一種以番茄紅素ε環(huán)化酶基因ILP標(biāo)記對(duì)煙草制品進(jìn)行鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)研宄領(lǐng)域，具體涉及一種以番茄紅素 ε環(huán)化酶基因 ILP標(biāo) 記對(duì)煙草制品進(jìn)行鑒定的方法，其以煙草物種DNA的特異性作為鑒定依據(jù)，與傳統(tǒng)鑒定方 法相比，具有更加客觀、更加準(zhǔn)確、更加可靠的優(yōu)勢(shì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙絲很難從外觀上進(jìn)行鑒別檢驗(yàn)，而以煙草特有的亞硝胺、煙堿等化學(xué)成分檢測(cè) 來(lái)對(duì)煙絲進(jìn)行檢驗(yàn)又有如下局限：其一，煙堿并非煙草所獨(dú)有，在其它茄科植物中也很常 見(jiàn)；其二，易被不法分子所采取的非法加料等手段所干擾。除此之外，上述法規(guī)要求檢驗(yàn)人 員不僅需要掌握相關(guān)的原料特性、化學(xué)成分分析方法、感官評(píng)吸技術(shù)，還需具備煙葉生產(chǎn)和 分級(jí)技能，檢驗(yàn)人員的培訓(xùn)難度大；另外，煙絲本身的霉變和不法分子所采取的染色等手 段，也加大了檢驗(yàn)人員進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的難度。因此，依靠現(xiàn)有的檢驗(yàn)方法對(duì)煙絲進(jìn)行鑒別， 容易引起誤判、錯(cuò)判的發(fā)生。
[0003] DNA分子標(biāo)記技術(shù)屬于分子生物學(xué)研宄范疇，是從DNA水平區(qū)分不同物種甚至 是同一物種不同個(gè)體之間的選擇性標(biāo)記技術(shù)。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（PCR)技術(shù)的出現(xiàn)，DNA分子生物學(xué)研宄發(fā)展迅猛，目前DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十 種之多，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction Fragment Length polymorphism, RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、序列特異性 擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記（Sequence Characterized Amplified Regions, SCAR)、內(nèi)含子長(zhǎng)度多 態(tài)性標(biāo)記（intron-length polymorphism, ILP)、單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple Sequence Repeats, SSR)等。以 DNA 分子 標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行物種鑒定，是以物種的DNA分子多態(tài)性與其性狀間的緊密因果關(guān)系為基礎(chǔ)， 可內(nèi)在、直接地反映物種的特性，以其進(jìn)行物種鑒別，不受外界環(huán)境、檢驗(yàn)人員主觀感受差 異、加工條件及物種本身器官組織變化等因素的影響。大量研宄實(shí)踐已經(jīng)表明：在DNA分子 水平，不同物種間甚至是同一物種不同個(gè)體之間都能得到很好的區(qū)分。DNA分子標(biāo)記技術(shù)作 為物種分類鑒定的一種手段，已被廣泛地應(yīng)用于屬間、種間、品種間的分類鑒定和親緣關(guān)系 研宄中，幾乎可以對(duì)所有的生物種類進(jìn)行分類鑒定，在目前物種鑒定技術(shù)中發(fā)展最快，也最 為熱門。表1列出了 DNA分子標(biāo)記技術(shù)在各類鑒定中的應(yīng)用，目前尚未有采用DNA分子標(biāo) 記技術(shù)對(duì)煙草制品進(jìn)行鑒定的相關(guān)報(bào)道。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種以番茄紅素 ε環(huán)化酶基因 ILP標(biāo)記對(duì)煙草制品進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于， 提取待測(cè)樣品的 DNA ;分別以 CTGATGTGTTGCTGTGCTAGG、AATGCACTTCGCAAGCTCTA 作為上下游 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在450 bp、550 bp位置處均出 現(xiàn)電泳條帶，則判定樣品為煙草制品。
2. 如權(quán)利要求1所述以番茄紅素 ε環(huán)化酶基因 ILP標(biāo)記對(duì)煙草制品進(jìn)行鑒定的方法， 其特征在于，所述待測(cè)樣品的DNA提取具體如下： 1)取待測(cè)樣品碾磨成細(xì)粉末，放入2 mL離心管中； 2 )加入600~800 μ L、溫度60 ± 5°C的CTAB提取緩沖液，混勻，每3~5min震蕩2~5次 次，20min 后 12000 r/min 離心 10~15 min ; 3) 吸取上清液，分別加入與上清液體積相同的苯酷、氯仿，混勾，4°C、12000 r/min離心 10?15 min ； 4) 吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勾，4°C、12000 r/min離心10?15 min，重復(fù)多次 至蛋白層不出現(xiàn)為止； 5) 取上清液，_20°C沉淀 l~2h，4°C、12000 r/min 離心 10~15 min ; 6) 棄去上清液，用50~70%乙醇洗滌沉淀2次；室溫下干燥后，于-20°C或者_(dá)70°C保存 備用。
3. 如權(quán)利要求1所述以番茄紅素 ε環(huán)化酶基因 ILP標(biāo)記對(duì)煙草制品進(jìn)行鑒定的方法， 其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：解鏈溫度95°C，30秒；退火溫度55°C，30秒；延伸 溫度68 °C，30秒；重復(fù)35個(gè)循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及一種以番茄紅素ε環(huán)化酶基因ILP標(biāo)記對(duì)煙草制品進(jìn)行鑒定的方法，其采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取待測(cè)樣品的DNA；分別以CTGATGTGTTGCTGTGCTAGG、AATGCACTTCGCAAGCTCTA作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在450bp、550bp位置處均出現(xiàn)電泳條帶，則判定樣品為煙草制品。與傳統(tǒng)鑒定方法相比，本發(fā)明方法具有更加客觀、更加準(zhǔn)確、更加可靠等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104561273
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410779917
【發(fā)明人】劉楠, 張威, 羅安娜, 何聲寶, 王英元, 馮曉民, 胡清源, 邢軍
【申請(qǐng)人】國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月17日