用于檢測(cè)人apoc3基因突變的引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)人APOC3基因突變的引 物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 高甘油三醋血癥（hypertriglyceridemia，HTG)是高血脂癥的一種，會(huì)引起 動(dòng)脈粥樣硬化，造成血管堵塞和形成血栓，嚴(yán)重的還能引發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病 (coronaryatheroscleroticheartdisease,CHD)。然而在輕度和中度時(shí)期，甘油三醋高 癥狀并不明顯，可能患者絲毫沒有感覺，當(dāng)甘油三酯高癥狀逐漸出現(xiàn)時(shí)，卻已發(fā)展到了血管 堵塞變窄，影響機(jī)體血流供應(yīng)和機(jī)體內(nèi)部供血不足的情況了，此時(shí)病情已到了較嚴(yán)重的程 度。人一旦被檢測(cè)為高甘油三酯血癥患者，他必須改變其生活方式，拒絕高油高糖高脂等三 高食物，增加鍛煉和戒煙。所以，定期血液生化檢查顯得非常重要，但是如果能從基因的角 度來早期篩查人們患高甘油三酯血癥的風(fēng)險(xiǎn)，從源頭就開始杜絕患病隱患，改變不良的生 活習(xí)慣，對(duì)人們?nèi)粘Ｉ罘绞降倪x擇，疾病的個(gè)性化治療尤其有現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 許多研宄表明，載脂蛋白CIII(ApoCIII)的表達(dá)水平與高甘油三酯血癥呈正相關(guān)。 載脂蛋白CIII由AP0C3(apolipoproteinCIII)基因編碼，是一個(gè)擁有99個(gè)氨基酸的糖蛋 白，在人體內(nèi)主要在肝臟合成，少量在小腸合成。載脂蛋白CIII在富含甘油三酯的脂蛋白 (triglyceride-richlipoprotein,TRL)代謝中起關(guān)鍵作用，具有抑制脂蛋白脂酶和肝脂 酶活性的功能，干擾載脂蛋白E(apolipoproteinE，ApoE)介導(dǎo)的富含甘油三醋的脂蛋白 (TRL)與肝脂酶的結(jié)合，影響脂質(zhì)代謝的平衡，從而容易導(dǎo)致高甘油三酯血癥。在正常人空 腹血漿中載脂蛋白CIII主要與高密度脂蛋白HDL(約70% )結(jié)合，而高甘油三酯血癥患者血 漿載脂蛋白CIII水平顯著升高，其主要（約86%)與極低密度脂蛋白VLDL結(jié)合。
[0004] 研宄發(fā)現(xiàn)，人群中至少存在4種AP0C3基因突變類型，分別為無義突變（R19X， C>T)，剪切位點(diǎn)突變（IVS2+1G>A)，錯(cuò)義突變（A43T，G>A)，剪切位點(diǎn)突變（IVS3+1GXT)，這些 突變與高甘油三酯血癥和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病相關(guān)，只要攜帶任意一個(gè)AP0C3變異 體的人群不但在他們的血液中具有較低水平的載脂蛋白CIII和甘油三酯含量，同時(shí)他們罹 患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)也大大降低了，屬于不易發(fā)生心臟疾病的人群。
[0005] 目前還沒有檢測(cè)AP0C3基因突變的試劑盒。全血中存在一些抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)， 一般需要抽提人基因組DNA后才能進(jìn)行PCR反應(yīng)，這樣需要額外購(gòu)買DNA抽提試劑盒，增加 檢測(cè)費(fèi)用，同時(shí)增加檢測(cè)步驟，容易造成樣本污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種用于檢測(cè)人AP0C3基因突變的引物。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供了一種無需抽提基因組DNA，而從血液直接 通過PCR方法擴(kuò)增AP0C3基因，經(jīng)測(cè)序后鑒別AP0C3突變位點(diǎn)的試劑盒。本發(fā)明采用特殊 的Taq酶和緩沖液配方，能夠避免血液中的抑制因子對(duì)PCR造成的影響，可以直接以全血作 為PCR模板，減少檢測(cè)費(fèi)用，同時(shí)避免操作污染。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 在本發(fā)明的一方面，提供一種用于檢測(cè)人APOC3基因突變的引物，其序列為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)人AP0C3基因突變的引物，其特征在于，其序列為： 正向引物；AP0C3-PF 5' -GACCCAGCTAAGGTTCTAC-3'，如 SEQ ID No. 3 所示； 反向引物；AP0C3-PR 5' -AGGCTGAAGAGGCACAG-3'，如 SEQ ID No. 4 所示。
2. -種用于檢測(cè)人AP0C3基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其特征在于，其包含2X化q Master Mix,權(quán)利要求1所述引物對(duì)和去離子水(1地2〇。
3. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)人AP0C3基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其特征在于， 所述 2XI'aq Master Mix 的配方是；0. 05U/yl 化emoTaq 酶、0. 5mM dNTP，60mM Tricine， 5mM(NH4)2S〇4,3. 5mM MgCl2,5-10% 甘油，200ng/yl BSA。
4. 如權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)人AP0C3基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其特征在于，所 述化emoTaq酶是截短后的化q DNA聚合酶，它缺失了 5' -3'外切酶活性。
5. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)人AP0C3基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其特征在 于，該試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR模板為全血，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 5min預(yù)變性；然后 95°C 15sec 變性，55°C 30sec 退火，72°C 20sec 延伸，72°C 5min 延伸循環(huán) 30 次。
6. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)人AP0C3基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其特征在于， 該試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，一次PCR反應(yīng)能同時(shí)檢測(cè)4個(gè)突變位點(diǎn)，分別為無義突變巧19X， C〉T)，剪切位點(diǎn)突變（IVS化1G〉A(chǔ))，錯(cuò)義突變（A43T，G〉A(chǔ))，剪切位點(diǎn)突變（IVS3+1G〉T)。
7. 如權(quán)利要求1所述的引物在制備檢測(cè)人AP0C3基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測(cè)人APOC3基因突變的引物，其序列為：正向引物：APOC3-PF5’-GACCCAGCTAAGGTTCTAC-3’，如SEQ ID No.3所示；反向引物：APOC3-PR5’-AGGCTGAAGAGGCACAG-3’，如SEQ ID No.4所示。此外，本發(fā)明還公開了一種用于檢測(cè)人APOC3基因突變的PCR擴(kuò)增試劑盒，其包含2×Taq Master Mix，所述引物對(duì)和去離子水ddH2O。本發(fā)明無需抽提基因組DNA，而從血液直接通過PCR方法擴(kuò)增APOC3基因，經(jīng)測(cè)序后鑒別APOC3突變位點(diǎn)，可以直接以全血作為PCR模板，減少檢測(cè)費(fèi)用，同時(shí)避免操作污染。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104531876
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410851684
【發(fā)明人】謝彩霞, 蔡麗君, 羅鵬, 沈偉強(qiáng)
【申請(qǐng)人】上海鼎晶生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月31日