一種咖啡因人工抗原的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種咖啡因人工抗原的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 咖啡因（caffeine)名稱1，3, 7-三甲基黃嘌呤，又稱咖啡堿，茶素，馬黛因，瓜拉納 因子。它是一種黃嘌呤生物堿化合物，可以作為殺蟲劑，對人而言適度的食用可以有祛除疲 勞，興奮神經(jīng)的作用，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復蘇。其結(jié)構(gòu)式為：
[0003]
【主權(quán)項】
1. 一種咖啡因人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 制備咖啡因人工半抗原： (a) 將3, 7-二甲基黃嘌呤與丁二酸酐以摩爾比為1:2加入圓底燒瓶中，用吡啶溶解， KKTC下回流攪拌反應16小時；反應結(jié)束后自然冷卻至室溫，轉(zhuǎn)干，經(jīng)薄層色譜分離得到白 色固體產(chǎn)物I ;薄層層析：層析液為95%乙醇：1，4-二氧六環(huán)：二氯甲烷：氨水=8:1 :10 :1，產(chǎn)物 Rf =0.4 ; (b) 將3-氨基二氫噻吩-2-酮鹽酸鹽與產(chǎn)物I以摩爾比為1:1加入圓底燒瓶中，加入 少量的吡啶，以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，再加入1. 15倍摩爾比的1-乙基-(3-二甲基氨 基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽，氮氣保護下，室溫攪拌反應1小時；反應結(jié)束后，將溶劑轉(zhuǎn)干，力口 入水和二氯甲烷萃取，收集水相，用飽和的碳酸鈉溶液調(diào)pH=7. 0,水相再用氯仿萃取，得到 的有機相經(jīng)無水硫酸鎂干燥，過濾，轉(zhuǎn)干，得到油狀物，油狀物經(jīng)二氯甲烷提取，轉(zhuǎn)干后得到 的殘渣用乙酸乙酯溶解，加入IMol/L含氯化氫的乙醚溶液得到白色懸浮液，過濾，得到的 濾渣經(jīng)干燥得產(chǎn)物II ;薄層層析：層析液為乙醇，產(chǎn)物Rf =0. 6 ; (c) 將產(chǎn)物II用體積比為N，N-二甲基甲酰胺：雙蒸水=7:3的混合溶劑溶解，加入適 量濃度為lmol/L的氫氧化鉀水溶液，在室溫下攪拌反應5分鐘，迅速加入磷酸鉀緩沖溶液， 再用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)pH=7. 0,溶液經(jīng)乙酸乙酯提取，得到含巰基的半抗原III ;薄層層 析：層析液為乙醇，產(chǎn)物Rf =〇. 3 ; 制備咖啡因人工抗原： (d) 將溴乙酸與N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳酰亞胺以摩爾比為I: I. I: I. 1溶于二 氯甲烷中，冰水浴中攪拌反應2小時，然后再轉(zhuǎn)至室溫繼續(xù)反應1小時；反應結(jié)束，過濾，將 濾液轉(zhuǎn)干，將得到的殘渣用體積比為二氯甲烷：石油醚=3:1的混合溶劑進行重結(jié)晶，得到 的固體IV在真空器皿中干燥，備用；薄層層析：層析液為95%乙醇，產(chǎn)物R f =0. 65 ; (e) 將固體IV配制成濃度為64mg/ml的N，N-二甲基甲酰胺溶液，記作A溶液；配制濃 度為20mg/ml的牛血清蛋白的PBS溶液，記作B溶液；將A液緩慢滴加到攪拌著的B液中， 室溫攪拌反應2小時；將混合溶液在PBS溶液中透析7次以上，將透析好的溶液經(jīng)離心后， 取上清液，得到的上清液用Lawry法測其濃度，并量其體積，記作C液，備用； (f) 將含巰基的半抗原III配置成濃度為25mg/ml的N，N-二甲基甲酰胺溶液，記作D 液； (g) 將D液緩慢滴入C液中，室溫下攪拌均勻，靜置3小時后，在4°C下，將混合液用PBS 溶液透析7次以上；離心后取上清液即得到咖啡因人工抗原：咖啡因-牛血清蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種咖啡因人工抗原的制備方法，第一步為半抗原的制備及檢測：以3,7-二甲基黃嘌呤與丁二酸酐為原料進行酰化反應，得到含羧基的中間體，該中間體與3-氨基二氫噻吩-2-酮進行?；磻螅?jīng)水解得到一含巰基的半抗原；第二步為人工抗原的制備與檢測：先將溴乙酸經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法活化后與牛血清蛋白（BSA）交聯(lián)，得到含溴代鏈烴的牛血清蛋白,與第一步得到含巰基的半抗原經(jīng)縮合反應制備得咖啡因人工抗原即咖啡因-牛血清蛋白。所制備的咖啡因人工抗原可進行動物免疫，取得相應的咖啡因抗體，可用于各種咖啡因類免疫分析法的研究，為咖啡因的檢測提供更加方便快速準確的途徑。
【IPC分類】C07K14-765
【公開號】CN104558153
【申請?zhí)枴緾N201410828150
【發(fā)明人】王鎮(zhèn), 高飛, 邵越水
【申請人】杭州奧泰生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月26日