一種測(cè)定抑制骨吸收藥物生物活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及測(cè)定骨吸收藥物活性的方法，具體涉及抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收活 性的藥物的活性測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥是常見(jiàn)的骨吸收疾病，隨著世界人口老齡化日趨明顯，骨質(zhì)疏松癥的 發(fā)病率逐年升高，由骨質(zhì)疏松癥所致的骨痛和骨折直接影響了中老年人的生存質(zhì)量，已成 嚴(yán)峻的社會(huì)問(wèn)題。
[0003] 骨質(zhì)疏松癥是由于骨代謝失衡導(dǎo)致骨吸收增加而引起的骨代謝性疾病，所以抑制 骨吸收是治療骨質(zhì)疏松癥的有效途徑。在人體里，破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞， 破骨細(xì)胞的分化或其功能的改變所導(dǎo)致的骨改建失衡是骨質(zhì)疏松的重要病理基礎(chǔ)。也就是 說(shuō)，開(kāi)發(fā)抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力的藥物是防治骨質(zhì)疏松癥的主要藥理基礎(chǔ)。
[0004] 破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，由單個(gè)核前體細(xì)胞融合而成，主要分布在主要 分布在骨質(zhì)表面、骨內(nèi)血管通道周圍。成熟破骨細(xì)胞是含有2-50個(gè)緊密堆積的核的巨大細(xì) 胞，具有較強(qiáng)的骨吸收能力，在體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞可以在骨片或象牙表面上形成骨吸收 陷窩。
[0005] 在體外成功誘導(dǎo)破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系是開(kāi)發(fā)抑制骨吸收藥物的關(guān)鍵。目前，，破骨細(xì) 胞的培養(yǎng)方法主要有原代培養(yǎng)方法和骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。其中原代培養(yǎng)方法得到的破骨 細(xì)胞數(shù)量少，且得到的細(xì)胞大多為成熟破骨細(xì)胞，不適合用于破骨細(xì)胞增殖、分化方面的研 究。骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，雖然得到充足的破骨細(xì)胞來(lái)源，但目前的培養(yǎng)方法得到的破骨細(xì)胞 具有其性質(zhì)與體內(nèi)原有破骨細(xì)胞有差異，具有噬骨能力差等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供簡(jiǎn)單、有效測(cè)定抑制骨吸收藥物生物活性的方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為如下：
[0008] -種測(cè)定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，在體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中， 加入不同濃度的待測(cè)藥物，測(cè)定破骨細(xì)胞功能。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系是大鼠骨髓源性細(xì)胞誘 導(dǎo)的培養(yǎng)體系。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述破骨細(xì)胞功能包括抗酒石酸酸性磷酸酶染色活性和在 象牙片上骨吸收活性。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，通過(guò)如下方法獲得；
[0012] (1)收集大鼠大腿骨和脛骨中的骨髓細(xì)胞，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中；
[0013] (2)細(xì)胞懸浮液通過(guò)葡聚糖凝膠S印hadex GlO色譜柱，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌，收集細(xì) 胞；
[0014] (3)收集得到的細(xì)胞種于培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)板內(nèi)添加含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基共同培 養(yǎng)，每隔2天換液，培養(yǎng)4-7天；
[0015] 其中，步驟（3)中所述培養(yǎng)基為含有KT8Mla, 25(0H)2D3、20-100ng/ml破骨細(xì)胞生 成因子、10-50ng/ml巨噬細(xì)胞集落刺激因子、15-20%胎牛血清的DMEM。
[0016] 在上述破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系的獲得方法中，步驟（1)或（2)所述的細(xì)胞培養(yǎng)液優(yōu)選 含有15-20%胎牛血清的DMEM。
[0017] 在上述破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系的獲得方法中，步驟（3)中種于培養(yǎng)板中的細(xì)胞數(shù)優(yōu)選 為 1 X 106-4X 106 個(gè)/cm2。
[0018] 在上述破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系的獲得方法中，步驟（1)所述大鼠優(yōu)選為4-6周齡。
[0019] 本發(fā)明的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系獲得的破骨細(xì)胞，顯示很強(qiáng)的抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP+)染色活性，在象牙片的骨吸收實(shí)驗(yàn)中也顯示強(qiáng)的骨吸收能力。
[0020] 本發(fā)明的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，使用的相關(guān)細(xì)胞因子價(jià)格低，使用量 少，培養(yǎng)成分低。另一方面，本發(fā)明的培養(yǎng)體系穩(wěn)定，得到的破骨細(xì)胞數(shù)量多，具有典型的破 骨細(xì)胞性質(zhì)，有利于大量測(cè)定抑制骨吸收藥物的生物活性，繼而開(kāi)發(fā)有效的骨吸收疾病治 療要藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以 任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中所述試驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和 材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得，或可以常規(guī)方法制備。
[0022] 實(shí)施例1破骨細(xì)胞的培養(yǎng)
[0023] 取4周齡的SD雄性大鼠，麻醉后托頸處死，放在75%乙醇中浸泡片刻，在無(wú)菌條件 下，取出大鼠大腿骨和脛骨，去凈骨表面的軟組織，用無(wú)菌PBS反復(fù)沖洗2-3次，最后置于含 有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，剪斷大腿骨和脛骨的兩端，并用注射器取吸取含15%胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗骨髓細(xì)胞，直至骨頭發(fā)白。將沖洗的骨髓細(xì)胞收集于50ml 離心管中，在l〇〇〇rpm，4°C下離心10分鐘，去上清液。再加入DMEM培養(yǎng)液，將離心管內(nèi)的 細(xì)胞均勻懸浮于培養(yǎng)液中，再離心，去上清液，反復(fù)洗2-3次。最后加入適量含有15%胎牛 血清的DMEM培養(yǎng)液吹打均勻，上葡聚糖凝膠S印hadex GlO色譜柱，用含有15%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，收集洗脫液中的細(xì)胞，1000rpm，4°C下離心10分鐘，去上清液。細(xì)胞中加入適 量培養(yǎng)培養(yǎng)液，并加入含有l(wèi)a，25 (OH)2D3 (VD3)、破骨細(xì)胞生成因子（RANKL)和巨噬細(xì)胞集 落刺激因子（M-CSF)的15%胎牛血清的DMEM，其中VD 3、RANKL和M-CSF的最終濃度分別為 10_8M、50ng/ml、20ng/ml。加入細(xì)胞因子的細(xì)胞種于96孔板中，每孔中的細(xì)胞數(shù)3X IO5個(gè) 細(xì)胞，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q液一次，共培養(yǎng)4天。
[0024] 實(shí)施例2破骨細(xì)胞活性測(cè)定
[0025] 用兩種方法測(cè)定。
[0026] 1.抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP+)染色活性：實(shí)施例1中，培養(yǎng)4天的細(xì)胞，輕輕吸 取培養(yǎng)上清液后加入0. 5ml/孔0. 5%TRIT0N X-100,放置20分鐘，固定細(xì)胞。將清除固定 液，細(xì)胞用PBS輕輕清洗2-3次，用TRAP+染色試劑盒（sigma，N 〇387)染色，并在顯微鏡下 統(tǒng)計(jì)具有3個(gè)以上細(xì)胞核的TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞，結(jié)果表明96孔板的每孔上形成的破骨細(xì) 胞的平均數(shù)量為124個(gè)。
[0027] 2.對(duì)象牙片的骨吸收活性：
[0028] (1)將直徑約3. 7mm，厚度約2. 7μπι的象牙片，用75%乙醇浸泡5個(gè)小時(shí)，用無(wú)血 清的DMEM反復(fù)沖洗后，在紫外燈下放置12小時(shí)以上。將消毒處理后的象牙片平鋪于96孔 板中，備用。
[0029] (2)實(shí)施例1中，培養(yǎng)4天的細(xì)胞，輕輕吸取培養(yǎng)上清液后加入0.05%胰蛋白 酶-0. 02%EDTA0. 5ml，聯(lián)合消化培養(yǎng)板中的細(xì)胞5min，加入0. 5ml/孔含15%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化作用。將消化下來(lái)的細(xì)胞收集于離心管中，在lOOOrpm， 4°C下離心5分鐘，去上清液。然后迅速加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，均勻懸浮細(xì) 胞，將細(xì)胞輕輕加入到步驟（1)中的鋪有象牙片的96孔板中，細(xì)胞數(shù)為2 X IO5個(gè)/孔。在 37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液。培養(yǎng)5天后，棄去培養(yǎng)上清液，2%TRIT0N X-100固 定IOmin,于0. 25mol/L氫氧化銨中超聲波清洗3次，每次5min，依次在50%乙醇，60%乙醇， 70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100乙醇和無(wú)水乙醇中梯度脫水后，1%甲苯胺藍(lán)染 液中染色1-2分鐘，蒸餾水清洗3次，在顯微鏡下觀察吸收陷窩，并計(jì)數(shù)。每孔中的平均吸 收陷窩數(shù)為153個(gè)。陷窩面積用Scion Image version Beta4.02software計(jì)算，每孔中的 平均吸收陷窩面積為298mm2。
[0030] 實(shí)施例3
[0031] 按實(shí)施例1的方法準(zhǔn)備破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，將準(zhǔn)備好的鋪好細(xì)胞的96孔板中，力口 入不同濃度的OPG-Fc融合蛋白，其最終濃度分別為300 μ g/Ι、100 μ g/1、1 μ g/1、300ng/l、 100ng/l、30ng/l、lng/1、0· 0lng/1，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔。以不加入OPG-Fc融合蛋白，力口 入相當(dāng)體積的培養(yǎng)液的為對(duì)照組。對(duì)照組也設(shè)4個(gè)平行孔。
[0032] 加入不同濃度藥物和培養(yǎng)液的細(xì)胞，在在37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q液一 次，共培養(yǎng)4天。
[0033] 按照實(shí)施例2所述的方法測(cè)定抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP+)染色活性。測(cè)定結(jié)果 如表1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，在體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞培 養(yǎng)體系中，加入不同濃度的待測(cè)藥物，測(cè)定破骨細(xì)胞功能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，所述體 外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系是大鼠骨髓源性細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)體系。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，所述破 骨細(xì)胞功能包括抗酒石酸酸性磷酸酶染色活性和在象牙片上骨吸收活性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，所述體 外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，通過(guò)如下方法獲得； (1) 收集大鼠大腿骨和脛骨中的骨髓細(xì)胞，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中； (2) 細(xì)胞懸浮液通過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex GlO色譜柱，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌，收集細(xì)胞； (3 )收集得到的細(xì)胞種于培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)板內(nèi)添加含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，每 隔2天換液，培養(yǎng)4-7天； 其中，步驟（3)中所述培養(yǎng)基為含有10_8Mla，25(0H)2D3、20-100ng/ml破骨細(xì)胞生成因 子、10-50ng/ml巨噬細(xì)胞集落刺激因子、15-20%胎牛血清的DMEM。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種測(cè)定抑制骨吸收藥物生物活性的方法，其特征在于，在體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中，加入不同濃度的待測(cè)藥物，測(cè)定破骨細(xì)胞功能。本發(fā)明所述破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，使用的相關(guān)細(xì)胞因子價(jià)格低，使用量少，培養(yǎng)成分低。本發(fā)明的培養(yǎng)體系穩(wěn)定，得到的破骨細(xì)胞數(shù)量多，具有典型的破骨細(xì)胞性質(zhì)，有利于大量測(cè)定抑制骨吸收藥物的生物活性，繼而開(kāi)發(fā)有效的骨吸收疾病治療要藥物。
【IPC分類】C12Q1-02
【公開(kāi)號(hào)】CN104561226
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310498692
【發(fā)明人】秦宏佳
【申請(qǐng)人】大連市沙河口區(qū)中小微企業(yè)服務(wù)中心
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月21日