一種提高微生物終細(xì)胞密度并縮短培養(yǎng)時(shí)間的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 丁二酸（succinic acid)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品和塑料 等行業(yè)，同時(shí)作為優(yōu)秀的碳四平臺(tái)化合物，可用于合成1，4-丁二醇，四氫呋喃，r-丁內(nèi)酯 等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS)類生物可降解材料，具有巨大的市場(chǎng)潛力。
[0003] 作為生物煉制產(chǎn)品工程中最重要的碳四平臺(tái)化合物，目前丁二酸生產(chǎn)主要是以丁 烷為原料的石化法，采用的是由丁烷經(jīng)順丁烯二酐電解生產(chǎn)。而生物法是利用細(xì)菌發(fā)酵將 二氧化碳固定，并將糖轉(zhuǎn)化為丁二酸的生物技術(shù)，與傳統(tǒng)石化法相比，生物基丁二酸有如下 優(yōu)勢(shì)：（1)采用生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的代謝路徑明確，代謝產(chǎn)物簡(jiǎn)單，因此結(jié)晶產(chǎn)物丁二酸 的純度高，不含有不飽和的二元酸和單酸，因此作為聚合單體質(zhì)量高，而石化法丁二酸是在 一系列催化劑作用下，經(jīng)氧化、加氫、還原等步驟得到的，因此產(chǎn)品丁二酸中會(huì)含有微量的 不飽二元酸和單酸，這些雜質(zhì)對(duì)于丁二酸與二元醇聚合生產(chǎn)聚酯是不利的。（2)生物法丁二 酸生產(chǎn)中每生產(chǎn)It 丁二酸，將會(huì)有0. 37t的CO2被菌體利用，有利于減少溫室氣體的排放。
[3] 生物合成丁二酸可利用可再生生物質(zhì)資源，如各種植物秸桿廢棄物等作為生產(chǎn)原料，可 利用豐富的農(nóng)林生物質(zhì)資源，確保生物基丁二酸不受石油價(jià)格波動(dòng)的影響。（4)生物法制備 丁二酸可以減少石油、煤等不可再生資源的消耗，達(dá)到節(jié)能減排的效果，為我國(guó)循環(huán)經(jīng)濟(jì)的 發(fā)展和綠色GDP增長(zhǎng)作出重要貢獻(xiàn)。
[0004] 丁二酸的生產(chǎn)菌株主要包括產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Uciiz70知CiBm swcciflogefles)、重組大腸桿菌(AscAericAia coJ7)和產(chǎn)琥拍酸厭氧螺菌 大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào) 控、培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單和生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。
[0005] 重組大腸桿菌在有氧條件下，菌體生長(zhǎng)迅速，糖基原料主要通過三羧酸循環(huán)被消 耗，并產(chǎn)生能量物質(zhì)用于菌體細(xì)胞大量繁殖；在厭氧發(fā)酵條件下，菌體生長(zhǎng)緩慢，主要通過 還原三羧酸途徑和乙醛酸途徑積累有機(jī)酸。因此，目前利用重組大腸桿菌生長(zhǎng)丁二酸過程 中采用先有氧培養(yǎng)菌體后厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法。Jiang等人在利用凡co/i AFPlll兩 階段發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸過程中，厭氧階段丁二酸產(chǎn)物收率>90%，濃度>100 g/L，生產(chǎn)速率達(dá)到 1.8?2.5 g/Lh (Applied and Environmental Microbiology. 2010，76(4): 1298-1300)。 在有氧培養(yǎng)過程中，菌株的生長(zhǎng)曲線，終細(xì)胞密度對(duì)種子液級(jí)數(shù)，即設(shè)備的放大倍數(shù)有著重 要的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及一種通過對(duì)微生物進(jìn)行特定種子液制備以減少種子液培養(yǎng)級(jí)數(shù)的方 法，該方法可有效減少設(shè)備投資，降低產(chǎn)品的物耗及能耗。
[0007] 本發(fā)明涉及一種提高微生物終細(xì)胞密度并縮短培養(yǎng)時(shí)間的方法，所述方法包括有 氧培養(yǎng)菌體，所述有氧培養(yǎng)菌體包括一級(jí)和二級(jí)種子培養(yǎng)，其中一級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式 為指數(shù)補(bǔ)料，二級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式為恒定補(bǔ)料。
[0008] 本發(fā)明涉及一種提高微生物終細(xì)胞密度并縮短培養(yǎng)時(shí)間的方法，所述方法包括有 氧培養(yǎng)菌體，所述有氧培養(yǎng)菌體包括一級(jí)和二級(jí)種子培養(yǎng)，其中一級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式 為指數(shù)補(bǔ)料，二級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式為恒定補(bǔ)料。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的產(chǎn)物選自丁二酸。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的微生物選自大腸桿菌。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的微生物選自重組大腸桿菌。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中補(bǔ)充的糖類選自葡萄糖。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在一級(jí)種子培養(yǎng)中溶氧維持在20%以上。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種延長(zhǎng)丁二酸菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期減少種子液培養(yǎng) 級(jí)數(shù)的方法，包括以下步驟： (1)種子液活化：從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，在37°C，200 r/min條 件下?lián)u瓶培養(yǎng)6~8 h，至菌體密度（0D600)值在:Γ5之間。
[0015] (2)-級(jí)種子液制備：按接種量5~10%轉(zhuǎn)接JSM -級(jí)種子培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初 始濃度為5~10 g·!/1，待菌株度過延滯期且葡萄糖消耗至低于0.5~1 g·!/1后，葡萄糖開 始指數(shù)補(bǔ)料，且培養(yǎng)過程通過提高轉(zhuǎn)數(shù)及通氣量使溶氧維持在20%以上。
[0016] (3)二級(jí)種子液制備：按1~2%轉(zhuǎn)接JSM二級(jí)種子培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃度 為25~30 g · Γ1，待菌株度過延滯期且葡萄糖消耗至低于0. 5~1 g · Γ1后，葡萄糖開始按 2~3g · Γ1 · IT1恒速補(bǔ)料，維持細(xì)胞OD值每小時(shí)增加2~3,當(dāng)OD值提高速度下降致〈1時(shí)， 轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵。
[0017] (4)發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程：將二級(jí)種子液全部移種至厭氧發(fā)酵罐中，以0. 1~0. 2 vvm 的通氣流量連續(xù)通二氧化碳?xì)怏w維持發(fā)酵罐中厭氧環(huán)境，并以碳酸鈉作為酸中和劑控制pH 值在6. 4以上，控制溫度在35~40°C，轉(zhuǎn)化葡萄糖合成丁二酸。
[0018] 除非本文另有定義，本發(fā)明相關(guān)使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 通常理解的含義通常，與本文所述的發(fā)酵工程領(lǐng)域相關(guān)使用的命名以及技術(shù)，是本領(lǐng)域眾 所周知且普遍使用的那些。除非另有說明，下面的術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解為具有下述含義： 如本文所述，術(shù)語"指數(shù)補(bǔ)料"是指通過調(diào)節(jié)葡萄糖的補(bǔ)加速率控制細(xì)胞比生長(zhǎng)速率在 0· 1 ?0· 2h'
[0019] 如本文所述，術(shù)語"恒速補(bǔ)料"是指以恒定的葡萄糖補(bǔ)加速率使得原料葡萄糖成為 限制性生長(zhǎng)因素，并使得細(xì)胞比生長(zhǎng)速率在0. 03~0. 07h'
[0020] 本發(fā)明通過有效的工藝技術(shù)改進(jìn)，在種子液培養(yǎng)過程中通過延長(zhǎng)菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期，并提高終細(xì)胞密度，有效減少了種子液的培養(yǎng)級(jí)數(shù)，降低了設(shè)備投資及產(chǎn)品的物耗能 耗。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例中使用的菌株及培養(yǎng)基如下： 1?? -.Escherichia coli AFPllKApplied Environmental Microbiology. 2002, 68, 1715-1727) 培養(yǎng)基： (I) LB搖瓶種子液培養(yǎng)基：酵母粉5 g · Γ1 ;蛋白胨10 g · Γ1 ;NaCl 5 g · L'
[0022] (2)JSM培養(yǎng)基：檸檬酸3 g .I/1 ;Na2HP04 ·7Η20 3 g .I/1 ;KH2P04 8 g .I/1 ; (NH4)2HPO4 8 g · Γ1 ;NH4C1 0· 2 g · Γ1 ; (NH4)2SO4 0· 75 g · Γ1 ;MgS04 · 7H20 I. 00 g · Γ1 ;CaCl2 · 2H20 10. 0 mg · Γ1 ;ZnS04 · 7H20 0· 5 mg · Γ1 ;CuC12 · 2H20 0· 25 mg · Γ1 ;MnS04 · H2O 2· 5 mg · Γ1 ; CoCl2 ·6Η20 I. 75 mg ?Γ1 ；H3B03 0. 12 mg ；Al2 (SO4) 3 *xH20 I. 77 mg · Γ1 ；Na2Mo04 · 2H20 0. 5 mg · I71 ;梓檬酸鐵 16. I mg · I71 !VB1 20 · mg I71 ;生物素 2 mg · L'
[0023] (3)兩級(jí)培養(yǎng)時(shí)種子罐和發(fā)酵罐的體積：一級(jí)種子罐350L，二級(jí)種子罐35m3,厭氧 發(fā)酵罐95m 3。
[0024] (4)三級(jí)培養(yǎng)時(shí)種子罐和發(fā)酵罐的體積：一級(jí)種子罐350L，二級(jí)種子罐3. 5m3,三級(jí) 種子罐35m3,厭氧發(fā)酵罐95m3。
[0025] 下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制。
[0026] 實(shí)施例1 采用三級(jí)培養(yǎng)時(shí)，一級(jí)和二級(jí)種子培養(yǎng)基為JSM培養(yǎng)基并添加 l(Tl2g/L的葡萄糖，三 級(jí)種子培養(yǎng)為JSM培養(yǎng)基并添加70g/L的葡萄糖。三級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束后以0. f〇. 2 vvm 的通氣流量連續(xù)通二氧化碳?xì)怏w維持發(fā)酵罐中厭氧環(huán)境，并以碳酸鈉作為酸中和劑控制pH 值在6. 4以上，控制溫度在35~40°C，轉(zhuǎn)化葡萄糖合成丁二酸。其結(jié)果見表1。
[0027] 表1三級(jí)培養(yǎng)時(shí)各培養(yǎng)結(jié)束時(shí)菌體密度、產(chǎn)物濃度
[0028] 實(shí)施例2
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高微生物終細(xì)胞密度并縮短培養(yǎng)時(shí)間的方法，所述方法包括有氧培養(yǎng)菌體， 所述有氧培養(yǎng)菌體包括一級(jí)和二級(jí)種子培養(yǎng)，其中一級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式為指數(shù)補(bǔ)料， 二級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式為恒定補(bǔ)料。
2. -種縮短微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)過程的時(shí)間的方法，所述方法包括在厭氧發(fā)酵前進(jìn) 行有氧培養(yǎng)菌體，所述有氧培養(yǎng)菌體包括一級(jí)和二級(jí)種子培養(yǎng)，其中一級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖 方式為指數(shù)補(bǔ)料，二級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式優(yōu)選為恒定補(bǔ)料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述指數(shù)補(bǔ)料是指通過調(diào)節(jié)葡萄糖的補(bǔ)加速率控 制細(xì)胞比生長(zhǎng)速率在0. 1~〇. 21Γ1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述恒速補(bǔ)料是指以恒定的葡萄糖補(bǔ)加速率使得 原料葡萄糖成為限制性生長(zhǎng)因素，并使得細(xì)胞比生長(zhǎng)速率在〇. 03、. 07h'
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述產(chǎn)物選自丁二酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述微生物選自大腸桿菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述微生物為重組大腸桿菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中補(bǔ)充的糖類選自葡萄糖。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)方法，其中在一級(jí)種子培養(yǎng)中溶氧維持在20%以上。
10. -種延長(zhǎng)丁二酸菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期減少種子液培養(yǎng)級(jí)數(shù)的方法，包括以下步驟： (1) 種子液活化：從LB平板上取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，在37°C，200 r/min條 件下?lián)u瓶培養(yǎng)6~8 h，至菌體密度（0D600)值在:Γ5之間； (2) -級(jí)種子液制備：按接種量5~10%轉(zhuǎn)接JSM -級(jí)種子培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃 度為5~10 g·!/1，待菌株度過延滯期且葡萄糖消耗至低于0.5~1 g·!/1后，葡萄糖開始指 數(shù)補(bǔ)料，且培養(yǎng)過程通過提高轉(zhuǎn)數(shù)及通氣量使溶氧維持在20%以上； (3) 二級(jí)種子液制備：按1~2%轉(zhuǎn)接JSM二級(jí)種子培養(yǎng)基，添加葡萄糖至初始濃度為 25~30 g·!/1，待菌株度過延滯期且葡萄糖消耗至低于0. 5~1 g·!/1后，葡萄糖開始按2~3g· Γ1 f1恒速補(bǔ)料，維持細(xì)胞OD值每小時(shí)增加2~3,當(dāng)OD值提高速度下降致〈1時(shí)，轉(zhuǎn)厭氧發(fā) 酵； (4) 發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程：將二級(jí)種子液全部移種至厭氧發(fā)酵罐中，以0. 1~0. 2 vvm的通 氣流量連續(xù)通二氧化碳?xì)怏w維持發(fā)酵罐中厭氧環(huán)境，并以碳酸鈉作為酸中和劑控制PH值 在6. 4以上，控制溫度在35~40°C，轉(zhuǎn)化葡萄糖合成丁二酸。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高微生物終細(xì)胞密度并縮短培養(yǎng)時(shí)間的方法，包括有氧培養(yǎng)菌體，所述有氧培養(yǎng)菌體包括一級(jí)和二級(jí)種子培養(yǎng)，其中一級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式為指數(shù)補(bǔ)料，二級(jí)種子培養(yǎng)的補(bǔ)糖方式為恒定補(bǔ)料，最終實(shí)現(xiàn)種子液的低級(jí)數(shù)培養(yǎng)。本發(fā)明還涉及縮短微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)過程的時(shí)間的方法。
【IPC分類】C12R1-19, C12P7-46
【公開號(hào)】CN104561139
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310489634
【發(fā)明人】丁家海, 稱素鴻, 馮小華, 黃興東
【申請(qǐng)人】中國(guó)石油化工股份有限公司, 中國(guó)石化揚(yáng)子石油化工有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月18日