鑒定小麥新矮稈主效qtl的分子標(biāo)記的引物對(duì)、方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及作物分子育種領(lǐng)域，特別是涉及一種鑒定小麥新矮桿主效QTL的分子 標(biāo)記的引物對(duì)、方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥在我國(guó)是僅次于玉米和水稻的第三大糧食作物，同時(shí)也是我國(guó)半數(shù)以上人口 的主要口糧，總產(chǎn)量和消費(fèi)量均居世界首位，因此小麥生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展對(duì)我國(guó)的糧食安全 保障具有重要意義。株高是影響小麥株型和產(chǎn)量的一個(gè)重要農(nóng)藝性狀。降低株高和提高抗 倒伏性是小麥育種的重要目標(biāo)，而矮桿基因或矮源則是小麥矮桿育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，株高的 遺傳解析、矮桿基因的發(fā)掘和利用對(duì)小麥矮桿高產(chǎn)品種的培育具有重要指導(dǎo)意義。
[0003] 自20世紀(jì)60年代農(nóng)林10矮桿基因被用于小麥育種以來(lái)，矮桿基因的研宄和利用 被越來(lái)越多的遺傳學(xué)家和育種專家所重視，矮桿成為世界范圍內(nèi)小麥高產(chǎn)、超高產(chǎn)育種的 主要目標(biāo)性狀，矮桿、半矮桿品種的選育和推廣，使得世界小麥產(chǎn)量平均年遞增3. 4% (萬(wàn) 平等，1998)。目前小麥育種中廣泛使用的是攜帶Rhtl、Rht2、Rht8、Rht9等隱性矮桿基因 的親本（郭保宏等，1997)。矮源的遺傳多樣性低不利于小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)提高，矮桿基因 的發(fā)掘及遺傳研宄利用在育種中越來(lái)越受重視。從新矮源的創(chuàng)造和現(xiàn)有矮源的利用兩方面 著手，拓寬小麥品種的遺傳基礎(chǔ)，同時(shí)注意矮桿背景基因型的改造，是小麥育種工作進(jìn)一步 推進(jìn)的關(guān)鍵途徑。迄今為止，在小麥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 40多個(gè)矮桿主效基因，分布在20個(gè)位 點(diǎn)上，已經(jīng)正式定名的小麥矮桿基因有22個(gè)（Rhtl_Rht22) (McIntosh等，2010 ;Haque等， 2011 ;Peng等，2011)，這些矮桿基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于世界范圍內(nèi)小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的改良具有重 要作用。但研宄工作大多集中在詘丨1、詘丨2、詘丨3、詘丨8、詘丨9、詘丨10和詘丨12上。這些矮 桿基因的遺傳方式或表現(xiàn)為顯性，或表現(xiàn)為隱性；對(duì)赤霉素反應(yīng)或表現(xiàn)為敏感，或表現(xiàn)為不 敏感，各有特點(diǎn)（董玉琛，2000)，其中，Rhtl和Rht2隱性基因來(lái)源于農(nóng)林10號(hào)等Daruma衍 生品種，分別位于4BS和4DS染色體上，對(duì)GA3反應(yīng)不敏感。Rht3顯性基因來(lái)源于大拇指 矮，位于4BS染色體上，對(duì)GA3反應(yīng)不敏感。Rht8和Rht9隱性矮桿基因來(lái)源于赤小麥，分別 位于2DL與7BS染色體上，對(duì)GA3反應(yīng)為敏感型。RhtlO基因是從矮變1號(hào)鑒定出來(lái)的，位 于4DS染色體上，是降桿作用最強(qiáng)的基因，對(duì)GA3反應(yīng)不敏感。Rhtl2來(lái)源于Karcag522的 輻射突變體，在5AL染色體上，與芒抑制基因BI緊密連鎖，對(duì)GA3反應(yīng)不敏感。
[0004] 分子標(biāo)記輔助選擇是直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，具有不受環(huán)境條件、基因間互作、基 因型與環(huán)境互作影響等優(yōu)點(diǎn)，能夠大大提高育種工作的選擇效率。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā) 展和DNA高通量測(cè)序技術(shù)的日益成熟，產(chǎn)生了第三代分子標(biāo)記技術(shù)-SNP標(biāo)記。SNP是指在 基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入 及缺失等形式（Brookes等，2006)。SNP在幾乎所有的物種基因組中都有很高的頻率，在人 類基因組中大概每1. 3kb就有一個(gè)SNP的存在。大量存在的SNP位點(diǎn)，使人們有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn) 各種基因組突變。SNP標(biāo)記通常具有雙等位基因多態(tài)性，其突變率相當(dāng)?shù)?，是一種穩(wěn)定的突 變。而且SNP標(biāo)記密度高，富有代表性且易實(shí)現(xiàn)分析自動(dòng)化。檢測(cè)SNP的方法有DNA芯片技 術(shù)、陣列雜交分析、同源雜交法及直接測(cè)序法等。其中以DNA芯片技術(shù)方法最佳，已得到大 規(guī)模的發(fā)展與應(yīng)用。以DNA芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的SNP標(biāo)記是一種高通量的分子標(biāo)記技術(shù)，而 且隨著越來(lái)越多的農(nóng)作物全基因組測(cè)序的完成，SNP標(biāo)記將成為植物遺傳育種研宄中理想 的分子標(biāo)記（方宣鈞等，2002)。目前，根據(jù)小麥EST序列SNP變異開發(fā)出的小麥Infinium iSelect9k和InfiniumiSelect90kSNP芯片已經(jīng)商業(yè)化，為開展小麥SNP分析提供了重 要的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種鑒定小麥新矮桿主效QTL的分 子標(biāo)記的引物對(duì)、方法及應(yīng)用，能準(zhǔn)確鑒定小麥材料的新矮桿主效QTL。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種鑒定小麥新矮桿主效QTL的分子標(biāo)記的引 物對(duì)，包括以下引物對(duì)中的一對(duì)或幾對(duì)：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定小麥新矮桿主效QTL的分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，包括W下引物對(duì) 中的一對(duì)或幾對(duì)： WGGC6079 ;正向引物；5' -ATGGAGGTTTGGGATCAGCA-3'（SEQ ID NO. 1)，反向引物； 5' -ACTATGGTACACTCGTGCGT-3'(沈Q ID NO. 2); WGGC6880 ;正向引物；5' -CTTGCTGAGCTTGGTGGT-3'（SEQ ID NO. 3)，反向引物； 5' -TTGTTGCTGCACCATTACCC-3'(沈Q ID NO. 4); WGGC8307 ;正向引物；5' -CTTTGCCGTCAACGGCCA-3'（SEQ ID NO. 5)，反向引物； 5, -TACGTGGAGAGCAGCACTAC-3,（SEQ ID NO. 6); WGGC6073 ;正向引物；5' -CACAAGTACAAGGACCGCAG-3'（SEQ ID NO. 7)，反向引物；5' -CA ACAATCTCCATTTGCTTCTGA-3'（SEQ ID NO. 8)。
2. -種鑒定小麥新矮桿主效WL分子標(biāo)記的方法，其特征在于，包括W下步驟： W所鑒定小麥材料的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)所述模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳和銀染檢測(cè)，若檢測(cè)結(jié)果為能擴(kuò)增出與小麥品種 北農(nóng)6號(hào)DNA片段相同大小的DNA片段，則確定所鑒定小麥材料中含有新矮桿主效QTL的 QWi-2A. 2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定小麥新矮桿主效giL的分子標(biāo)記的方法，其特征在于，所 述新矮桿主效QTL的QPh-2A. 2來(lái)源于小麥品種北農(nóng)6號(hào)，位于小麥2A染色體長(zhǎng)臂上。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鑒定小麥新矮桿主效QTL的分子標(biāo)記的方法，其特征在 于， 所述分子標(biāo)記WGGC6079的引物對(duì)，對(duì)所鑒定小麥材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢 測(cè)到與小麥品種北農(nóng)6號(hào)相同大小的DNA片段，該DNA片段與QPh-2A. 2之間遺傳距離為 OcM ； 所述述分子標(biāo)記WGGC6880的引物對(duì)，對(duì)所鑒定小麥材料DM進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能 檢測(cè)到與小麥品種北農(nóng)6號(hào)相同大小的DNA片段，該DNA片段與QPh-2A. 2之間遺傳距離 為 OcM ; 所述分子標(biāo)記WGGC8307的引物對(duì)，對(duì)所鑒定小麥材料DM進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢 測(cè)到與小麥品種北農(nóng)6號(hào)相同大小的DNA片段，該DNA片段與QPh-2A. 2之間遺傳距離為 1. 7cM ; 所述分子標(biāo)記WGGC6073的引物對(duì)，對(duì)所鑒定小麥材料DM進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，電泳能檢 測(cè)到與小麥品種北農(nóng)6號(hào)相同大小的DNA片段，該DNA片段與QPh-2A. 2之間遺傳距離為 3. OcM。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鑒定小麥新矮桿主效QTL的分子標(biāo)記的方法，其特征在 于，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳和銀染檢測(cè)為： (1) PCR 擴(kuò)增體系為；反應(yīng)體系為 lOyL，包含 lOXbuffer lyL，15mmol L-iMgCyuL， 2mmol L-idNTP lyL，20ngyL-i引物 lyL'lU Taq 酶，d 地 2〇 4yL，20ngyL-i基因組DNA 2化； (2) PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 °C預(yù)變性5min ;然后94 °C變性45s，55 °C退火45s，72 °C延伸 1. 5min，40個(gè)循環(huán)；最后72°C后延伸lOmin ; (3) 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)為；擴(kuò)增產(chǎn)物加入3uL上樣緩沖液形成檢測(cè)樣品，所述上樣緩沖 液含質(zhì)量濃度為98%的甲酷胺，lOmmol L-1邸TA，抑為8.0,質(zhì)量濃度為0.25%的漠酪藍(lán)和 質(zhì)量濃度為0. 25%的二甲苯青；取3 UL所述檢測(cè)樣品在8%非變性聚丙締酷胺凝膠上W恒 定電壓100?150V，電泳3. 5?4. 5小時(shí)，經(jīng)硝酸銀染色后進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)或掃描記錄。
6. -種權(quán)利要求1所述的鑒定小麥新矮桿主效WL的分子標(biāo)記的引物對(duì)在小麥新矮桿 分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
7. -種權(quán)利要求1所述的鑒定小麥新矮桿主效WL的分子標(biāo)記的引物對(duì)在制作小麥新 矮桿材料中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定小麥新矮稈主效QTL的分子標(biāo)記的引物對(duì)、方法及應(yīng)用，屬于作物分子育種領(lǐng)域。該引物對(duì)為：分子標(biāo)記WGGC6079的引物對(duì)、分子標(biāo)記WGGC6880的引物對(duì)、分子標(biāo)記WGGC8307的引物對(duì)、分子標(biāo)記WGGC6073的引物對(duì)中的一對(duì)或多對(duì)引物。利用分子標(biāo)記的引物對(duì)對(duì)所鑒定小麥材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測(cè)，若待檢測(cè)材料能擴(kuò)增出與小麥品種北農(nóng)6號(hào)相應(yīng)大小的DNA片段，則確定該小麥材料中含有新矮稈主效QTL QPh-2A.2。通過(guò)本發(fā)明的分子標(biāo)記引物對(duì)和方法，可以準(zhǔn)確鑒定小麥材料中是否含有新矮稈主效QTL QPh-2A.2。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104531882
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510015294
【發(fā)明人】韓俊, 劉志勇, 潘金豹, 謝皓, 康恩寬
【申請(qǐng)人】北京農(nóng)學(xué)院
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月12日