全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備l-2-氨基丁酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-2-氨基丁酸是重要的藥物中間體和化工原料，市場需求非常大，每年市場在2000多噸以上。目前工業(yè)上主要是采用化學(xué)法進(jìn)行合成?；瘜W(xué)法的優(yōu)勢(shì)是制備成本低，但對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，隨著國家對(duì)環(huán)保的要求提高，用生物法制備L-2-氨基丁酸收到人們的青睞，生物法的優(yōu)點(diǎn)是污染小，環(huán)境友好，屬于綠色工業(yè)產(chǎn)品，是發(fā)展方向。但現(xiàn)行的生物轉(zhuǎn)化方法，步驟多，涉及到酶制備，和需要在生物還原轉(zhuǎn)化體系中加入輔酶，成本無法和化學(xué)合成法相比。傳統(tǒng)的方法都是先采用蘇氨酸脫氨酶，將蘇氨酸脫氨，得到2-酮基丁酸，然后再用亮氨酸脫氫酶進(jìn)行生物還原轉(zhuǎn)化，制備獲得L-2-氨基丁酸。特別是第一步需要將蘇氨酸使用價(jià)格昂貴的蘇氨酸脫氫酶，先行脫氨，再添加輔酶，用酶法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種步驟簡單、成本低的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的方法。
[0004]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的方法，將蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶串聯(lián)表達(dá)，克隆氯霉素抗性的表達(dá)載體上，表達(dá)載體選用T7啟動(dòng)子，低拷貝的復(fù)制起點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)二個(gè)酶在同一細(xì)菌中共表達(dá)；
甲酸酶的比活性低，克隆到中等拷貝的卡拉霉素抗性pET-28a載體上進(jìn)行表達(dá)，和大腸桿菌中輔酶I代謝途徑中限速步驟的pcnB基因串聯(lián)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)二個(gè)酶的高表達(dá)；
將二種抗性的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到同一個(gè)細(xì)菌里進(jìn)行共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了四個(gè)酶，在同一屬主菌里的表達(dá)，通過不同的拷貝的表達(dá)載體，調(diào)節(jié)了同一細(xì)菌中表達(dá)出的幾個(gè)酶有一個(gè)合適的活性比例，可以有助于實(shí)現(xiàn)高效率生物轉(zhuǎn)化。用大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)含有四種酶的大腸桿菌用全細(xì)胞實(shí)現(xiàn)從蘇氨酸到L-2-氨基丁酸的生物還原轉(zhuǎn)化。
[0005]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本申請(qǐng)建立的技術(shù)是采用細(xì)菌的全細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，一個(gè)菌同時(shí)表達(dá)四個(gè)酶，進(jìn)行生物還原轉(zhuǎn)化，避免酶的純化，顯著性的降低了成本，過表達(dá)輔酶I在大腸桿菌里合成的限速步驟酶pcnB基因，使得內(nèi)源性輔酶增加，避免2-酮基丁酸生物還原轉(zhuǎn)化過程添加價(jià)格昂貴的輔酶I。這些改進(jìn)使得生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的成本極大地降低，為生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸工業(yè)化提供一條新途徑。
[0006]傳統(tǒng)的方法都是先采用蘇氨酸脫氨酶，將蘇氨酸脫氨，得到2-酮基丁酸，然后再用亮氨酸脫氫酶進(jìn)行生物還原轉(zhuǎn)化，制備獲得L-2-氨基丁酸。我們用同一個(gè)菌，表達(dá)四個(gè)酶，避免將蘇氨酸先用蘇氨酸脫氫酶，顯著地降低了制備L-2-氨基丁酸的工業(yè)化成本。
[0007]考慮到甲酸酶的比活性較低，我們采用中等拷貝的表達(dá)載體pET_28a實(shí)現(xiàn)甲酸酶的高效表達(dá)，而活性相對(duì)較高的蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶用低拷貝的表達(dá)載體在同一細(xì)菌里進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)化了同一細(xì)胞中酶的比例，實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化的高效率。
[0008]在相對(duì)較高的的甲酸酶表達(dá)載體上，串聯(lián)表達(dá)了大腸桿菌里輔酶I合成的限速步驟的PcnB基因，并實(shí)現(xiàn)高表達(dá)。結(jié)果使得在轉(zhuǎn)化體系內(nèi)，不需要添加輔酶就可以實(shí)現(xiàn)2-酮基丁酸的高效轉(zhuǎn)化。
【具體實(shí)施方式】
[0009]實(shí)例1:將pET28的載體的抗性和復(fù)制起點(diǎn)，替換成pLys S的氯霉素抗性和復(fù)制起點(diǎn)，然后將蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶，串聯(lián)克隆到該載體上；將甲酸酶和pcnB基因串聯(lián)到pET28a載體上；二個(gè)不同抗性的表達(dá)載體，同時(shí)轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)屬主菌里，在IPTG的誘導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)4個(gè)酶的同時(shí)表達(dá)。
[0010]用大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)含有四種酶的大腸桿菌用全細(xì)胞實(shí)現(xiàn)從蘇氨酸到L-2-氨基丁酸的生物還原轉(zhuǎn)化。
[0011]實(shí)施例2:
將上述四個(gè)酶同時(shí)表達(dá)的菌體，配制成懸浮液，加入一定量的甲酸銨和蘇氨酸，在30度進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后不斷補(bǔ)加蘇氨酸，到終濃度為0.8 M，L-2-氨基丁酸基本停止轉(zhuǎn)化，離心去掉菌體，上清濃縮到干，用甲醇洗滌去鹽，得到純度為98%的L-2-氨基丁酸，EE值在99%以上。
[0012]本申請(qǐng)，采用將蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶，克隆到一個(gè)氯霉素抗性的低拷貝的表達(dá)載體上，將活性低甲酸克隆到pET28a載體上。為增加表達(dá)工程菌的內(nèi)源性輔酶I，同時(shí)將大腸桿菌內(nèi)源性輔酶I合成的限速步驟的酶PcnB基因，和甲酸酶基因串聯(lián)表達(dá)。實(shí)現(xiàn)4個(gè)酶，在二個(gè)不同抗性載體，轉(zhuǎn)化到同一細(xì)菌BL21(DE3)菌里，共表達(dá)。用我們的工程菌，可以直接以L-蘇氨酸作為底物，進(jìn)行全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化，獲得L-2-氨基丁酸的高效制備。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法是: 將蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶串聯(lián)表達(dá)，克隆氯霉素抗性的表達(dá)載體上，實(shí)現(xiàn)二個(gè)酶在同一細(xì)菌中共表達(dá)； 甲酸酶克隆到卡拉霉素抗性pET-28a載體上進(jìn)行表達(dá)，和大腸桿菌中輔酶I代謝途徑中限速步驟的pcnB基因串聯(lián)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)一■個(gè)酶的尚表達(dá)； 將二種抗性的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到同一個(gè)細(xì)菌里進(jìn)行共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了四個(gè)酶，在同一屬主菌里的表達(dá)； 用大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)含有四種酶的大腸桿菌用全細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)從蘇氨酸到L-2-氨基丁酸的生物還原轉(zhuǎn)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶串聯(lián)表達(dá)的表達(dá)載體選用T7啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，甲酸酶采用中等拷貝的表達(dá)載體pET-28a實(shí)現(xiàn)甲酸酶的高效表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶用低拷貝的表達(dá)載體在同一細(xì)菌里進(jìn)行表達(dá)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備L-2-氨基丁酸的方法。所述方法是：將蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶串聯(lián)表達(dá)，克隆氯霉素抗性的表達(dá)載體上，實(shí)現(xiàn)二個(gè)酶在同一細(xì)菌中共表達(dá)；甲酸酶克隆到卡拉霉素抗性pET-28a載體上進(jìn)行表達(dá)，和大腸桿菌中輔酶I代謝途徑中限速步驟的pcnB基因串聯(lián)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)二個(gè)酶的高表達(dá)；將二種抗性的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到同一個(gè)細(xì)菌里進(jìn)行共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了四個(gè)酶，在同一屬主菌里的表達(dá)；用大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)含有四種酶的大腸桿菌用全細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)從蘇氨酸到L-2-氨基丁酸的生物還原轉(zhuǎn)化。本發(fā)明使得在轉(zhuǎn)化體系內(nèi)，不需要添加輔酶就可以實(shí)現(xiàn)2-酮基丁酸的高效轉(zhuǎn)化，成本低、方法簡單。
【IPC分類】C12P13-00, C12R1-19
【公開號(hào)】CN104531793
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410793186
【發(fā)明人】郁慶明
【申請(qǐng)人】郁慶明
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月20日