Elisa法捕獲針對呼吸道合胞病毒記憶性B細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種Elisa捕獲針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬副黏病毒科肺炎屬，是冬春季嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病原體，特別是2至6個月小嬰兒，免疫功能缺陷的成年人及老年人也是RSV的易感人群，RSV感染后常發(fā)生嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎和肺炎，全球范圍內(nèi)每年有1%。?5%。的患兒住卩元治療RSV，病人病死率為1%。?3%。。因此快速而全面地診斷并高效治療RSV感染者勢在必行。
[0003]目前針對于RSV感染者的快速檢測技術(shù)的改進(jìn)，以及針對RSV疫苗和抗體的研宄成為了熱點，呼吸道荷包病毒感染者的傳統(tǒng)檢測方法是檢測病人血清中的RSV抗體，但這只能檢測急性感染者以及最近感染的已康復(fù)者，并不能全面監(jiān)測出具有RSV感染史者；此夕卜，目前針對RSV的抗體研宄已經(jīng)從針對RSV的記憶性B細(xì)胞進(jìn)行研宄，但通常的方法都是將分離到的人外周血單核細(xì)胞進(jìn)行再分離，得到記憶性B細(xì)胞庫后，再進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)一段時間，篩選出能特異性分泌RSV抗體的漿細(xì)胞，從而間接地識別出針對人呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞。許多研宄表明，具有RSV感染史者擁有長期存在于體內(nèi)的針對人呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞，該細(xì)胞表面一般都具有IgM和IgD。所以，可利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，特異性地將針對人呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞結(jié)合在包被有呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD的Elisa板上，從而將針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞從人外周血單核細(xì)胞中分離出來。因此，本研宄能應(yīng)用于針對RSV感染史者的全面監(jiān)測，以及為針對RSV抗體的研宄提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有監(jiān)測RSV感染史者和研宄RSV抗體制備方法的不足，提供一種Elisa捕獲針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞的制備方法。
[0005]本發(fā)明是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，將人外周血單核細(xì)胞中的針對人呼吸道荷包病毒的記憶性B細(xì)胞，特異性地結(jié)合在包被有呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD的Elisa板上，從而將針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞從人外周血單核細(xì)胞中分離出來。
[0006]本發(fā)明所述制備方法包括下列步驟:
1、呼吸道合胞病毒抗原蛋白的包被:將呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD分別按10ng/孔，每孔100 μ L包被Elisa板，4°C過夜；
2、人外周血單核細(xì)胞的分離:將采集的新鮮抗凝血與生理鹽水1:1稀釋后，緩慢加入到等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，離心速度2000rpm，離心20min，；將其拿出，并吸取第二層乳白色云霧狀的人外周血單核細(xì)胞層于裝有生理鹽水的15mL離心管中洗滌，離心速度1500rpm,離心5min，棄上清，再用生理鹽水洗滌I次，將收集到的細(xì)胞用10% FBS的1640培養(yǎng)基重懸于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中； 3、Elisa法捕獲針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞:將過夜包被的Elisa板用含
0.05% Tween20的PBS清洗5次;再按200 μ L/孔加入5%的脫脂奶，37°C封閉2h，洗板5遍；最后按50 μ L/孔加入上述分離的人外周血單核細(xì)胞，37°C放置lh，洗板5遍；顯微鏡下觀察到的細(xì)胞即為Elisa法捕獲的針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明的有益效果:采用特異性抗原與抗體相結(jié)合的理論，通過包被有人呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD的Elisa板，特異性地結(jié)合針對人呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞表面的IgM和IgD，從而從人外周血單核細(xì)胞中快速地捕獲針對人呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點是:Elisa捕獲針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞的方法操作簡單，分離快速、高效，能夠大量節(jié)省人力物力財力，適用于針對任何病毒的記憶性B細(xì)胞的快速分離，此外，也可全面監(jiān)測RSV感染者。
【具體實施方式】
[0008]本發(fā)明所述制備方法包括下列步驟:
1、呼吸道合胞病毒抗原蛋白的包被:將呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD分別按10ng/孔，每孔100 μ L包被Elisa板，4°C過夜；
2、人外周血單核細(xì)胞的分離:將采集的新鮮抗凝血與生理鹽水1:1稀釋后，緩慢加入到等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，離心速度2000rpm，離心20min，；將其拿出，并吸取第二層乳白色云霧狀的人外周血單核細(xì)胞層于裝有生理鹽水的15mL離心管中洗滌，離心速度1500rpm,離心5min，棄上清，再用生理鹽水洗滌I次，將收集到的細(xì)胞用10% FBS的1640培養(yǎng)基重懸于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；
3、Elisa法捕獲針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞:將過夜包被的Elisa板用含
0.05% Tween20的PBS清洗5次;再按200 μ L/孔加入5%的脫脂奶，37°C封閉2h，洗板5遍；最后按50 μ L/孔加入上述分離的人外周血單核細(xì)胞，37°C放置lh，洗板5遍；顯微鏡下觀察到的細(xì)胞即為Elisa法捕獲的針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞。
【主權(quán)項】
1.Elisa法捕獲針對呼吸道合胞病毒記憶性B細(xì)胞的方法，其特征是: A、呼吸道合胞病毒抗原蛋白的包被:將呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD分別按10ng/孔，每孔100 μ L包被Elisa板，4°C過夜； B、人外周血單核細(xì)胞的分離:將采集的新鮮抗凝血與生理鹽水1:1稀釋后，緩慢加入到等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，離心速度2000rpm，離心20min，；將其拿出，并吸取第二層乳白色云霧狀的人外周血單核細(xì)胞層于裝有生理鹽水的15mL離心管中洗滌，離心速度1500rpm,離心5min，棄上清，再用生理鹽水洗滌I次，將收集到的細(xì)胞用10% FBS的1640培養(yǎng)基重懸于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中； C、Elisa法捕獲針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞:將過夜包被的Elisa板用含.0.05% Tween20的PBS清洗5次;再按200 μ L/孔加入5%的脫脂奶，37°C封閉2h，洗板5遍；最后按50 μ L/孔加入上述分離的人外周血單核細(xì)胞，37°C放置lh，洗板5遍；顯微鏡下觀察到的細(xì)胞即為Elisa法捕獲的針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞。
【專利摘要】Elisa法捕獲針對呼吸道合胞病毒記憶性B細(xì)胞的方法，是采用特異性抗原與抗體相結(jié)合的理論，通過呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD包被Elisa板，然后將分離得到的人外周血單核細(xì)胞加入到已經(jīng)封閉清洗后的Elisa板中，由于人外周血單核細(xì)胞中的針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞表面有IgM和IgD,包被在Elisa板上的呼吸道合胞病毒抗原蛋白GD和FD能特異地結(jié)合IgM和IgD，從而將針對呼吸道合胞病毒的記憶性B細(xì)胞從人外周血單核細(xì)胞中分離出來。本發(fā)明所述方法操作簡單，分離快速、高效，能夠大量節(jié)省人力物力財力，適用于針對任何病毒的記憶性B細(xì)胞的快速分離，此外，也可全面監(jiān)測RSV感染者。
【IPC分類】C12N5-0781, G01N33-53
【公開號】CN104560874
【申請?zhí)枴緾N201410726538
【發(fā)明人】陳廷濤, 魏強(qiáng), 辛洪波, 鄧侃, 胡萍
【申請人】南昌大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月4日