一株產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及通過微生物學、分子生物學方法篩選得到一株產(chǎn)胞外多糖海水明串珠 乳酸菌，該菌株可用上海水魚飼料微生態(tài)制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌（Lactic acid bacteria)是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的細菌的通稱。 乳酸菌通常是不運動、不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，可在厭氧、兼性厭氧條件下生長。乳酸菌 通常耐酸，在pH為3. 0?4. 5時仍可生長，能耐受動物胃腸道的酸性環(huán)境，因此乳酸菌能在 恒溫動物和魚類胃腸道中廣泛分布。
[0003] 乳酸菌胞外多糖（Exopoly Saccharides,EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到 細胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物，有的依附于微生物細胞壁形成莢膜，稱為莢膜 多糖；有的進入培養(yǎng)基形成粘液，稱為粘液多糖，它們都是微生物適應環(huán)境的產(chǎn)物，乳酸菌 的胞外多糖具有免疫、抗腫瘤和抗?jié)兓钚裕哂袕V闊的應用價值。
[0004] 作為魚胃腸道固有菌群的組成部分，乳酸菌能定植于魚類消化道，大量占據(jù)腸壁 上的靶細胞，形成生物保護屏障，抑制病原菌對腸壁的定植，維持腸道正常的微生態(tài)平衡， 其產(chǎn)生的多糖能提高魚類自身的免疫力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及一株從海水魚腸道分離得到的海水明串珠乳酸菌，該菌株具有產(chǎn)胞外 多糖的能力，并對海水魚紅細胞、血紅素濃度有顯著增加的效果。
[0006] 本發(fā)明公開了從海水魚腸道篩選出產(chǎn)一種胞外多糖海水明串珠乳酸菌方法、該菌 的生物學特性、產(chǎn)胞外多糖的水平、作為微生態(tài)制劑應用的效果。
【附圖說明】
[0007] 圖1產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的多糖產(chǎn)生能力
【具體實施方式】
[0008] 1產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的篩選及鑒定
[0009] 1. 1產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的篩選
[0010] 無菌條件下對試驗魚進行活體解剖，取約4cm長的中腸段和幽門盲囊部用滅菌的 九鹽溶液沖洗并研磨，分離上清液均勻涂布到海水MRS平板培養(yǎng)基，25°C厭氧培養(yǎng)直至長 出菌落；重復劃平板厭氧培養(yǎng)，分離出單菌落。
[0011] 從黑鯛腸道分離得到呈乳白色，扁圓形凸狀，直徑1?3_的單菌落；分離菌株經(jīng) 革蘭氏染色后變紫色呈革蘭氏陽性，無鞭毛、無芽孢；在25°C下有氧條件下培養(yǎng)48h后也有 乳白色扁圓形凸狀菌落長出，可判斷為兼性厭氧菌；40°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，脫脂 乳試管出現(xiàn)凝固，無氣泡，PH呈酸性；乳酸發(fā)酵表明，分離株產(chǎn)生的乳酸經(jīng)H 2SO4和KMnO4處 理后能產(chǎn)生乙醛，使含氨的硝酸銀濾紙條中硝酸鹽溶液還原成金屬銀而變黑色。根據(jù)以上 結(jié)果初步確定分離株具有乳酸菌特征。
[0012] 1. 2產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的形態(tài)特征鑒定
[0013] 單菌落培養(yǎng)24h進行革蘭氏染色，觀察革蘭氏染色結(jié)果和菌株菌體形態(tài)；分別進 行產(chǎn)酸試驗、耐氧試驗、試管凝固試驗、發(fā)酵檢測，并進行乳酸菌的生化鑒定。
[0014] 對分離菌株進行微量生化反應管鑒定顯示，對葡萄糖、蔗糖、甘露醇、七葉苷、山梨 醇、甘露醇、麥芽糖、水楊苷、纖維二糖反應陽性，對還原性硝酸鹽、精氨酸雙水解酶、和明膠 液化液陰性，生化鑒定結(jié)果與伯杰氏細菌鑒定手冊對比表明，分離株符合乳酸菌的生化反 應特性。
[0015] 1. 3產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的16S rDNA基因鑒定
[0016] 分離株 25°C厭氧培養(yǎng) 24h 提取基因組 DNA，引物 27F(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）、1541R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）克隆 16S rDNA 基因，純化后送大連寶生生物 技術(shù)有限公司測序；序列同源性與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比較，采用DNASTAR軟件進行系統(tǒng)進 化分析。
[0017] 將分離株的16S rDNA基因序列在GenBank中進行同源性比較顯示，與分離株同源 性超過98%的18條序列中，有16條屬于腸膜明串珠乳酸菌屬（Leuconostoc strain)。16S rDNA基因系統(tǒng)進化分析表明，分離株與Leuconostoc citreum st in的同源性最高，大于 99%，故將分離株歸為腸膜明串珠乳酸菌。
[0018] 2產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的生物學特性
[0019] 2. 1酸、膽鹽、蛋白酶、溫度對產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌生長的影響
[0020] 2. I. IpH值對乳酸菌存活的影響
[0021] 用lmol/L HCI調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH值在1. 5至4. 5,以MRS液體培養(yǎng)基原液 (pH5. 5)為對照。28°C常規(guī)培養(yǎng)4h后培養(yǎng)后平板計數(shù)，結(jié)果表明凝乳乳酸球菌在p H > 2. 5 至5. 5之間時，存活數(shù)維持在106mL-l，該乳酸菌對p H > 2. 5酸性環(huán)境具有一定的耐受性， p H = 1. 5時，存活數(shù)為4. 3X105,說明該乳酸菌對酸有較好耐受性。
[0022] 2. 1. 2膽鹽對乳酸菌存活的影響
[0023] 試驗添加不同濃度膽鹽（0,1，2, 3和4g/L)，到pH值5. 5培養(yǎng)基，接種量為體積分 數(shù)的5%，28°C靜置培養(yǎng)Ih后，平極計數(shù)結(jié)果：膽鹽對凝乳乳酸球菌的存活有一定的影響， 在膽鹽質(zhì)量濃度為lg/L時，凝乳乳酸球菌的存活數(shù)均較高，為4. 2 X 106Π 1Γ1，經(jīng)1?4g/L的 膽鹽處理Ih后，凝乳乳酸球菌的存活數(shù)均在IO6Hir 1以上，說明凝乳乳酸球菌對膽鹽有一定 的耐受性。
[0024] 2. 1. 3蛋白酶對乳酸菌存活的影響
[0025] 實驗設(shè)4個不同質(zhì)量濃度的胃蛋白酶處理（分別為4,6,8和10g/L)，以不加蛋白 酶（〇g/L)的培養(yǎng)基（pH5. 5)為對照，各處理組培養(yǎng)基均用lmol/L的NaOH和HCI溶液調(diào) 節(jié)pH于對照組相同。向各處理組及對照組培養(yǎng)基中分別接種活化菌種，接種量為體積分 數(shù)的5%。28°C條件下靜置培養(yǎng)30min，取樣進行平板菌落計數(shù)。胃蛋白酶對凝乳乳酸球菌 的存活有一定的影響，經(jīng)4?10g/L的胃蛋白酶處理30min后，凝乳乳酸球菌的存活數(shù)均在 IO6Hir1以上，說明凝乳乳酸球菌對胃蛋白酶有一定的耐受性
[0026] 2. 1. 4溫度對乳酸菌存活的影響
[0027] 將活化的乳酸菌菌液按體積分數(shù)5 %接種于MRS液體培養(yǎng)基，取菌液分別在28 (對 照），40,60,80°C處理30min，取樣進行平板菌落計數(shù)。凝乳乳酸球菌活菌數(shù)隨著處理溫度 的升高而下降，70°C時，凝乳乳酸球菌存活數(shù)低于5. 0X IO4HiL'提示凝乳乳酸球菌對高溫 的耐受能力較差。
[0028] 2. 2產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌抑制病原菌的能力
[0029] 將分離株接種于裝有海水MRS液體培養(yǎng)基的厭氧試管25°C厭氧培養(yǎng)，于24、32、 40、48、56、64h各取出一管干燥稱重法測定菌體濃度，另一管離心（2000r/min，IOmin)后取 上清液通過管碟法進行抑菌試驗，測定抑菌圈直徑。分離株培養(yǎng)24、32、40、48、56、64h的上 清夜，對三種致病性弧菌的抑制作用明顯（表1);但進入穩(wěn)定生長期（24-56h)后（菌體濃 度為I. 12-1. 23g/L)，對哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的抑菌圈直徑在I. 14-1. 22cm 之間，不同時間上清液的抑菌效果相互間沒有明顯變化（P>〇. 05)(表1)。
[0030] 表1不同培養(yǎng)時間的分離株上清液對致病性弧菌抑制效果
[0031]
【主權(quán)項】
1. 一株產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌，包括以下內(nèi)容： (1) 一株產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的生物學特性； (2) -株產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的多糖產(chǎn)生水平； (3) 以分離得到的產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌作為海水魚微生態(tài)制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的生物學特性，其特征在 于酸、膽鹽、蛋白酶及溫度對產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌生長的影響及產(chǎn)胞外多糖海水 明串珠乳酸菌對致病性弧菌的抑制效果。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的能力,其特 征在于在MRS海水培養(yǎng)基中培養(yǎng)后產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌能產(chǎn)生胞外多糖的水平。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以本產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌作為海水魚微生態(tài)制劑， 其特征在于產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖能促進紅細胞、血紅素濃度顯著增 加。
【專利摘要】乳酸菌(Lactic？acid？bacteria)是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的細菌的通稱。乳酸菌通常是不運動、不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，可在厭氧、兼性厭氧條件下生長。乳酸菌胞外多糖(Exopoly？Saccharides，EPS)是乳酸菌在生長代謝過和中分泌到細胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物，具有免疫、抗腫瘤和抗?jié)兓钚?。本發(fā)明從海水魚腸道篩選一種產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌，該菌株具有產(chǎn)胞外多糖的能力，
【發(fā)明內(nèi)容】
包括產(chǎn)胞外多糖海水明串珠乳酸菌的篩選及其生物學特性、產(chǎn)胞外多糖的水平以及以該菌為原料作為海水魚微生態(tài)制劑的應用。
【IPC分類】C12R1-01, C12P19-04, C12N1-20, A23K1-18
【公開號】CN104560761
【申請?zhí)枴緾N201310472935
【發(fā)明人】戴賢君, 章蔚, 朱平杰
【申請人】中國計量學院, 戴賢君, 章蔚
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月11日