鑒定或輔助鑒定h6n1亞型禽流感病毒的成套試劑及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中鑒定或輔助鑒定H6N1亞型禽流感病毒的成套試劑及 其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus,AIV)根據(jù)表面糖蛋白（Hemagglutinin,HA) 和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase,NA)抗原性差異分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)有16種HA亞 型（H1-H16)和9種NA亞型（N1-N9)，HA和NA的組合可產(chǎn)生至少135種亞型，其中，H5和 H7亞型中的部分組合（H5N1、H7N7和H7N9等）稱為高致病性AIV，可感染人類并致死。低 致病性AIV感染雖然無任何癥狀或表現(xiàn)溫和的、輕微的不典型癥狀，對畜禽和人類的健康 不具威脅性，但當不同亞型的低致病性AIV毒株混合感染畜禽時，可以在動物體內(nèi)互相交 換基因，從而產(chǎn)生無法預測致病性和傳染性的新變異株，這將對禽類和人類健康存在很大 的威脅。
[0003] H6亞型AIV屬于低致病性AIV，但有報道表明1997年在香港爆發(fā)感染人的高致病 性H5N1病毒，除HA基因外，其余7個基因片段都與A/teal/HongKong/W312/97 (H6N1)病 毒高度相似，因此H6亞型AIV很可能成為高致病性H5亞型AIV的基因供體。2013年6月， 臺灣發(fā)現(xiàn)了第一例人感染型H6N1亞型AIV，是一種低致病性禽流感病毒，其HA基因由臺灣 H6亞型AIV支內(nèi)進化而來。
[0004] 雁形目（鴨子、鵝、天鵝）和鵒形目（岸禽類鳥、鷗、燕鷗、海雀）是AIV潛伏的主 要自然宿主，其中特別是水禽，是所有亞型AIV的儲存庫，并經(jīng)糞便排毒污染水系，通過直 接傳播或候鳥的南北迀徙將病毒進一步散播開來，感染其它禽類和哺乳動物，因此水禽被 認為是流感病毒的天然儲存庫和新毒株的重要來源，在流感病毒的遺傳進化和生態(tài)分布中 具有重要作用。低致病性AIV在健康鴨群中潛伏、繁殖和排毒，也可通過基因重排導致高致 病性禽流感的爆發(fā)，危害養(yǎng)禽業(yè)的安全，亦可能進化為可突破種間屏障的人禽流感病毒，危 害人類健康。目前，H6亞型AIV受到廣泛地關(guān)注，對養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生有重要的影響。
[0005] 病毒分離與鑒定是經(jīng)典的流感檢測方法，即先將樣品接種SPF雞胚增殖病毒2-5 天，再收集雞胚尿囊液進行血凝試驗和血凝抑制試驗，結(jié)果準確可靠，但存在檢測周期長的 缺點。酶聯(lián)免疫吸附試驗雖可檢測禽流感病毒的抗原，但需要特定的標準陽性血清。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定H6N1亞型禽流感病毒，即確定HA亞型是 否為H6亞型及其NA亞型是否為N1亞型。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了鑒定或輔助鑒定H6亞型和/或N1亞型 禽流感病毒的成套試劑。
[0008] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定H6亞型和/或N1亞型禽流感病毒的成套試劑， 由名稱為H6-T的成套DNA和名稱為N1-T的成套DNA組成；
[0009] 所述H6-T由名稱為H6的PCR引物對和名稱為H6-P的探針組成；所述H6由序列 表中SEQIDNo. 1所示的單鏈DNA(H6-F)和SEQIDNo. 2所示的單鏈DNA(H6-R)組成；所 述H6-P為序列表中SEQIDNo. 3所示的單鏈DNA;
[0010] 所述N1-T由名稱為N1的PCR引物對和名稱為N1-P的探針組成；所述N1由序列 表中SEQIDNo. 4所示的單鏈DNA(Nl-F)和SEQIDNo. 5所示的單鏈DNA(Nl-R)組成；所 述N1-P為序列表中SEQIDNo. 6所示的單鏈DNA。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了成套DNA。
[0012] 本發(fā)明所提供的成套DNA，為鑒定或輔助鑒定H6亞型禽流感病毒的成套DNA或鑒 定或輔助鑒定N1亞型禽流感病毒的成套DNA;所述鑒定或輔助鑒定H6亞型禽流感病毒的 成套DNA為所述成套DNAH6-T;所述鑒定或輔助鑒定N1亞型禽流感病毒的成套DNA為所 述成套DNAN1-T。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定H6亞型和/或N1亞型禽 流感病毒的成套引物。
[0014] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定H6亞型和/或N1亞型禽流感病毒的成套引物， 由所述PCR引物對H6和所述PCR引物對N1組成。
[0015] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了PCR引物對。
[0016] 本發(fā)明所提供的PCR引物對，為鑒定或輔助鑒定H6亞型禽流感病毒的引物對或鑒 定或輔助鑒定N1亞型禽流感病毒的引物對；所述鑒定或輔助鑒定H6亞型禽流感病毒的引 物對為所述H6 ;所述鑒定或輔助鑒定N1亞型禽流感病毒的引物對為所述N1。
[0017] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定H6亞型和/或N1亞型禽 流感病毒的系統(tǒng)。
[0018] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定H6亞型和/或N1亞型禽流感病毒的系統(tǒng)（產(chǎn)品 和/或設(shè)備），為下述H-M中的任一種：
[0019] H、含有所述成套試劑的系統(tǒng)；
[0020] I、含有所述H6-T的系統(tǒng)；
[0021] J、含有所述N1-T的系統(tǒng)；
[0022] K、含有所述成套引物的系統(tǒng)；
[0023] L、含有所述PCR引物對H6的系統(tǒng)；
[0024] M、含有所述PCR引物對N1的系統(tǒng)。
[0025] 上述系統(tǒng)中，所述探針可標記有熒光染料。所述標記有熒光染料具體可為FAM和 / 或Eclipse和 / 或R0X。
[0026] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述H6-P的5'端標記有報告焚光染料FAM，3'端標記 有淬滅熒光染料Eelipse;所述N1-P的5'端標記有報告熒光染料R0X，3'端標記有淬滅 熒光染料Eclipse。
[0027] 上述系統(tǒng)，還可包括熒光PCR所需的試劑和儀器。具體來說，所述系統(tǒng)可包括所述 成套試劑、所述H6-T、所述N1-T、所述成套引物、所述PCR引物對H6或所述PCR引物對N1 以及熒光PCR所需要的其它試劑和儀器。
[0028] 上述系統(tǒng)還可僅包括所述成套試劑、所述成套DNAH6-T、所述成套DNAN1-T、所述 成套引物、所述PCR引物對H6或所述PCR引物對N1。
[0029] 所述成套試劑、所述成套DNAH6-T、所述成套DNAN1-T、所述成套引物、所述PCR 引物對H6或所述PCR引物對N1以及熒光PCR所需要的其它試劑均可獨立包裝。所述成套 試劑、所述成套DNAH6-T、所述成套DNAN1-T、所述成套引物、所述PCR引物對H6和所述 PCR引物對N1中的各引物對和/或各引物對的兩條單鏈DNA和/或探針均可獨立包裝。
[0030] 熒光PCR所需要的其它試劑可包括DNA聚合酶和/或PCR緩沖液和/或dATP、 dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物和/或MgCl2。所述DNA聚合酶具體可為Taq聚合酶。
[0031] 上述系統(tǒng)中，所述H還包括記載有下述內(nèi)容的載體：在同一個PCR反應體系中，以 待測生物樣品的核酸（DNA或RNA或cDNA)為模板，用所述成套試劑進行熒光PCR;FAM通道 和ROX通道的結(jié)果均呈陽性（即擴增曲線為S型曲線），所述待測樣品含有H6N1亞型禽流 感病毒；FAM通道的結(jié)果呈陰性（即擴增曲線為直線）、ROX通道的結(jié)果呈陽性（即擴增曲 線為S型曲線），所述待測樣品含有HxNl(x辛6)亞型禽流感病毒；FAM通道的結(jié)果呈陽性 (即擴增曲線為S型曲線）、ROX通道的結(jié)果呈陰性（即擴增曲線為直線），所述待測樣品含 有H6Nx(x辛1)亞型禽流感病毒；FAM通道和ROX通道的結(jié)果均呈陰性（即擴增曲線為直 線），所述待測樣品含有HxNy亞型禽流感病毒（x辛6，y辛1)或所述待測樣品不含禽流感 病毒。
[0032] 上述系統(tǒng)中，每20yLPCR反應體系可含有：所述PCR引物對H6(H6的每條引 物在反應體系中的終濃度均為0. 4yM)，所述探針H6-P(H6-P在反應體系中的終濃度為 0. 2yM)，所述PCR引物對N1(N1的每條引物在反應體系中的終濃度均為0. 2yM)，所述探針 Nl-P(N1-P在反應體系中的終濃度為0. 4yM)，2XPCR緩沖液10yL，MgCl2 (1%(：12在反應體 系中的終濃度為 0. 25mM)，dATP、dITP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物（dATP、dITP、dCTP和 dGTP在反應體系中的終濃度均為100yM)，Taq聚合酶（Taq聚合酶在反應體系中的終濃度 為0. 075U/yL)，濃度為10ng/yL的待測病毒核酸1yL，無菌蒸餾水補足20yL。
[0033] 上述系統(tǒng)中，所述I還包括記載有下述內(nèi)容的載體：在同一個PCR反應體系中，以 待測生物樣品的核酸（DNA或RNA或cDNA)為模板，用所述成套試劑進行熒光PCR;FAM通道 的結(jié)果呈陽性（即擴增曲線為S型曲線），所述待測樣品含有H6亞型禽流感病毒；FAM通道 的結(jié)果呈陰性（即擴增曲線為直線），所述待測樣品含有Hx(x辛6)亞型禽流感病毒或所述 待測樣品不含禽流感病毒。
[0034] 上述系統(tǒng)中，每20yLPCR反應體系可含有：所述PCR引物對H6(H6的每條引 物在反應體系中的終濃度均為0. 4yM)，所述的探針H6-P(H6-P在反應體系中的終濃度 為0.2 1^)，2父？〇?緩沖液10 1^，1%(：12(1%(：12在反應體系中的終濃度為0.251111)，（^丁？、 dTTP、dCTP和dGTP的dNTP的混合物（dATP、dTTP、dCTP和dGTP在反應體系中的終濃度均 為100yM)，Taq聚合酶（Taq聚合酶在反應體系中的終濃度為0. 075U/yL)，濃度為10ng/ yL的待測病毒核酸1yL，無菌蒸餾水補足20yL。
[0035] 上述系統(tǒng)中，所述J還包括記載有下述內(nèi)容的載體：在同一個PCR反應體系中，以 待測生物樣品的核酸ONA或RNA或cDNA)為模板，用所述成套試劑進行熒光PCR;R0X通道 的結(jié)果呈陽性（即擴增曲線為S型曲線），所述待測樣品含有N1亞型禽流感病毒；R0X通道 的結(jié)果呈陰性（即擴增曲線為直線），所述待測樣品含有Nx(x辛1)亞型禽流感病毒所述待 測樣品不含禽流感病毒。
[0036] 上述系統(tǒng)中，每20yLPCR反應體系可含有：所述PCR引物對N1(N1的每條引 物在反應體系中的終濃度均為0. 2yM)，所述探針Nl-P(N1-P在反應體系中的終濃度為 0? 4yM)，2XPCR緩沖液 10yL，MgCl2 (MgCl2在反應體系中的終濃度