鐮刀菌單端孢霉烯族b類毒素pcr檢測引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，特別是鐮刀菌單端孢霉烯族B類毒素 PCR檢測引 物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由鐮刀菌引起的赤霉?。‵usarium head blight or scab)是世界范圍內(nèi)一種重 要的流行性病害，它能夠危害包括大麥、小麥、玉米、水稻等多種禾谷類作物。隨著全球性氣 候變暖和區(qū)域性氣候的反常以及耕作制度的變化，病害的發(fā)生頻率增加，發(fā)生區(qū)域不斷擴 大。赤霉病不僅導(dǎo)致谷物的產(chǎn)量嚴重損失，而且鐮刀菌可以產(chǎn)生多種真菌毒素，降低糧食和 飼料的品質(zhì)，嚴重威脅人和動物的健康，給食品安全帶來重大隱患。
[0003] 單端孢霉烯族毒素是鐮刀菌產(chǎn)生的最重要的真菌毒素，主要分為A、B兩類。它 能夠抑制真核細胞蛋白質(zhì)的合成，破壞人畜的棉衣系統(tǒng)，使中毒者出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、頭暈等 多種癥狀，同時還有一定的致畸和致癌性，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，B類單端孢霉烯族毒素 可以分為3-乙?；撗跹└牭毒〈迹?-acetyldeoxynivalenol，簡稱3AD0N)、15_乙 酰基脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（15-acetyldeoxynivalenol，簡稱15AD0N)和雪腐鐮刀菌稀醇 (nivalenol，簡稱NIV)，在我國主要麥區(qū)，禾谷鏡刀菌是（Fusarium graminearum Schwabe) 引起赤霉病最主要的病原物，同時也是合成B類單端孢霉烯族毒素的主要病原菌，嚴重影 響人和動物的安全。
[0004] 目前，真菌毒素含量的檢測方法通常有生物學(xué)檢測法，理化檢測方法，免疫化學(xué)檢 測法等，生物測定法由于缺乏統(tǒng)一的規(guī)范化標準及檢測分析不準確等原因，在實際鐮刀菌 毒素檢測中未能得到廣泛應(yīng)用；化學(xué)測定法是目前用于鐮刀菌毒素含量測定的主要方法， 其特點是準確、重復(fù)性好，但是該方法要求的樣品提純較繁瑣，技術(shù)含量要求較高，不能滿 足快速檢測的要求；免疫測定法，操作簡單，費用較低，但因為檢測出的毒素中常含有一些 其它衍生物，所以測定的結(jié)果往往不準確，容易出現(xiàn)假陽性；這三種檢測方法均不適于快 速、靈敏準確的檢測B類單端孢霉烯族毒素污染。
[0005] 近年來，隨著多種鐮刀菌基因組的公布，分子生物學(xué)研宄的迅速發(fā)展，國內(nèi)外的研 宄人員在單端孢霉烯族毒素的合成、毒素合成基因表達調(diào)控方面已經(jīng)取得了重要成果，證 實了一些基因在毒素代謝途徑中的重要作用，基于這些研宄結(jié)果和相關(guān)基因的序列信息， 建立一種簡單快速、價格低廉的毒素檢測方法成為不同國家研宄人員探索的熱點，Kim等 利用Tri5、Tri7和Tril3的基因序列，檢測了來自多個寄主中的禾谷鐮刀菌DON和NIV 毒素的產(chǎn)生情況（Kim et al. Polymorphism of trichothecene biosynthesis genes in deoxynivalenol-and nivalenoI-producing Fusarium graminearum isolates. Mycol Res. 2003, 107:190-197)，但Tri5的鑒定方法操作繁瑣，且費用較高，在實際中很 難得到廣泛應(yīng)用；Chandler等利用Tri7和Tril3的基因序列，設(shè)計10對引物檢測了三 種鐮刀菌產(chǎn)生毒素的情況，但出現(xiàn)了多對引物之間檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象（Chandler et al.Development of PCR assays to Tri7 and Tri13 trichothecene biosynthetic genes, and characterisation of chemotypes of Fusarium graminearum，F(xiàn)usarium culmorum and Fusarium cerealis. Physiol. Mol. Plant Pathol. 2003, 62:355-367) ;Li 等 (2005)通過分析禾谷鐮刀菌Tri5?Tri6基因間隙區(qū)序列，設(shè)計了區(qū)分DON和NIV化學(xué)型 的引物，通過對中國364個菌株的檢測，證明該對引物的穩(wěn)定性很好，適用于禾谷鐮刀菌化 學(xué)型的大規(guī)模檢測，但是該項技術(shù)不能區(qū)分DON毒素的兩種衍生物（Li et al. Development of a generic PCR detection of deoxynivalenol-and nivalenoI-chemotypes of Fusarium graminearum. FEMS Microbiol. Lett. 2005, 243:505-511) ;Wang 等對 Tri 13 基因 序列進行比對，設(shè)計了特異性引物，可以同時區(qū)分合成NIV、3AD0N和15AD0N的菌株（Wang et al. Development of a Generic PCR Detection of 3-Acetyldeoxynivalenol-, 15-Ace tyldeoxynivalenol-and Nivalenol-Chemotypes of Fusarium graminearum Clade. Int. J. Mol. Sci. 2008, 9:2495-2504)，但是最新的研究表明該對引物同樣出現(xiàn)了檢測結(jié)果不吻 合的問題（Wang et al. A multiplex PCR assay for genetic chemotyping of toxigenic Fusarium graminearum and wheat grains for 3-acetyldeoxynivalenoI, 15-acetyldeox ynivalenol and nivalenol mycotoxin. J. Food Agric. Environ. 2012, 10:505-511);由于 以上的一些缺陷，制約了這些方法在糧食和食品安全中毒素的實際應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述問題，提供一組鐮刀菌單端孢霉烯族B類毒素 PCR檢測引物，該組引物能 夠通過一次PCR反應(yīng)，同時檢測三種單端孢霉烯族族B類毒素的類型，本發(fā)明是這樣實現(xiàn) 的：
[0007] 一組鐮刀菌單端孢霉烯族B類毒素 PCR檢測引物，包括如SEQ ID N0.1所示的共 用上游引物F，如SEQ ID NO. 2所示的3-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮l JaSEQ ID NO. 3所示的15-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮2,如SEQ ID NO. 4所示的雪腐 鐮刀菌烯醇下游引物R3。
[0008] 本發(fā)明中所述鐮刀菌單端孢霉烯族B類毒素 PCR檢測引物在PCR檢測3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇以及雪腐鐮刀菌烯醇中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所述的應(yīng)用中，所述PCR檢測是指：以被檢測材料DNA為模板，進行PCR反 應(yīng)，對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳，電泳產(chǎn)物中若出現(xiàn)376bp特異性條帶，則檢測材料中含 有3-乙?；撗跹└牭毒┐?；若電泳產(chǎn)物中出現(xiàn)443bp特異性條帶，則檢測材料中含 有15-乙?；撗跹└牭毒┐?；若電泳產(chǎn)物中出現(xiàn)246bp特異性條帶，則檢測材料中含 有雪腐鐮刀菌烯醇。
[0010] 本發(fā)明所述應(yīng)用中，PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為：50ng模板DNA，2. 5yL 10XPCR Buffer緩沖液，I. 25mM的dNTPs 1 μ L，Taq DNA聚合酶0.3 μ L，10 μ M的共用上游引物F 0.6 μ L，10 μΜ的3-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮UlOyM的15-乙?；撗跹?腐鐮刀菌烯醇下游引物R2、10 μ M的雪腐鐮刀菌烯醇下游引物R3各0. 2 μ L，CldH2O補足至 20 μ L ;PCR 反應(yīng)條件：94°C 5min ;94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C 10min。
[0011] 本發(fā)明利用NCBI中已經(jīng)公布的禾谷鐮刀菌毒素合成基因 Tri5序列設(shè)計特異性引 物，進行PCR檢測，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物中是否含有376bp、443bp、246bp的特異性條帶，來判斷檢 測材料中對否含有3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3AD0N)、15-乙?；撗跹└牭毒?醇（15AD0N)和雪腐鐮刀菌烯醇（NIV)，本發(fā)明通過一次PCR電泳反應(yīng)，即可直接檢測鐮刀菌 單端孢霉烯族B類毒素的類型，成本低，操作簡單，耗時短（約I. 5h)，檢測結(jié)果準確，易于大 規(guī)模推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0012] 圖1為鐮刀菌菌株的PCR-電泳檢測結(jié)果；
[0013] 圖2為小麥和玉米籽粒的PCR-電泳檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0014] 實施例中涉及的引物序列：
[0015] 共用上游引物 F :TGCATGGCGGATCTATCTATTCACT ;
[0016] 3-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮l :ATGACCCAAGCCATTCATGCGT ;
[0017] 15-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮2 :
[0018] GACGTGATTTCAAGGAAATGCTTC ；
[0019] 雪腐鐮刀菌烯醇下游引物R3 :CAGGTAAATAATACAATCGG ;
[0020] 實施例所設(shè)計的培養(yǎng)基/試劑：
[0021] PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水定容至IOOOml ;實 施例涉及的提取液中含有：100mm〇l · PTris-HCKpH 8.0)，20mmol · LlDTAbH 8.0)， I. 5mol · T1NaCl,以及占提取液質(zhì)量2%的CTAB。
[0022] 實施例1鐮刀菌菌株檢測
[0023] 本實例所用的鐮刀菌菌株在中國不同該地區(qū)采集，其產(chǎn)毒素類型經(jīng)LC/MS確定 (表 1)。
[0024]
【主權(quán)項】
1. 一組鐮刀菌單端孢霉烯族B類毒素 PCR檢測引物，包括如SEQ ID NO. 1所示的共用 上游引物F，如SEQ ID NO. 2所示的3-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮l，如SEQ ID NO. 3所示的15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇下游引物R2,如SEQ ID NO. 4所示的雪腐鐮刀 菌烯醇下游引物R3。
2. 如權(quán)利要求1所述鐮刀菌單端孢霉烯族B類毒素PCR檢測引物在PCR檢測3-乙酰 基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇以及雪腐鐮刀菌烯醇中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述PCR檢測是指：以被檢測材料DNA為 模板，進行PCR反應(yīng)，對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳，電泳產(chǎn)物中若出現(xiàn)376bp特異性條帶， 則檢測材料中含有3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；若電泳產(chǎn)物中出現(xiàn)443bp特異性條帶， 則檢測材料中含有15-乙?；撗跹└牭毒┐?；若電泳產(chǎn)物中出現(xiàn)246bp特異性條帶， 則檢測材料中含有雪腐鐮刀菌烯醇。
4. 根據(jù)權(quán)要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為：50ng模板DNA， 2.5yL IOXPCR Buffer 緩沖液，1.25mM 的 dNTPs IyL，Taq DNA 聚合酶 0.3yL，10μΜ 的共用上游引物F 0. 6 μ L，10 μΜ的3-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮l、10 μΜ的 15-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮2、10 μM的雪腐鐮刀菌烯醇下游引物R3各 0· 2 μ L，CldH2O 補足至 20 μ L ; PCR 反應(yīng)條件：94°C 5min; 94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C lOmin。
【專利摘要】本發(fā)明公開一組鐮刀菌單端孢霉烯族B類毒素PCR檢測引物，包括如SEQ？ID？NO.1所示的共用上游引物F，如SEQ？ID？NO.2所示的3-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮1，如SEQ？ID？NO.3所示的15-乙?；撗跹└牭毒┐枷掠我颮2，如SEQ？ID？NO.4所示的雪腐鐮刀菌烯醇下游引物R3，該組引物可應(yīng)用于PCR直接檢測3-乙?；撗跹└牭毒┐肌?5-乙?；撗跹└牭毒┐家约把└牭毒┐迹杀镜?，操作簡單，耗時短，檢測結(jié)果準確，易于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104561307
【申請?zhí)枴緾N201510001950
【發(fā)明人】仇劍波, 董飛, 徐劍宏, 史建榮
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月5日