一種脂肪干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，具體涉及一種脂肪干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人源脂肪干細(xì)胞（Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs)是近年來(lái)從人體脂肪組 織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。ADSCs不僅可以定向分化為脂肪、軟骨、 心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞；還可分泌多種促進(jìn)血管生成因子、凋亡因子等多種具有生物學(xué)活性 的細(xì)胞因子。此外，ADSCs還具有取材容易、獲取量大、供體取材時(shí)痛苦較少等優(yōu)點(diǎn)。目前 已被廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0003] 人源脂肪干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)卻一直是個(gè)難題?，F(xiàn)有技術(shù)方法中，都是在酶解 條件和培養(yǎng)條件上進(jìn)行改進(jìn)。但仍多采用機(jī)械法去除血管、單一酶消化法、使用裂解液裂解 紅細(xì)胞、采取流式分選干細(xì)胞等步驟，盡可能的獲得較純的ADSCs的細(xì)胞群；在培養(yǎng)時(shí)添加 青-鏈霉素等抗生素，雖然起到一定的抗菌作用，但也對(duì)細(xì)胞造成不同程度的毒害。整個(gè)脂 肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)過(guò)程操作紛繁蕪雜，耗時(shí)費(fèi)力、生產(chǎn)成本倍增。此外，經(jīng)實(shí)際操作后發(fā) 現(xiàn)效果并不是十分的理想，由于使用了較多的化學(xué)試劑，ADSCs在分離后活力較低、增殖速 度慢；且細(xì)胞形態(tài)變異較大。使用低濃度的、單一的酶液對(duì)脂肪組織進(jìn)行酶解，酶解不徹底 導(dǎo)致脂肪干細(xì)胞無(wú)法被充分釋放出來(lái)?？偟膩?lái)說(shuō)，ADSCs的分離和培養(yǎng)方法都不盡人意。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明針對(duì)實(shí)踐過(guò)程中出現(xiàn)的一些問(wèn)題，在相關(guān)環(huán) 節(jié)上做了一些改進(jìn)，經(jīng)過(guò)多次嘗試，形成了一個(gè)相對(duì)較完善，可操作性強(qiáng)且耗時(shí)短的人源脂 肪干細(xì)胞的消化分離體系和分離后細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的，旨在進(jìn)一步優(yōu)化酶解 方案，簡(jiǎn)化操作過(guò)程，分離出高活性、高純度的脂肪干細(xì)胞，還可進(jìn)一步適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。本 發(fā)明工藝簡(jiǎn)單高效，結(jié)果具有穩(wěn)定、可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明還創(chuàng)造性的使用了較高 濃度混合酶解液，不僅最大程度的提取出脂肪干細(xì)胞，同時(shí)還保證了脂肪干細(xì)胞的高活力。 最后，由于操作步驟極大簡(jiǎn)化，污染機(jī)率降低，在不使用青-鏈霉素的前提下，污染率仍為 0%〇
[0005] 本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0006] 一種脂肪干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0007] 1)抽取脂肪組織，清洗；
[0008] 2)在脂肪組織中加入等體積的I型膠原酶和胰蛋白酶的混合液體；其中混合液體 中I型膠原酶和胰蛋白酶的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為0.05%?0.3%和0.01%?0. 1%，充分混 勾后消化30?60min ;
[0009] 3)加入FBS，蓋上瓶蓋后封口搖勾，離心；離心后棄上清液；
[0010] 4)用含有FBS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀與含有FBS的DMEM的體積比為 1: 1，吹打均勻后形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液接種至含有FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中；
[0011] 5)把接種后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0012] 6)培養(yǎng)24?72h后，吸棄皿內(nèi)培養(yǎng)基，清洗后添加含有EGF和FBS的DMEM，轉(zhuǎn)移 細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0013] 優(yōu)選，步驟（2)所述消化是在37°C的恒溫氣浴搖床中進(jìn)行，搖速為100?250r/ min〇
[0014] 優(yōu)選，步驟⑶所述離心的轉(zhuǎn)速為1000?1500rpm，離心時(shí)間為3?lOmin。
[0015] 優(yōu)選，所述FBS的體積百分?jǐn)?shù)為10%，所述EGF的濃度為10ng/mL。
[0016] 優(yōu)選本發(fā)明最佳酶解方案：使用了等體積I型膠原酶和胰蛋白酶酶的混合酶液 (兩者質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為〇. 25%、0. 05% )，酶解時(shí)間為50min、搖速為200轉(zhuǎn)。
[0017] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0018] 1.本發(fā)明的所探索的酶解條件穩(wěn)定、高效，脂肪組織被徹底酶解，各成分細(xì)胞被最 大化的釋放出來(lái)；在不影響ADSCs的活性的前提下，單位脂肪體積所獲得的ADSCs的量相對(duì) 穩(wěn)定。
[0019] 2.本發(fā)明提供的方法簡(jiǎn)單、操作容易，對(duì)于儀器設(shè)備的要求不高，普通的超凈臺(tái)、 低速離心機(jī)和搖床即可滿足要求，更利于規(guī)?；a(chǎn)制備。
[0020] 3.本發(fā)明不使用紅細(xì)胞裂解液，避免了紅細(xì)胞裂解液殘留的問(wèn)題。
[0021] 4.效率高、耗時(shí)短、提取的細(xì)胞活力高，例如，采用0.075%的I型膠原酶、37°C、 IOOR的酶解條件，脂肪組織酶解不徹底，ADSCs損失較大；本發(fā)明采用I膠原酶和胰蛋白酶 的混合酶液，脂肪組織在短時(shí)間被徹底酶解、ADSCs的獲取率達(dá)到最大化。此外，分離出來(lái) 的ADSCs的活力高接種后的ADSCs在三天后即可生長(zhǎng)融合至80% -90%。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為脂肪干細(xì)胞接種Id后貼壁的情況；
[0023] 圖2為脂肪干細(xì)胞活力對(duì)比情況；
[0024] 圖3為脂肪干細(xì)胞形態(tài)對(duì)比圖；
[0025] 圖4為兩種酶解方案分離的脂肪干細(xì)胞成骨成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)對(duì)比。
【具體實(shí)施方式】 [0026] 實(shí)施例1
[0027] 1)靜置含有組織液的脂肪組織，待脂肪組織與液體自然分層后IOmL移液管吸棄 下方液體；用50mL注射器吸取等體積的PBS加入到脂肪組織中，蓋上瓶蓋后反復(fù)搖晃脂肪 組織，靜置5min ;用25mL移液管吸棄脂肪組織下方溶液（重復(fù)一次）。
[0028] 2) -次性移液管將脂肪組織均移至50mL離心管中；加入等體積I型膠原酶和胰 蛋白酶混合液（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)濃度分別為0. 25 %、0. 05% )，封口后上下顛倒瓶子搖晃，充分 混勻。轉(zhuǎn)移至37°C恒溫氣浴搖床中，200R消化50min
[0029] 3)每管加入lmLFBS，蓋上瓶蓋后封口搖勾，1500rpm/min，離心5min ;離心后棄上 清液。
[0030] 4)按照脂肪體積：10 % FBS的DMEM = 1:1的比例，用含有10 % FBS的DMEM重懸 ADSCs沉淀，吹打均勻后形成細(xì)胞懸液；將懸液接種至含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中。
[0031] 5)把接種后的ADSCs轉(zhuǎn)移至5% C02、37°C、飽和濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0032] 6)培養(yǎng)48h后，吸棄皿內(nèi)培養(yǎng)基，加入IOmL/皿PBS清洗（重復(fù)2次）。添加10% FBS的DMEM、10ng/mLEGF，轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0033] 實(shí)施例2
[0034] 1)靜置含有組織液的脂肪組織，待脂肪組織與液體自然分層后IOmL移液管吸棄 下方液體；用50mL注射器吸取等體積的PBS加入到脂肪組織中，蓋上瓶蓋后反復(fù)搖晃脂肪 組織，靜置5min ;用25mL移液管吸棄脂肪組織下方溶液（重復(fù)一次）。
[0035] 2) -次性移液管將脂肪組織均移至50mL離心管中；加入等體積I型膠原酶和胰 蛋白酶混合液（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)濃度分別為0.05%、0. 1%)，封口后上下顛倒瓶子搖晃，充分混 勻。轉(zhuǎn)移至37°C恒溫氣浴搖床中，100R消化30min
[0036] 3)每管加入lmLFBS，蓋上瓶蓋后封口搖勾，1000rpm/min，離心3min ;離心后棄上 清液。
[0037] 4)按照脂肪體積：10 % FBS的DMEM = 1:1的比例，用含有10 % FBS的DMEM重懸 ADSCs沉淀，吹打均勻后形成細(xì)胞懸液；將懸液接種至含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中。
[0038] 5)把接種后的ADSCs轉(zhuǎn)移至5% C02、37°C、飽和濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0039] 6)培養(yǎng)24h后，吸棄皿內(nèi)培養(yǎng)基，加入IOmL/皿PBS清洗（重復(fù)2次）。添加10% FBS的DMEM、10ng/mLEGF，轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0040] 實(shí)施例3
[0041] 1)靜置含有組織液的脂肪組織，待脂肪組織與液體自然分層后IOmL移液管吸棄 下方液體；用50mL注射器吸取等體積的PBS加入到脂肪組織中，蓋上瓶蓋后反復(fù)搖晃脂肪 組織，靜置5min ;用25mL移液管吸棄脂肪組織下方溶液（重復(fù)一次）。
[0042] 2) -次性移液管將脂肪組織均移至50mL離心管中；加入等體積I型膠原酶和胰 蛋白酶混合液（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)濃度分別為0. 3%、0. 01% )，封口后上下顛倒瓶子搖晃，充分混 勻。轉(zhuǎn)移至37°C恒溫氣浴搖床中，250R消化60min
[0043] 3)每管加入lmLFBS，蓋上瓶蓋后封口搖勾，1500rpm/min，離心IOmin ;離心后棄上 清液。
[0044] 4)按照脂肪體積：10 % FBS的DMEM = 1:1的比例，用含有10 % FBS的DMEM重懸 ADSCs沉淀，吹打均勻后形成細(xì)胞懸液；將懸液接種至含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中。
[0045] 5)把接種后的ADSCs轉(zhuǎn)移至5% C02、37°C、飽和濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0046] 6)培養(yǎng)7此后，吸棄皿內(nèi)培養(yǎng)基，加入IOmL/皿PBS清洗（重復(fù)2次）。添加10% FBS的DMEM、10ng/mLEGF，轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0047] 對(duì)照例1
[0048] 其余條件相同，采用0. 075%的I型膠原酶替代實(shí)施例1中I型膠原酶和胰蛋白酶 的混合液。
[0049] 表 1
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種脂肪干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 獲得脂肪組織，清洗； 2) 在脂肪組織中加入等體積的I型膠原酶和胰蛋白酶的混合液體；其中混合液體中I 型膠原酶和胰蛋白酶的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為〇. 05%?0. 3%和0. 01%?0. 1%，充分混勻后 消化30?60min ; 3) 加入FBS，蓋上瓶蓋后封口搖勻，離心；離心后棄上清液； 4) 用含有FBS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀與含有FBS的DMEM的體積比為1: 1，吹 打均勻后形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液接種至含有FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中； 5) 把接種后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 6) 培養(yǎng)24?72h后，吸棄皿內(nèi)培養(yǎng)基，清洗后添加含有EGF和FBS的DMEM，轉(zhuǎn)移細(xì)胞 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（2)所述消化是在 37°C的恒溫氣浴搖床中進(jìn)行，搖速為100?250r/min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（3)所述離心的轉(zhuǎn)速為 1000?1500rpm，離心時(shí)間為3?lOmin。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述FBS的體積百分?jǐn)?shù)為 10%，所述EGF的濃度為10ng/mL。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：1)洗滌脂肪組織；2)在脂肪組織中加入等體積的I型膠原酶和胰蛋白酶的混合液體；3)加入FBS，蓋上瓶蓋后封口搖勻，離心；離心后棄上清液；4)用含有FBS的DMEM重懸沉淀，沉淀與含有FBS的DMEM的體積比為1:1，吹打均勻后形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)基中；5)把接種后的培養(yǎng)基培養(yǎng)；6)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明的所探索的酶解條件穩(wěn)定、高效，脂肪組織被徹底酶解，各成分細(xì)胞被最大化的釋放出來(lái)；在不影響ADSCs的活性的前提下，單位脂肪體積所獲得的ADSCs的量相對(duì)穩(wěn)定。
【IPC分類】C12N5-0775
【公開號(hào)】CN104560868
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410710108
【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 盧瑞珊, 馬巖巖, 王小燕
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年11月27日