副豬嗜血桿菌血清分型pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及血清分型方法，具體涉及副豬嗜血桿菌血清分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS)能引起豬的多發(fā)性楽膜炎、關(guān)節(jié)炎和 腦膜炎，隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要的細菌性 疾病。副豬嗜血桿菌可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病， 通常見于5?8周齡的豬，發(fā)病率一般在10 %?15%，嚴(yán)重時死亡率可達50 %。主要臨床 癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂；主要剖檢病變表現(xiàn)為纖維素性胸膜炎、 心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。此外，副豬嗜血桿菌還可引起敗血癥，并且在急性感染 后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。近年來，隨著我國規(guī)模化養(yǎng)豬的發(fā)展，副 豬嗜血桿菌感染有明顯增加趨勢，已成為豬場保育仔豬發(fā)病率和死亡率增加的重要原因之 一，并給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。副豬嗜血桿菌血清型眾多，共15個血清型。
[0003] 副豬嗜血桿菌感染的大多數(shù)流行病學(xué)研究是根據(jù)血清學(xué)分型信息開展的。傳統(tǒng)的 血清學(xué)分型方法是根據(jù)熱穩(wěn)定性可溶性抗原進行的瓊脂擴散（GD)和間接血凝試驗，已證 實有15種血清型。而瓊脂擴散的分型率大概只有63%，間接血凝的分型率為80%，仍然有 大約20%的菌株不能進行分型，且這2種方法存在費時費力，交叉反應(yīng)較多，結(jié)果不準(zhǔn)確的 問題。用于這兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清也較難制備，存在制備周期長，血清效價較低，交叉 反應(yīng)難消除，且購買標(biāo)準(zhǔn)陽性血清價格昂貴，結(jié)果判斷主觀差異較大等問題。因為血清型的 難于鑒定，導(dǎo)致菌株背景不清楚，臨床上可能導(dǎo)致使用的疫苗血清型不對而導(dǎo)致疫苗免疫 失敗；另外因菌株血清型不清楚也給很多科研工作者的研究工作帶來諸多不便。
[0004] 副豬嗜血桿菌的血清型主要取決于其莢膜（CPS)的抗原性，而莢膜的產(chǎn)生又受控 于基因組中的莢膜合成基因簇（CPS locus)。與傳統(tǒng)的用抗血清檢測血清型比較，基于血清 型特異CPS基因的PCR方法是一種簡單、可靠、經(jīng)濟的方法。目前臨床上還沒有這種分子分 型的方法出現(xiàn)，所以迫切需要建立一套完善的檢測體系能夠方便快捷、準(zhǔn)確、分型率高地檢 測出副豬嗜血桿菌的15種血清型，來替代傳統(tǒng)落后、不實用且難于實現(xiàn)的血清分型方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確度高、靈敏度高、特異 性強的副豬嗜血桿菌血清分型PCR方法。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 副豬嗜血桿菌血清分型PCR方法，包括以下步驟，
[0008] 1)引物設(shè)計：比對副豬嗜血桿菌的莢膜合成基因簇上的保守基因，為15種血清型 分別對應(yīng)設(shè)計一對引物，作為血清分型PCR引物；
[0009] 2) PCR擴增：以副豬嗜血桿菌15種血清型的參考菌株的基因組DNA為模板，以無 菌雙蒸水或超純水為陰性對照，分別對上述設(shè)計的15對PCR引物進行PCR擴增；
[0010] 3)凝膠成像：PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察每條引物擴 增的目的條帶，記錄目的條帶信息；
[0011] 4)菌株檢測：以待測菌株的基因組DNA為模版，以無菌雙蒸水或超純水為陰性對 照，分別對上述15對PCR引物擴增，電泳凝膠成像，與參考菌株的目的條帶信息進行比對， 進行血清分型鑒別。
[0012] 作為優(yōu)選，步驟1)所述PCR引物的序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 30。
[0013] 作為優(yōu)選，步驟2)所述PCR擴增的條件如下：
[0014] 50uL 反應(yīng)體系：2XTaq PCR Master Mix 25yL，10mmol/mL 引物各 lyL，模板DNA I μ L，然后加入無菌雙蒸水或超純水補足至50 μ L ;
[0015] PCR反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性5min ;然后按94°C變性45s，59°C退火30s，72°C延伸 30s，進行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟3)所述電泳成像條件如下：
[0017] 用1%濃度的瓊脂糖凝膠在120V電壓下電泳15min，凝膠成像系統(tǒng)觀察每條引物 擴增的目的條帶大小。
[0018] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 1.莢膜多糖是副豬嗜血桿菌的重要毒力因子，也是副豬嗜血桿菌血清型的區(qū)分依 據(jù)。莢膜合成相關(guān)基因簇是副豬嗜血桿菌各血清型鑒別的分子基礎(chǔ)，本發(fā)明針對莢膜進行 血清型PCR分型的方法在國內(nèi)屬先例。
[0020] 2.本發(fā)明提供的血清分型PCR方法特異性高。經(jīng)比對，副豬嗜血桿菌各血清型的 CPS基因簇中各自之間無同源性，被認為是血清型特異性基因。本發(fā)明提供的血清分型PCR 引物，是針對該血清型特異性基因設(shè)計和篩選的，不會與其它另14種血清之間發(fā)生交叉反 應(yīng)，具有良好的特異性。
[0021] 3.本發(fā)明提供的血清分型PCR方法，可迅速實現(xiàn)對15種血清型的快速甄別檢測， 相對于瓊脂擴散（GD)和間接血凝試驗分型方法更加快速簡便，耗時短。
[0022] 4.本發(fā)明提供的血清分型PCR方法，經(jīng)鑒定，與常規(guī)瓊脂擴散試驗結(jié)果的符合率 一致，具有較高的準(zhǔn)確率。
[0023] 5.本發(fā)明提供的血清分型PCR方法，均可適用于副豬嗜血桿菌15種血清型的檢 測，具有比常規(guī)瓊脂擴散試驗更寬的檢測范圍，檢出率高。
[0024] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0025] 圖1副豬嗜血桿菌15種血清分型PCR鑒定結(jié)果；
[0026] 圖2血清1型PCR特異性結(jié)果；
[0027] 圖3血清2型PCR特異性結(jié)果；
[0028] 圖4血清3型PCR特異性結(jié)果；
[0029] 圖5血清4型PCR特異性結(jié)果；
[0030] 圖6血清5型PCR特異性結(jié)果；
[0031] 圖7血清6型PCR特異性結(jié)果；
[0032] 圖8血清7型PCR特異性結(jié)果；
[0033] 圖9血清8型PCR特異性結(jié)果；
[0034] 圖10血清9型PCR特異性結(jié)果；
[0035] 圖11血清10型PCR特異性結(jié)果；
[0036] 圖12血清11型PCR特異性結(jié)果；
[0037] 圖13血清12型PCR特異性結(jié)果；
[0038] 圖14血清13型PCR特異性結(jié)果；
[0039] 圖15血清14型PCR特異性結(jié)果；
[0040] 圖16血清15型PCR特異性結(jié)果。
【具體實施方式】
[0041] 實施例I:PCR引物的設(shè)計
[0042] 比較副豬嗜血桿菌CPS基因簇上的保守基因，并分析比較各血清型之間保守基因 的差別，對每個血清型設(shè)計多對引物，經(jīng)大量試驗比較其特異性、靈敏性等因素后，最終每 個血清型確定一對特異性好，靈敏性高引物作為鑒定PCR引物，PCR引物序列如表1所示， PCR 引物序列如 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 30 所示。
[0043] 表1各血清型PCR引物序列
[0044]
【主權(quán)項】
1. 副豬嗜血桿菌血清分型PCR方法，包括以下步驟， 1) 引物設(shè)計：比對副豬嗜血桿菌的莢膜合成基因簇上的保守基因序列，為15種血清型 分別對應(yīng)設(shè)計一對引物，作為血清分型PCR引物； 2. PCR擴增：以副豬嗜血桿菌15種血清型的參考菌株的基因組DNA為模板，以無菌雙 蒸水或超純水為陰性對照，分別用上述設(shè)計的15對PCR引物進行PCR擴增； 3) 凝膠成像：PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察每條引物擴增的 目的條帶，記錄目的條帶信息； 4) 菌株檢測：以待測菌株的基因組DNA為模版，以無菌雙蒸水或超純水為陰性對照，分 別用上述15對PCR引物擴增，電泳凝膠成像，與參考菌株的目的條帶信息進行比對，進行血 清分型鑒別。
2. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌血清分型PCR方法，其特征在于，步驟1)所述15 對 PCR 引物的序列為 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 30。
3. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌血清分型PCR方法，其特征在于，步驟2)所述PCR 擴增的條件如下： 5(^1^反應(yīng)體系：2父丁&9?0?1&18七6『]\^叉25 4 1^1〇111111〇1/11^引物各14 1^模板0嫩 1 μ L，然后加入無菌雙蒸水或超純水補足至50 μ L ; PCR反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性5min ;然后按94°C變性45s，59°C退火30s，72°C延伸30s，進 行35個循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。
4. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌血清分型PCR方法，其特征在于，步驟3)電泳成 像條件如下： 用1%濃度的瓊脂糖凝膠在120V電壓下電泳15min，凝膠成像系統(tǒng)觀察每條引物擴增 的目的條帶大小。
【專利摘要】本發(fā)明通過比較副豬嗜血桿菌莢膜合成基因簇上的保守基因，并分析各血清型之間保守基因的差別，為15個血清型各設(shè)計多對引物，并從中各篩選一對作為血清分型PCR引物，并建立鑒別副豬嗜血桿菌15個血清分型PCR方法。本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確度高、靈敏度高、特異性強的副豬嗜血桿菌血清分型PCR方法。
【IPC分類】C12R1-21, C12Q1-04, C12Q1-68
【公開號】CN104561283
【申請?zhí)枴緾N201410823091
【發(fā)明人】賈愛卿, 劉琪, 王悅蕓, 周如月, 安欣宇, 王貴平
【申請人】廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月24日