一種表達內(nèi)切葡聚糖酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從一種超嗜熱古菌即掘越氏火球菌Pyrococcus horikoshii中通過PCR擴增得到內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶基因，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進行表達。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，在現(xiàn)有的紡織應(yīng)用領(lǐng)域(例如織物處理、洗滌、柔化、人造絲加工)中，使用傳統(tǒng)的混合型纖維素酶制劑，會對纖維主體結(jié)構(gòu)造成不必要的損傷。由于織物處理及生物拋光是一個高溫處理過程，而現(xiàn)有酶制劑的處理溫度低于處理工藝的其他步驟，在實際使用的過程中需要增加降溫和升溫的過程，增加了工藝的復(fù)雜程度和生產(chǎn)成本，如能開發(fā)出嗜熱且具有單一內(nèi)切纖維素酶活性的極端酶制劑，將能更適合用于紡織行業(yè)降解天然結(jié)晶纖維素過程，有助于現(xiàn)有工藝的優(yōu)化和節(jié)能減排。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種表達內(nèi)切葡聚糖酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法。通過PCR擴增得到掘越氏火球菌中已知具有水解結(jié)晶纖維素的能力的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因，構(gòu)建了一株可高產(chǎn)可溶性表達內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的重組大腸桿菌，以實現(xiàn)極端耐熱酶制劑國產(chǎn)化的目的。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案:掘越氏火球菌A horikoshii (美國菌種保藏中心編號為ATCC700860)中的內(nèi)切-β_1, 4-葡聚糖酶基因SEQ ID N0.1。
[0005]表達內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，從掘越氏火球菌Ahorikoshii (美國菌種保藏中心編號為ATCC700860)中提取基因組DNA作為模板，進行PCR擴增，引物:
phEG-SG-C-F: 5 , -CAGCAGATCATATGGAAAATACAACATATCAAACACCG-3 ,phEG-SG-C-R: 5 ^ -CTCTAAGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAACTATC-3 ^
Mut-SD-F: 5 z -CGCTTGGTGGGGTGGTAATCTAATG-3 ^
Mut-SD-R: 5 z -CATTAGATTACCACCCCACCAAGCG-3 ^
PCR擴增體系:在0.5ml PCR管仲按順序加入以下試劑:10X PCR緩沖液5 μ? ； dNTPs混合物(每種 2.5mM) Iμ? ；10 μΜ phEG-SG-C-F ?μ? ；10 μΜ phEG-SG-C-R ?μ? ;基因組 DNA ?μ? ；Vent DNA 聚合酶 0.5μ? ;無菌水 40.5 μ? ；
PCR擴增條件:95°C預(yù)變性3min ;95°C變性30 s、55°C退火30 s、72 °C延伸72 s，30個循環(huán)；最后72°C延伸5min; 12°C保溫，獲得內(nèi)切-β _1，4-葡聚糖酶基因SEQ ID No:1 ；
以 phll71-sgc 為模板，分別采用 phEG-SG-C-F、Mut-SD-R 和 Mut-SD-F、phEG_SG_C-R 獲得不包含類SD序列的phll71-sgc的兩個部分，之后采用拼接PCR，獲得了不包含SD序列的內(nèi)切4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut_sd, SEQ ID No:2,該片段經(jīng)Nde I和NotI雙酶切后連入大腸桿菌表達載體pET21a中，獲得重組載體pET21-phll71-Sgc-mut-Sd，轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌株疋coli BL21 (DE3) plys得到重組菌疋coli BL21 (DE3)plys-pET21a-phll71-sgc-mut_sd0
[0006]phll71-sgc-mut-sd的誘導(dǎo)表達:表達條件為37°C，200 r/min, LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種時加入終濃度為100 Pg/mL的氨芐青霉素，培養(yǎng)至OD600 = 0.6，再加入IPTG至終濃度0.1mM誘導(dǎo)表達3 h。中間分別于誘導(dǎo)后1.5 h及3 h取樣。4167 r/min離心收集菌體,超聲波破碎(條件:總時間2 min，開2 S，關(guān)2 S，功率50%，冰浴)，取樣80 PL作為全蛋白樣品，余樣再于12000 r/min，4°C條件離心lOmin，再取80 PL上清作為破菌上清，分別加入20 μ?5XSDS PAGE上樣緩沖液后加熱處理，12% SDS-PAGE電泳分析得出結(jié)果。
[0007]phll71-sgc-mut-sd的純化及最適反應(yīng)溫度測定:上述菌體經(jīng)超聲破碎后直接置于75°C加熱30 min,并于12000 r/min, 4 °C條件下離心30 min后，分別取其上清及沉淀制備電泳樣，采取12% SDS-PAGE電泳分析。然后，再采用加熱離心后的上清作為粗酶液，蛋白含量經(jīng)Bradford法測定標準化后，以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作為水解底物，采用 ρΗ5.6，10mM 醋酸緩沖液，分別于 75°C，80°C，85°C，90°C，95°C，100°C條件下反應(yīng) 30min,使用DNS法檢測反應(yīng)產(chǎn)物，根據(jù)檢測結(jié)果確定其最適反應(yīng)溫度。
[0008]
【附圖說明】
[0009]圖1 重組載體 pET21-phll71-sgc-mut_sd 的物理圖譜。
[0010]圖2熱處理后重組菌表達內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶的SDS-PAGE分析。1.全蛋白的誘導(dǎo)表達；2.75°C熱處理后上清液的誘導(dǎo)表達；3.75°C熱處理后沉淀的誘導(dǎo)表達；M.蛋白質(zhì)分子量標準。
[0011]圖3內(nèi)切-β-l, 4_匍聚糖酶的最適反應(yīng)溫度。
【具體實施方式】
[0012]實施例1內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶基因phll71-Sgc-mut-Sd的獲得和改造
從掘越氏火球菌A horikoshii (美國菌種保藏中心編號為ATCC700860)中提取基因組DNA作為模板，進行PCR擴增，引物:
phEG-SG-C-F: 5 , -CAGCAGATCATATGGAAAATACAACATATCAAACACCG-3 ,phEG-SG-C-R: 5 ^ -CTCTAAGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAACTATC-3 ^
Mut-SD-F: 5 z -CGCTTGGTGGGGTGGTAATCTAATG-3 ^
Mut-SD-R: 5 z -CATTAGATTACCACCCCACCAAGCG-3 ^
PCR擴增體系:在0.5ml PCR管仲按順序加入以下試劑:10X PCR緩沖液5 μ? ； dNTPs混合物(每種 2.5mM) Iμ? ；10 μΜ phEG-SG-C-F ?μ? ；10 μΜ phEG-SG-C-R ?μ? ;基因組 DNA ?μ? ；Vent DNA 聚合酶 0.5μ? ;無菌水 40.5 μ? ；
PCR擴增條件:95°C預(yù)變性3min ;95°C變性30 s、55°C退火30 s、72 °C延伸72 s，30個循環(huán)；最后72°C延伸5min; 12°C保溫，獲得內(nèi)切-β _1，4-葡聚糖酶基因SEQ ID No:1 ；
以 phi 171-sgc 為模板，分別采用 phEG-SG-C-F、Mut-SD-R 和 Mut-SD-F、phEG_SG_C-R 獲得不包含類SD序列的phll71-sgc的兩個部分，之后采用拼接PCR，獲得了不包含SD序列的內(nèi)切4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut_sd, SEQ ID No:2,該片段經(jīng)Nde I和NotI雙酶切后連入大腸桿菌表達載體pET21a中，獲得重組載體pET21-phll71-Sgc-mut-Sd，轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌株疋coli BL21 (DE3) plys得到重組菌疋coli BL21 (DE3)plys-pET21a-phll71-sgc-mut_sd0
[0013]實施例2
內(nèi)切_β -1, 4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut-sd的表達
表達條件為37°C，200 r/min, LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種時加入終濃度為100 Pg/mL的氨芐青霉素，培養(yǎng)至OD600=Q.6，再加入IPTG至終濃度0.1 mM誘導(dǎo)表達3 h。中間分別于誘導(dǎo)后
1.5 h及3 h取樣。4167 r/min離心收集菌體,超聲波破碎(條件:總時間2 min,開2 s,關(guān)2 S，功率50%，冰浴)，取樣80 μ?作為全蛋白樣品，余樣再于12000 r/min,4 °〇條件離心10min，再取80 PL上清作為破菌上清，分別加入20 μ? 5 X SDS PAGE上樣緩沖液后加熱處理，12% SDS-PAGE電泳分析得出結(jié)果。
[0014]實施例3
內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut-sd的純化和最適溫度測定上述菌體經(jīng)超聲破碎后直接置于75°C加熱30 min，并于12000 r/min, 4 °C條件下離心30 min后，分別取其上清及沉淀制備電泳樣，采取12% SDS-PAGE電泳分析。然后，再采用加熱離心后的上清作為粗酶液，蛋白含量經(jīng)Bradford法測定標準化后，以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作為水解底物，采用ρΗ5.6，100 mM醋酸緩沖液，分別于75°C，80°C，85°C，90°C，95°C，100°C條件下反應(yīng)30 min,使用DNS法檢測反應(yīng)產(chǎn)物，根據(jù)檢測結(jié)果確定其最適反應(yīng)溫度。
[0015]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種表達內(nèi)切葡聚糖酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征是從超嗜熱古菌即掘越氏火球菌Pyrococcus horikoshii (美國菌種保藏中心編號為ATCC700860)中提取基因組DNA為模板，進行PCR擴增，引物:phEG-SG-C-F: 5 ^ -CAGCAGATCATATGGAAAATACAACATATCAAACACCG-3 ^phEG-SG-C-R: 5 ^ -CTCTAAGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAACTATC-3 ^Mut-SD-F: 5 z -CGCTTGGTGGGGTGGTAATCTAATG-3 ^Mut-SD-R: 5 z -CATTAGATTACCACCCCACCAAGCG-3 ^ PCR擴增體系:在0.5ml PCR管仲按順序加入以下試劑:10X PCR緩沖液5 μ? ； dNTPs混合物(每種 2.5mM) Iμ? ；10 μΜ phEG-SG-C-F ?μ? ；10 μΜ phEG-SG-C-R ?μ? ;基因組 DNA ?μ? ；Vent DNA 聚合酶 0.5μ? ;無菌水 40.5 μ? ； PCR擴增條件:95°C預(yù)變性3min ;95°C變性30 s、55°C退火30 s、72 °C延伸72 s，30個循環(huán)；最后72°C延伸5min; 12°C保溫，獲得內(nèi)切-β _1，4-葡聚糖酶基因SEQ ID No:1 ； 以 phll71-sgc 為模板，分別采用 phEG-SG-C-F、Mut-SD-R 和 Mut-SD-F、phEG_SG_C-R 獲得不包含類SD序列的phll71-sgc的兩個部分，之后采用拼接PCR，獲得了不包含SD序列的內(nèi)切-β-1，4_葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut_sd, SEQ ID No:2，該片段經(jīng)Nde I和NotI雙酶切后連入大腸桿菌表達載體pET21a中，獲得重組載體pET21-phll71-Sgc-mut-Sd，轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌株Ε.coli BL21 (DE3) plys得到重組菌E.coli BL21 (DE3)plys-pET21a-phll71-sgc-mut_sd0
2.不包含SD序列的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因phll71-sgc-mut_sd: SEQ ID No:2。
【專利摘要】一種表達內(nèi)切葡聚糖酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，屬于基因工程領(lǐng)域。從超嗜熱古菌即掘越氏火球菌中通過PCR擴增得到內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因SEQIDNo.1，接著去除類SD序列并采用拼接PCR，獲得了不包含SD序列內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因ph1171-sgc-mut-sd,SEQIDNo.2，然后將其插入到大腸桿菌表達載體pET21a中，得到重組載體pET21a-ph1171-sgc-mut-sd,轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌株<i>E.coli</i>BL21(DE3)plys得到重組菌<i>E.coli</i>BL21(DE3)plys-pET21a-ph1171-sgc-mut-sd。由異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，上述重組菌得到高效可溶性表達。通過加熱變性處理和離心后，經(jīng)SDS-PAGE檢測重組酶純度達到80%以上。該酶最適反應(yīng)溫度為95℃。該菌株適合用于紡織行業(yè)中降解天然結(jié)晶纖維素的過程。
【IPC分類】C12N1-21, C12N15-70, C12R1-19
【公開號】CN104561071
【申請?zhí)枴緾N201310518839
【發(fā)明人】楊雪寧, 徐彬, 王巍, 鄭春陽
【申請人】天津強微特生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月29日