提高種子中的物質(zhì)生產(chǎn)性的基因及其利用方法
【專利說明】提高種子中的物質(zhì)生產(chǎn)性的基因及其利用方法
[0001] 本申請是中國專利申請201080024446. 8的分案申請，原申請的申請日是2010年 6月4日，發(fā)明名稱是"提高種子中的物質(zhì)生產(chǎn)性的基因及其利用方法"。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物是以獲得其一部分組織本身（種子、根、葉莖等）為目的栽培的，或者是以生 產(chǎn)油脂等各種物質(zhì)為目的栽培的。例如，作為由植物產(chǎn)生的油脂，大豆油、胡麻油、橄欖油、 椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、紅花油、棕櫚油和菜籽油等自古以來已經(jīng)為人 們所知，在家庭用途和/或工業(yè)用途中被廣泛利用。另外，由植物產(chǎn)生的油脂也可以作為生 物柴油燃料和/或生物塑料的原料使用，作為石油替代能源應(yīng)用性正在擴(kuò)大。
[0003] 在這樣的現(xiàn)狀下，為了使用植物在工業(yè)上成功地進(jìn)行油脂生產(chǎn)，需要提高每單位 耕地面積的生產(chǎn)性。這里假定每單位耕地面積的栽培個體數(shù)一定，則可判定需要提高每個 個體的油脂生產(chǎn)量。在從由植物體采摘的種子中回收油脂的情況下，通過提高每個個體的 種子產(chǎn)量、和提高種子中的油脂含量等技術(shù)，可期待能夠?qū)崿F(xiàn)提高每個個體的油脂生產(chǎn)量。
[0004] 增加植物種子的油脂生產(chǎn)量的技術(shù)大致分為通過改良栽培法的技術(shù)和油脂增產(chǎn) 品種的開發(fā)。油脂增產(chǎn)品種的開發(fā)方法大致分為以雜交技術(shù)為核心的現(xiàn)有育種法和利用基 因重組的分子育種法。作為通過基因重組的油脂增產(chǎn)技術(shù)，已知：A)改變作為植物油脂的 主成分的種子三酰甘油（TAG)的合成體系的技術(shù)、和B)對調(diào)控植物的形態(tài)形成和/或代謝 和與它們相關(guān)的基因的表達(dá)的各種調(diào)控基因進(jìn)行改變的技術(shù)。
[0005] 對于上述A)的方法，作為增加以通過光合成生產(chǎn)的糖為原料合成的TAG的合成 量的方法，可以考慮（1)提高從作為TAG的構(gòu)成成分的脂肪酸或甘油的糖的合成活性的方 法、（2)強(qiáng)化由甘油和脂肪酸合成TAG的反應(yīng)的方法。對于這些方法，作為使用基因工程學(xué) 方法的技術(shù)，報告了以下技術(shù)。作為（1)的例子，可列舉通過使擬南芥的細(xì)胞質(zhì)型乙酰輔 酶A羧化酶（ACCase)在油菜籽的質(zhì)體中過量表達(dá)，從而將種子的油脂含量提高5%的報告 (非專利文獻(xiàn)1)。另外，作為（2)的例子，可列舉涉及通過在二酰甘油的sn-3位轉(zhuǎn)移?；?的DGAT(二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶）的過量表達(dá)來使油脂增產(chǎn)的技術(shù)的報告（非專利文獻(xiàn)2)。 在非專利文獻(xiàn)2的方法中，還報告了有時油脂含量和種子重量隨著DGAT的表達(dá)量增加而增 力口，每個個體的種子數(shù)增加。應(yīng)用了該方法的擬南芥的種子油脂含量增加46 %，每個個體的 油脂量最高增加約125%。
[0006] 另一方面，作為上述B)的方法，考慮了對與生物合成體系酶基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān) 的轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的方法。作為其例子可列舉專利文獻(xiàn)1。在該專利文獻(xiàn)1 中，采用了制作大范圍地將轉(zhuǎn)錄因子過量表達(dá)或敲除而得的重組植物，然后篩選出提高種 子的油脂含量的基因的方法。專利文獻(xiàn)1記載了通過ERF亞家族B-4轉(zhuǎn)錄因子基因的過 量表達(dá)而使種子的油脂含量增加了 23%。但是，在專利文獻(xiàn)1中，沒有記載每個個體的油 脂含量增減。另外，非專利文獻(xiàn)3記載了通過使作為具有AP2/EREB結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子的 WRINKLED1過量表達(dá)，提高了種子的油脂含量。
[0007] 另一方面，在將植物體中含有的纖維素等烴成分進(jìn)行糖化后，通過發(fā)酵制備醇的 情形，植物中含有的油脂成分成為雜質(zhì)，認(rèn)為這引起了糖化工序中的糖化效率低下。因 此，如果能夠降低油脂含量，則能夠提高糖化工序中的糖化效率，結(jié)果能夠期待提高醇 的生產(chǎn)性。例如，在非專利文獻(xiàn)3中，公開了WRI1/ASML1(AP2家族轉(zhuǎn)錄因子、AGI代碼： AT3g54320)缺陷株的種子變?yōu)榘櫟?，油脂含量減少。另外，專利文獻(xiàn)2中公開了，通過過量 表達(dá)AT3g23250(MYB15)將種子的油脂含量減少了 13%，通過過量表達(dá)ATlg04550(IAA12) 將種子的油脂含量減少了 12%，通過過量表達(dá)ATlg66390(MYB90)將種子的油脂含量減少 了 16%。
[0008] 但是，盡管以改良各種性狀為目的開發(fā)了上述的分子育種法，但實現(xiàn)油脂的生產(chǎn) 性提高或者降低的技術(shù)尚未達(dá)到實用的程度。
[0009] 認(rèn)為其原因在于：未發(fā)現(xiàn)真正優(yōu)異的基因；在試驗階段有效的重組新品種在實用 階段多樣的自然環(huán)境下不能發(fā)揮如期待的效果。另外，目的物質(zhì)的生產(chǎn)性等量的性狀與從 調(diào)控體系到代謝體系的各步驟中的大量基因相關(guān)，發(fā)現(xiàn)、開發(fā)改善量的性狀的真正優(yōu)異的 有用基因是困難的。為了解決這些問題，發(fā)現(xiàn)效果非常高的新基因、開發(fā)雖然效果水平同等 但能在實用環(huán)境條件下發(fā)揮效果的基因成為課題。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)
[0012] 專利文獻(xiàn) 1 :W001/36597
[0013] 專利文獻(xiàn) 2 :TO01/35727
[0014] 非專利文獻(xiàn)
[0015] 非專利文獻(xiàn) 1:PlantPhysiology(1997)，第 11 卷，第 75-81 頁；
[0016] 非專利文獻(xiàn) 2:PlantPhysiology(2001)，第 126 卷，第 861-874 頁；
[0017] 非專利文獻(xiàn) 3:PlantJ. (2004)40, 575-585

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 發(fā)明要解決的問題
[0019] 因此，鑒于上述事實，本發(fā)明的目的是探索具有能夠增加或減少物質(zhì)生產(chǎn)性的新 功能的基因，提供能夠提高植物體中的這些特性的技術(shù)。
[0020] 用于解決問題的方法
[0021] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過表達(dá)由特定的轉(zhuǎn) 錄因子和將任意轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)換成轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能性肽（以下，也有時稱為阻遏物結(jié)構(gòu) 域）融合而成的嵌合蛋白質(zhì)，可以改善各種量的性狀，特別是能夠增加或減少物質(zhì)生產(chǎn)性， 從而完成了本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明所涉及的植物體表達(dá)由轉(zhuǎn)錄因子和功能性肽融合而成的嵌合蛋白質(zhì)，所述 轉(zhuǎn)錄因子是包含以下（a)?（c)任一項所述蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，所述功能性肽是將任意轉(zhuǎn) 錄因子轉(zhuǎn)換成轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能性肽。
[0023] (a)包含序列號1?158中任一偶數(shù)編號所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0024] (b)包含序列號1?158中任一偶數(shù)編號所示氨基酸序列中缺失、置換、添加或插 入了 1個或多個氨基酸而得的氨基酸序列、并具有轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性的蛋白質(zhì)；
[0025] (c)與包含序列號1?158中任一奇數(shù)編號所示堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核 苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼的、并具有轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性的蛋白質(zhì)。
[0026] 在本發(fā)明所涉及的植物體中，優(yōu)選通過融合功能性肽，來抑制特定的轉(zhuǎn)錄因子的 轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性、特別是轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。這里作為上述功能性肽，可列舉以下所示的式（1)?⑶。
【主權(quán)項】
1. 提高十字花科植物個體的種子中含有的油脂的生產(chǎn)性的方法，所述方法是，在十字 花科植物中表達(dá)由轉(zhuǎn)錄因子和功能性肽融合而成的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是以下 (a)的蛋白質(zhì)，所述功能性肽是將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)換成轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能性肽，功能性肽的序 列是序列號519所不的氣基酸序列：GLDLDLELRLGFA， (a)由下表所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)， [表]
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性被抑制。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄抑制因子活性。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是擬南芥。
【專利摘要】本發(fā)明為提高種子中的物質(zhì)生產(chǎn)性的基因及其利用方法。探索了具有能夠增加或減少物質(zhì)生產(chǎn)性、特別地是種子中油脂含量的新功能的基因。將包含序列號1～158中任一偶數(shù)編號所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子與將任意轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)換成轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能性肽融合而成的嵌合蛋白質(zhì)在植物體表達(dá)。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-84, C07K7-08
【公開號】CN104531757
【申請?zhí)枴緾N201410720672
【發(fā)明人】近藤聰, 大音德, 村本伸彥, 光川典宏, 高木優(yōu), 松井恭子
【申請人】豐田自動車株式會社
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2010年6月4日
【公告號】CA2764589A1, CN102459600A, CN102459600B, CN104450773A, US20120144522, WO2010140682A1