(diǎn)位置 2 (命名為HIl-sg2) :AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG，相對應(yīng)的 sgRNA序列中識別該靶點(diǎn)核苷酸序列如序列表中序列2所示；編碼該上述序列的DNA序列 如序列表中的序列4所示。
[0026] 2、sgRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0027] 使用唯尚力德公司的cas9/gRNA構(gòu)建試劑盒（Catalog.No.VK001-01)完成構(gòu)建， 構(gòu)建過程如下：
[0028] (1)根據(jù)前面所述的兩個(gè)靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物序列，由北京天一輝遠(yuǎn)公司合 成，具體序列見表1 :
[0029] 表1兩個(gè)sgRNA靶點(diǎn)引物序列
[0030]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 特異識別豬H11位點(diǎn)的sgRNA，其序列包括識別染色體上特定的DNA序列片段和骨 架RNA片段，其特征在于，識別染色體上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2): 1) 序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列； 2) 將所述1)的核苷酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且具有 與1)中的核苷酸序列具有同樣功能的核苷酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的特異識別豬H11位點(diǎn)的sgRNA的DNA分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于，由編碼所述序列1)的分子或編碼序 列2)的分子組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于，由編碼所述序列1的分子甲或序列2 的分子乙組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子甲的核苷酸序列如序列 3所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子乙的核苷酸序列如序列 4所示。
7. 權(quán)利要求1所述的特異sgRNA在特異識別和靶向修飾豬H11基因中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的特異sgRNA在構(gòu)建豬H11基因突變庫中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了特異識別豬H11位點(diǎn)的sgRNA及其編碼DNA和應(yīng)用，該sgRNA序列包括識別染色體上特定的DNA序列片段和骨架RNA片段，識別染色體上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2)：1)序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸序列；2)將所述1)的核苷酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代和/或缺失和/或添加且具有與1)中的核苷酸序列具有同樣功能的核苷酸序列。本發(fā)明所提供的sgRNA能高效的識別豬的H11位點(diǎn)，并借助Cas9酶對該位點(diǎn)進(jìn)行高效的定點(diǎn)切割，其為后面的針對豬H11位點(diǎn)高效定點(diǎn)整合實(shí)驗(yàn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【IPC分類】C40B50-06, C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104531685
【申請?zhí)枴緾N201410697338
【發(fā)明人】李奎, 阮進(jìn)學(xué), 楊述林, 李和剛, 牟玉蓮, 吳添文, 魏景亮, 徐奎, 黃雷, 周榮, 劉楠
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年11月27日