一種單酶催化植物油制備天然香料的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明生物香料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種通過單酶一步催化植物油的水解物制 備短鏈烯醛類天然香料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然植物油料在我國作為一種來源豐富的可再生的生物資源，有著重要的開發(fā)使 用前景，但目前僅經(jīng)過簡單處理就直接出口國外市場，進(jìn)一步開發(fā)利用的力度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，附 加值與利潤率較低，深加工技術(shù)十分落后，環(huán)境污染和資源浪費(fèi)十分嚴(yán)重，亟待進(jìn)一步研究 與開發(fā)。對這部分油料進(jìn)行加工，使之能夠生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品，變廢為寶。在現(xiàn)代生活 中，除了從天然物中提取香料外，還開發(fā)了其他途徑進(jìn)行香料的制成和提取，如有機(jī)合成的 方法、酶催化法等。由于人們對綠色化學(xué)品的要求日漸提高，使得化學(xué)合成法在食品風(fēng)味料 生產(chǎn)中采用減少，而利用生物催化合成風(fēng)味物質(zhì)成為一條新興路線。如Whitehead等人利 用大豆脂肪氧合酶結(jié)合植物氫過氧化物裂解酶形成了一條生產(chǎn)天然清香味化合物的工藝， 利用該法可得到卜己醇、順-3-己烯-1-醇等。Noordermeer等以水解紅花油、亞麻籽油為 原料，利用脂肪氧合酶和氫過氧化物裂解酶生產(chǎn)六碳和九碳醛類物質(zhì)；Cass等人設(shè)計(jì)一種 中空纖維反應(yīng)器進(jìn)行番茄風(fēng)味物質(zhì)的生產(chǎn)。
[0003] 由于酶法催化的環(huán)保性和安全性，現(xiàn)已越來越多被開發(fā)使用。但是，目前都是使用 雙酶聯(lián)用或者粗酶提取物方法進(jìn)行，同時(shí)帶來了酶反應(yīng)體系不好控制、產(chǎn)物得率有所降低 等不良現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種單酶催化植物油制備天然香料的方法，具 有工藝簡單易操作、成本低、生產(chǎn)高效快速的特點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種單酶催化植物油制備天然香 料的方法，其特征在于包括以下步驟：
[0006] a、先將植物油進(jìn)行水解，得到濃度為50?500mg/mL的植物油水解產(chǎn)物；
[0007] b、取上述2. 5?25uL植物油水解產(chǎn)物加入到0· 25?2. 5mL濃度為20?30mg/L 的雙功能酶蛋白溶液中，混勻后在18?22°C下震蕩反應(yīng)0. 5?2. 5h ;
[0008] c、在上述反應(yīng)液中加入0. 25?2. 5mL乙醚，4?KTC避光震搖萃取50?70min， 收集上層有機(jī)相；并在下層相中再加入乙醚重復(fù)抽提1?3次，后合并上層有機(jī)相，并加入 1?5g無水硫酸鎂充分干燥；
[0009] d、將得到的有機(jī)溶劑相進(jìn)行10?20°C低溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮獲得天然香料。
[0010] 作為改進(jìn)，所述步驟a)的植物油水解的具體過程為：取100?500mg植物油，力口 2?5mL含5?7%(wt)K0H的甲醇水溶液，充氮?dú)??2min后55?65°C水浴1. 5?2. 5h ; 冷卻，加1:0.9?1.1(>/￥)的]^1水溶液調(diào)節(jié)。!1至小于1;再加2?51]11^1:3?5(>八） 的氯仿/正己燒混合液抽提，3?5°C，9000?11000rpm/min離心4?6min，取上層有機(jī)相， 余下混合液再重復(fù)抽提1?3次，合并有機(jī)相，氮?dú)獯蹈珊笥肐mL色譜甲醇定容。
[0011] 上述甲醇水溶液的體積比為3?5 :1。
[0012] 作為優(yōu)選，所述步驟b)中的雙功能酶蛋白溶液為一種具有氫過氧化物裂解功能的 脂氧合酶PhLOX。脂氧合酶PhLOX的cDNA，它的核苷酸序列如SEQIDN0. 1所述。它的氨基 酸序列如SEQIDN0. 2所述。
[0013] 作為改進(jìn)，所述步驟c)的乙醚萃取的具體過程為：在的酶反應(yīng)液中加1:0. 9?I. 1 (v/v)的乙醚震蕩混勻，3?5°C，9000?11000rpm/min離心4?6min，取上層有機(jī)相，余下 混合液再重復(fù)萃取1?3次，合并有機(jī)相，加1?5g無水硫酸鎂充分干燥。
[0014] 再改進(jìn)，所述步驟d)獲得的天然香料為C5、C6、C7、C8、C9-烯醛類化合物。
[0015] 最后，所述植物油為葵花籽、玉米油、芝麻油或者大豆油。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用植物油作為原料，原料來源豐富、成本 低；采用酶法一步制備天然C5、C6、C7、C8、C9-烯醛類香料，具有制備工藝簡單、易操作，同 時(shí)反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)效率高且快速，無有害物質(zhì)產(chǎn)生的特點(diǎn)，本發(fā)明為香料工業(yè)開辟一條 高效、快速生產(chǎn)烯醛類天然風(fēng)味香料的新途徑，并為食品添加劑工業(yè)和日化工業(yè)提供新的 物質(zhì)基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0018] 實(shí)施例1 :雙活性脂氧合酶蛋白PhLOX溶液的制備
[0019] 采用TakaraRNAisoPluskit (Takara，日本)，以trizol法提取壇紫菜葉狀體的總 RNA。采用 TakaraprimescriptRTreagentkit(Takara，日本)，對提取的壇紫菜葉狀體總 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到壇紫菜葉狀體總cDNA。以此cDNA為模板，用一對帶Nde I/Hind I I I酶 切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增PhLOX基因的完整0RF，引物序列如下：
[0020] 正向引物：5' GGAATTCCATATGATGGGGAATGCG3'
[0021] 反向引物：5' CCCAAGCTTCTAGATGTCGATGGACAG3'。
[0022] 克隆的目的片段首先連接到pMD-18T (Takara，日本）上形成L0X-18T的重組克 隆載體，通過轉(zhuǎn)化E.c〇liDH5a進(jìn)行測序，以檢測目的片段的編碼正確性。選擇pET_28a (Takara，日本）為表達(dá)載體，在每40μL體系中，取L0X-18T和pET-28a空載體各lμg并 各自用2"勺恥6 1/把11(1111(8丨〇1^8，英國）進(jìn)行雙酶切，371：孵育211以上。取54 1^ 酶切產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，待質(zhì)粒酶切完全后進(jìn)行割膠回收和定量。在每 20 μ L體系中，將回收的目的片段和表達(dá)載體按135ng/50ng的比例進(jìn)行連接，采用IU的T4 連接酶（Fermentas，美國）在4°C下連接過夜，以構(gòu)建重組質(zhì)粒L0X-28a。取所有連接液，與 100μ L感受態(tài)E. coliBL21(Takara，日本)快速混勻，冰中預(yù)冷30min，后42°C水浴熱激90s， 熱激后立即插在冰中，以構(gòu)建重組體系L0X-28a-BL21。冰浴5min后加入800 μ L、4°C預(yù)冷 的LB液體培養(yǎng)基，37°C下200r/min搖菌2h。后取100 μ L菌液均勻涂布在含50 μ g/mL卡 那霉素（Kana+)的LB固體平板上。平板倒扣放置在37°C下避光培養(yǎng)12h?16h，用10 μ L 無菌移液槍頭將肉眼可見的乳白色菌落挑取并溶解于20yL、含50μ g/mL卡那霉素的LB液 體培養(yǎng)基中。取1μ L該菌液作為模板，用上述帶Nde I/Hindi I I酶切位點(diǎn)的特異性引 物進(jìn)行PCR檢測，檢測程序同表1，PCR體系同表2。取5μ L該P(yáng)CR產(chǎn)物通過1. 5%瓊脂糖 凝膠電泳檢測其對應(yīng)菌液的真陽性，后將剩余19 μ L菌液轉(zhuǎn)移至5mL的LB+Kana+ (50 μ g/ mL)液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C、200r/min、12h。取ImL菌液送測序以確定重組載體的編 碼正確性，得到的真陽性克隆體LOX-28a-BL21。
[0023] 表IPhLOX的PCR檢測程序
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種單酶催化植物油制備天然香料的方法，其特征在于包括以下步驟： a、 先將植物油進(jìn)行水解，得到濃度為50?500mg/mL的植物油水解產(chǎn)物； b、 取上述2. 5?25uL植物油水解產(chǎn)物加入到0. 25?2. 5mL濃度為20?30mg/L的雙 功能酶蛋白溶液中，混勻后在18?22°C下震蕩反應(yīng)0. 5?2. 5h ; c、 在上述反應(yīng)液中加入0. 25?2. 5mL乙醚，4?KTC避光震搖萃取50?70min，收集 上層有機(jī)相；并在下層相中再加入乙醚重復(fù)抽提1?3次，后合并上層有機(jī)相，并加入1? 5g無水硫酸鎂充分干燥； d、 將得到的有機(jī)溶劑相進(jìn)行10?20°C低溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮獲得天然香料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟a)的植物油水解的具體過程 為：取100?500mg植物油，加2?5mL含5?7%(wt)KOH的甲醇水溶液，充氮?dú)??2min 后55?65°C水浴1. 5?2. 5h ;冷卻，加1:0. 9?I. I (v/v)的HCl水溶液調(diào)節(jié)pH至小于 1 ;再加2?5mLl:3?5 (v/v)的氯仿/正己燒混合液抽提，3?5°C，9000?IlOOOrpm/ min離心4?6min，取上層有機(jī)相，余下混合液再重復(fù)抽提1?3次，合并有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?后用ImL色譜甲醇定容。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述甲醇水溶液的體積比為3?5 :1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟b)中的雙功能酶蛋白溶液為一 種具有氫過氧化物裂解功能的脂氧合酶PhLOX。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟c)的乙醚萃取的具體過程為： 在的酶反應(yīng)液中加1:0. 9?I. I (v/v)的乙醚震蕩混勻，3?5°C，9000?11000rpm/min離 心4?6min，取上層有機(jī)相，余下混合液再重復(fù)萃取1?3次，合并有機(jī)相，加1?5g無水 硫酸鎂充分干燥。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟d)獲得的天然香料為C5、C6、 C7、C8、C9-烯醛類化合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物油為葵花籽、玉米油、芝麻油或 者大豆油。
【專利摘要】一種單酶催化植物油制備天然香料的方法，其特征在于步驟：a、植物油水解，得到濃度為50～500mg/mL的植物油水解產(chǎn)物；b、取上述2.5～25uL植物油水解產(chǎn)物加入到0.25～2.5mL濃度為20～30mg/L的雙功能酶蛋白溶液中，混勻后在18～22℃下震蕩反應(yīng)0.5～2.5h；c、在反應(yīng)液中加入0.25～2.5mL乙醚，3～5℃避光震搖萃取50～70min，收集上層有機(jī)相；下層相中再加入乙醚重復(fù)抽提1～3次，后合并上層有機(jī)相，并加入1～5g無水硫酸鎂充分干燥；d、將得到的有機(jī)溶劑相進(jìn)行低溫10～20℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮獲得天然香料。采用植物油作為原料，來源豐富；采用酶法一步制備天然C5、C6、C7、C8、C9-烯醛類香料，制備工藝簡單、易操作，同時(shí)反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)效率高，無有害物質(zhì)產(chǎn)生。
【IPC分類】C11B9-00
【公開號(hào)】CN104560390
【申請?zhí)枴緾N201310497257
【發(fā)明人】朱竹君, 陳海敏, 嚴(yán)小軍, 駱其君, 楊銳, 陳娟娟
【申請人】寧波大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月21日