一種抗蛇毒血清的制取工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種抗蛇毒血清的制取工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]抗蛇毒血清含有特異性抗體，具有中和相應(yīng)蛇毒的作用，用于蛇咬傷者的治療，世界上每年有500萬人被毒蛇咬傷，有5萬人因為沒有及時注射蛇毒血清死于非命。提取微量蛇毒，少量液體蛇毒(不足以致命的量)注入某動物體內(nèi)(如馬，牛等)，一段時期之后，動物體內(nèi)將會產(chǎn)生大量的抗蛇毒血清，然后將抗蛇毒血清從動物血液中提取出來，經(jīng)過加工以后就是抗蛇毒血清了，但這種方法獲得的抗蛇毒血清數(shù)量有限，而且純度較低，而采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，專門培養(yǎng)能夠產(chǎn)生抗蛇毒血清的B細(xì)胞，不但能夠獲得大量抗蛇毒血清，而且血清的純度高，治療效果明顯，被毒蛇咬傷后，及時注射抗蛇毒血清，能夠特異性進(jìn)行解毒，從而達(dá)到治療效果，申請?zhí)枮镃N202020279274.0公開了一種中國陸生常見蝰科蛇毒多價抗血清的制備方法及用法，涉及多價抗血清的制備及用法。本發(fā)明選擇達(dá)到一定效價水平的幾種蝰科毒蛇的特異性單價抗蛇毒血清F(ab) ’ 2，裝量成20ml/瓶注射劑，經(jīng)小鼠中和法檢測該血清能有效中和我國常見五種蝰科毒蛇的平均一次排毒量，包括尖吻蝮蛇毒80-220mg、或蝰蛇毒30-55mg或烙鐵頭蛇毒55_75mg或竹葉青蛇毒20_35mg或蝮蛇毒
20-35mg，可直接應(yīng)用于蛇傷重危患者，不需鑒定咬傷蛇種類，降低蝰科毒蛇傷致殘率和死亡率，但是蛇毒本身較為稀有，直接采用蛇毒制得的抗蛇毒血清，血清量少，成本高，不能批量化生產(chǎn)，而且該抗蛇毒血清沒有明顯的標(biāo)記基因一一熒光蛋白基因，不便于醫(yī)學(xué)診斷的進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服現(xiàn)有技術(shù)上的不足，本發(fā)明目的是提供一種抗蛇毒血清的制取工藝。
[0004]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005]一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟如下:
[0006](I)動物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒2?50 μ g加佐劑脾內(nèi)注射0.8?2ml ；3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內(nèi)注射，其劑量不宜超過0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內(nèi)注射，5?7天后采血測其效價；2?3周，加強(qiáng)免疫，蛇毒量50?500 μ g為宜，靜脈內(nèi)注射；3天后，取細(xì)胞融合；
[0007](2)制備免疫細(xì)胞:最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過細(xì)胞篩，離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗3次，制得脾淋巴細(xì)胞懸液，備用；
[0008](3)基因重組:運用DNA重組技術(shù)，將熒光蛋白基因重組到免疫細(xì)胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重組細(xì)胞，純化培養(yǎng)，取20-8重組細(xì)胞懸液備用；
[0009](4)制備骨髓細(xì)胞:從BALA/C純種小白鼠體內(nèi)提取骨髓細(xì)胞，體外培養(yǎng)，取對數(shù)生長骨髓細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗3次，計數(shù)，取得20-7細(xì)胞備用；
[0010](5)細(xì)胞融合:將骨髓細(xì)胞與重組細(xì)胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗2次，離心之后棄上清液，使細(xì)胞沉淀略松動，90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動，37°C水浴作用90s，而后加37°C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細(xì)胞；
[0011](6)選擇培養(yǎng):將制取的雜交細(xì)胞用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，雜交細(xì)胞布滿孔底2/20面積時，開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的目標(biāo)細(xì)胞；
[0012](7)后期培養(yǎng):將上述目標(biāo)細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加200 μ I，將培養(yǎng)板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0013]在一個優(yōu)選實例中，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
[0014]在一個優(yōu)選實例中，所述步驟(5)中，所述融合過程加入飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0015]在一個優(yōu)選實例中，所述步驟(7)中，所述96孔板數(shù)量為4塊。
[0016]有益效果:本發(fā)明通過動物的選擇與免疫、制備免疫細(xì)胞、基因重組、制備骨髓細(xì)胞、細(xì)胞融合、選擇培養(yǎng)和后期培養(yǎng)七大步驟完成抗蛇毒血清的制取工藝，具有的熒光蛋白基因，醫(yī)學(xué)用于診斷時，過程中有熒光出現(xiàn)，則反應(yīng)為陽性，便于診斷的進(jìn)行，本發(fā)明的細(xì)胞生長繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應(yīng)用，選用BALA/C純種小白鼠，易于飼養(yǎng)，同種細(xì)胞具有很高的雜交融合率，抗體細(xì)胞產(chǎn)生過程中，加入的佐劑，使抗蛇毒血清產(chǎn)生容易，縮短了制取時間，同時在細(xì)胞融合過程中加入的飼養(yǎng)細(xì)胞使細(xì)胞生產(chǎn)繁殖更快，大大縮短了抗蛇毒血清的制取周期，熒光蛋白基因提取技術(shù)成熟，DNA重組技術(shù)完善，因此本發(fā)明的抗蛇毒血清生產(chǎn)適于推廣應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0017]為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合【具體實施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0018]本實施例的一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟如下:
[0019](I)動物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒35 μ g加佐劑脾內(nèi)注射1.4ml ;3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內(nèi)注射，其劑量不宜超過0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內(nèi)注射，5天后采血測其效價；2周，加強(qiáng)免疫，蛇毒量350 y g為宜，靜脈內(nèi)注射；3天后，取細(xì)胞融合；
[0020](2)制備免疫細(xì)胞:最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過細(xì)胞篩，離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗3次，制得脾淋巴細(xì)胞懸液，備用；
[0021](3)基因重組:運用DNA重組技術(shù)，將熒光蛋白基因重組到免疫細(xì)胞分泌抗體的基因序列中，得到重組細(xì)胞，純化培養(yǎng)，取14重組細(xì)胞懸液備用；
[0022](4)制備骨髓細(xì)胞:從BALA/C純種小白鼠體內(nèi)提取骨髓細(xì)胞，體外培養(yǎng)，取對數(shù)生長骨髓細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗3次，計數(shù)，取得14細(xì)胞備用；
[0023](5)細(xì)胞融合:將骨髓細(xì)胞與重組細(xì)胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗2次，離心之后棄上清液，使細(xì)胞沉淀略松動，90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動，37°C水浴作用90s，而后加37°C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細(xì)胞；
[0024](6)選擇培養(yǎng):將制取的雜交細(xì)胞用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，雜交細(xì)胞布滿孔底2/20面積時，開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的目標(biāo)細(xì)胞；
[0025](7)后期培養(yǎng):將上述目標(biāo)細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加200 μ I，將培養(yǎng)板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0026]在一個優(yōu)選實例中，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
[0027]在一個優(yōu)選實例中，所述步驟(5)中，所述融合過程加入飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0028]在一個優(yōu)選實例中，所述步驟(7)中，所述96孔板數(shù)量為4塊。
[0029]實施例2:其余與所述實施例1相同，不同之處在于，步驟(2)中添加的佐劑為福氏不完全佐劑，本實施例中，成本較低，但是作用效果相對較低。
[0030]實施例3:其余與所述實施例1相同，不同之處在于，步驟(5)將骨髓細(xì)胞與重組細(xì)胞數(shù)量比例該為2: 5，本實施例中，重組細(xì)胞用量少，制取成本降低，且時間縮短，但融合效率變低。
[0031]經(jīng)實際應(yīng)用中可知，通過動物的選擇與免疫、制備免疫細(xì)胞、基因重組、制備骨髓細(xì)胞、細(xì)胞融合、選擇培養(yǎng)和后期培養(yǎng)七大步驟完成抗蛇毒血清的制取工藝，具有的熒光蛋白基因，醫(yī)學(xué)用于診斷時，過程中有熒光出現(xiàn)，則反應(yīng)為陽性，便于診斷的進(jìn)行，本發(fā)明的細(xì)胞生長繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應(yīng)用，選用BALA/C純種小白鼠，易于飼養(yǎng)，同種細(xì)胞具有很高的雜交融合率，抗體細(xì)胞產(chǎn)生過程中，加入的佐劑，使抗蛇毒血清產(chǎn)生容易，縮短了制取時間，同時在細(xì)胞融合過程中加入的飼養(yǎng)細(xì)胞使細(xì)胞生產(chǎn)繁殖更快，大大縮短了抗蛇毒血清的制取周期，熒光蛋白基因提取技術(shù)成熟，DNA重組技術(shù)完善，因此本發(fā)明的抗蛇毒血清生產(chǎn)適于推廣應(yīng)用。
[0032]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，其工藝步驟如下: (1)動物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒2?50μ g加佐劑脾內(nèi)注射0.8?2ml ;3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內(nèi)注射，其劑量不宜超過0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內(nèi)注射，5?7天后采血測其效價；2?3周，加強(qiáng)免疫，蛇毒量50?500 μ g為宜，靜脈內(nèi)注射；3天后，取細(xì)胞融合； (2)制備免疫細(xì)胞:最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過細(xì)胞篩，離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗3次，制得脾淋巴細(xì)胞懸液，備用； (3)基因重組:運用DNA重組技術(shù)，將熒光蛋白基因重組到免疫細(xì)胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重組細(xì)胞，純化培養(yǎng)，取20-8重組細(xì)胞懸液備用； (4)制備骨髓細(xì)胞:從BALA/C純種小白鼠體內(nèi)提取骨髓細(xì)胞，體外培養(yǎng)，取對數(shù)生長骨髓細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗3次，計數(shù)，取得20-7細(xì)胞備用； (5)細(xì)胞融合:將骨髓細(xì)胞與重組細(xì)胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗2次，離心之后棄上清液，使細(xì)胞沉淀略松動，90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動，37°C水浴作用90s，而后加37°C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細(xì)胞； (6)選擇培養(yǎng):將制取的雜交細(xì)胞用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，雜交細(xì)胞布滿孔底2/20面積時，開始檢測抗蛇毒血清，篩選出所需要的目標(biāo)細(xì)胞； (7)后期培養(yǎng):將上述目標(biāo)細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加200μ 1，將培養(yǎng)板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(5)中，所述融合過程加入飼養(yǎng)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(7)中，所述96孔板數(shù)量為4塊。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟為：(1)動物的選擇與免疫；(2)制備免疫細(xì)胞；(3)基因重組：運用DNA重組技術(shù)，將熒光蛋白基因重組到免疫細(xì)胞分泌抗體的基因序列中，得到重組細(xì)胞，純化培養(yǎng)，取20-8重組細(xì)胞懸液備用；(4)制備骨髓細(xì)胞；(5)細(xì)胞融合；(6)選擇培養(yǎng)；(7)后期培養(yǎng)，本發(fā)明的抗蛇毒血清中具有明顯的標(biāo)記基因——熒光蛋白基因，醫(yī)學(xué)用于診斷時，過程中有熒光出現(xiàn)，則反應(yīng)為陽性，便于診斷的進(jìn)行，本發(fā)明的細(xì)胞生長繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C07K16-18, C12N15-06
【公開號】CN104558170
【申請?zhí)枴緾N201410808069
【發(fā)明人】崔強(qiáng)軍, 張政, 劉新亮, 余煉
【申請人】廣西大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月22日